La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

L’objectif global de cette préparation de diffusion de la chromatine est de visualiser chronologiquement les modèles de localisation dynamiques des protéines liées à la chromatine et la morphologie chromosomique des ovocytes tout au long de l’ovogenèse des mammifères. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie reproductive féminine, telles que l’appariement des chromosomes homologues, la synapse, la réparation de l’ADN et la ségrégation des chromosomes méiotiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un immunomarquage clair et une visualisation des protéines associées aux chromosomes et une évaluation de la ploïdie des ovocytes.

L’ovogenèse est sujette aux erreurs et la mauvaise ségrégation des chromosomes entraîne souvent une maladie génétique. Cette méthode peut être utilisée pour améliorer notre compréhension des causes maternelles de l’aneuploïdie et de l’infertilité. Après avoir euthanasié une souris femelle 14 à 19 jours après le coït, faites une ouverture en forme de V dans la cavité abdomino-pelvienne.

Retirez ensuite la corne utérine maternelle. Ensuite, séparez les embryons du placenta et sacrifiez les embryons par décapitation. Transférez-les ensuite dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de PBS à 37 degrés Celsius.

Ensuite, déplacez un chiot dans un plat séparé également chargé de PBS chaud. Après avoir euthanasié le fœtus, faites une incision le long de la ligne médiane ventrale de la moitié postérieure, le long de la moitié antérieure sous les membres antérieurs et directement au-dessus des membres postérieurs et de la queue. Ensuite, ouvrez l’abdomen de l’embryon à l’aide de ciseaux de 3,5 pouces.

À l’aide d’une pince à pointe fine, déplacez ou retirez le foie et les boucles de l’intestin, exposant les gonades. Déterminez maintenant si les gonades sont des gonades mâles ou femelles. Les ovaires sont situés immédiatement en dessous et derrière le rein, vers la paroi postérieure de la cavité péritonéale.

Retirez les deux ovaires à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine et transférez-les dans un petit récipient contenant du PBS maintenu à 37 degrés Celsius. Procédez rapidement au prélèvement des ovaires de tous les fœtus. Ensuite, dans un nouveau petit récipient, plongez complètement chaque ensemble d’ovaires dans un demi-millilitre de tampon d’hypo-extraction fraîchement préparé.

Laissez-les incuber à 25 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes, mais pas plus de 30 minutes. Pendant l’incubation, utilisez un stylo PAP à barrière hydrophobe pour dessiner deux carrés de 22 x 22 millimètres sur une lame de verre propre. Préparez une lame pour chaque ensemble d’ovaires.

Lorsque l’incubation est terminée, ajoutez une goutte de 50 microlitres de saccharose de 100 millimolaires à une lame propre et transférez une paire d’ovaires dans la goutte. Utilisez maintenant deux aiguilles de calibre 27 pour taquiner les ovaires et libérer les cellules qu’ils contiennent. À l’aide d’une pince, retirez et jetez les gros morceaux d’ovaire.

Ensuite, pipetez soigneusement la solution de saccharose pour disperser les cellules libérées. Ensuite, chargez chaque carré sur une lame avec 40 microlitres de 1 % de PFA avec 0,2 % de Triton X-100. Étalez la solution autour du carré à l’aide d’une pointe de pipette ou en balançant la lame d’avant en arrière.

Ensuite, pour chaque pool de solution de saccharose avec des cellules, chargez deux flaques de fixateur avec 20 microlitres de cellules en suspension afin que chaque lame contienne des cellules d’un ensemble d’ovaires. Pour les prélèvements d’ovocytes MI ou MII, préparez et euthanasiez d’abord la souris donneuse. Ensuite, faites une grande ouverture en forme de V dans la cavité abdomino-pelvienne et utilisez des pinces pour déplacer les intestins afin de localiser chaque corne utérine.

Trouvez les ovaires à proximité de la cage thoracique. Tenez l’oviducte avec une pince fine et coupez la graisse au-dessus de l’ovaire à l’aide de ciseaux de dissection. Tout en tenant toujours l’oviducte, utilisez des pinces fines pour libérer l’ovaire de la bourse et transférez les ovaires dans un plat de collecte contenant un milieu maintenu à 37 degrés Celsius.

Pour prélever les ovocytes au stade GV, utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 27 pour libérer les complexes cumulus-ovocytes en perforant manuellement les gros follicules antraux. Pour prélever les ovocytes du stade MII, faites un trou dans l’ampoule de l’oviducte pour les libérer plutôt que de simplement faire une ponction. Prélevez maintenant les ovocytes à l’aide d’une pipette en verre à commande buccale ou d’un capillaire, ou à l’aide d’une seringue micrométrique manuelle.

Certains ovocytes peuvent être entourés de cumulus, d’autres non. Pour les ovocytes IM, préparez de l’hyaluronidase fraîche dans MEM-alpha/BSA pour dénuder les ovocytes des cellules du cumulus environnant. Pour chaque prélèvement d’ovocytes, traitez-les dans un incubateur avec 2,5 millilitres d’hyaluronidase préparée pendant trois minutes.

Transférez ensuite les ovocytes MI dans un milieu chaud MEM-alpha/BSA fraîchement préparé. Là, utilisez une pipette en verre à bouche pour fournir la force de cisaillement nécessaire pour détacher complètement les cellules du cumulus. D’une manière générale, la réussite de cette procédure passe par la maîtrise du prélèvement et de la manipulation des ovocytes à l’aide de pipettes ou de capillaires en verre opérés à la bouche.

Laissez les ovocytes se rétablir dans l’incubateur. Pendant ce temps, dans une plaque de verre chauffée à neuf puits, chargez 300 microlitres de solution chaude de Tyrode. Chargez deux puits avec 300 microlitres de MEM-alpha/BSA chaud, et chargez un puits avec 300 microlitres de milieu chaud de Waymouth.

Pour enlever la zone pellucide, transférez cinq à 10 ovocytes de stade MI ou MII dans le bain de la solution de Tyrode pendant seulement 30 à 45 secondes tout en les observant sous un microscope de dissection. Lorsque la zone pellucide est visiblement dissoute, transférez immédiatement les ovocytes dans le milieu à l’aide d’une pipette pré-humidifiée avec un milieu MEM-alpha/BSA. Transférez ensuite les ovocytes dans un deuxième bain de milieu réchauffé.

Après le deuxième bain, transférez les ovocytes dans le milieu chaud de Waymouth et laissez-les récupérer dans un incubateur pendant 30 minutes. Pour vous préparer à une propagation de la chromatine, utilisez un stylo PAP pour dessiner un rectangle de 11 x 44 millimètres sur une lame de verre. Ensuite, enduisez la lame d’une fine couche de 1 % de PFA avec 0,2 % de Triton X-100 dans de l’eau, puis balancez la lame d’avant en arrière pour étaler la solution.

Appuyez ensuite sur la diapositive pour retirer l’excédent. Maintenant, siphonnez entre cinq et 10 ovocytes avec une quantité minimale de milieu. Transférez ensuite les ovocytes sur la lame préparée en faisant glisser simultanément une pointe de pipette à travers la solution fixatrice et en déposant les ovocytes sur la lame à partir d’environ un centimètre au-dessus.

Les ovocytes doivent éclater immédiatement, en répandant la chromatine sur la lame. Maintenant, incubez les lames à température ambiante dans une chambre humidifiée fermée. Laissez-les se déposer pendant la nuit pour que la chromatine adhère à la lame.

La collection embryonnaire de chromatine décrite a été utilisée pour analyser quantitativement la formation de croisements dans les ovocytes prélevés sur des embryons noirs C57/6J. Les préparations de propagation de la chromatine de prophase ont été immunomarquées pour détecter SYCP3, SYCP1 et MLH1, et colorées avec du DAPI. Les chromosomes du stade pachytène avaient 27 foyers MLH1 répartis le long de 20 structures SC entièrement assemblées.

Lorsque la préparation de propagation n’était pas optimale et que les chromosomes individuels étaient indiscernables, la préparation n’a pas été incluse dans l’évaluation. Dans les bonnes préparations, SMC6 a été enrichi dans la région de l’hétérochromatine péricentromérique et le long des bras chromosomiques, et les foyers MLH1 se sont répartis le long du SC au stade pachytène. Le nombre de croisements MLH1-positifs provenant de 15 bonnes préparations de type sauvage était d’environ 24.

La méthode de prélèvement d’ovocytes a été utilisée pour évaluer la morphologie de la chromatine dans les ovocytes après la reprise méiotique. La localisation des protéines, ainsi que la ploïdie, ont été facilement évaluées, exposant les causes potentielles des erreurs de ségrégation chromosomique. La topoisomérase II-alpha pouvait être observée le long des bras chromosomiques et de l’hétérochromatine péricentromérique.

Dans les ovocytes MII, les chromatides sœurs appariées pouvaient être distinguées par la morphologie des chromosomes et des centromères. Une fois maîtrisées, ces techniques sans ou après culture peuvent être complétées en une ou deux heures par souris. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes complémentaires, telles que l’immunomarquage des ovocytes à cellules entières et l’imagerie de cellules vivantes, peuvent être effectuées pour évaluer les chromosomes homologues et les chromatides sœurs dans le contexte de la cellule.

Collectivement, les méthodes de propagation de la chromatine décrites ici peuvent être facilement appliquées pour évaluer l’ovogenèse des mammifères et les caractéristiques sexuellement dimorphes de la dynamique des chromosomes et des protéines au cours de la méiose.