Name: La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Découvrez la préparation d'étalements de chromatine pour l'analyse de l'oogenèse chez la souris. Cette méthode permet de visualiser les protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes, aidant à comprendre les causes maternelles d'anéuploïdie et d'infertilité.

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Ce travail a été soutenu par NIGM (R01GM11755) à P.W.J et une bourse de subvention de formation de l’Institut National de Cancer (NIH) (CA009110) à G.H. et J.H.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Johns Hopkins. Des expériences ont été effectuées sur des souris C57BL/6J de type sauvage.
1. récolte des ovaires foetales ou néonatales et préparation de la Prophase chromatine se propage
<ol><li>Pour extraire les embryons à 14,5 – 19,5 jours post-coitum (dpc) sacrifier les femelles enceintes par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC. Remarque : Pour les ovaires de 1 à 5 jours après la naissance, passez à l’étape 1.3. La figure 1 résume les étapes de la prophase méiotique enrichis à différents âges embryonnaires et postnatals.</li>
	<li>Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faire une ouverture en forme de V. Disséquer sur la corne utérine maternelle, séparer les embryons de placenta et transfert des embryons dans 35 mm plats de Pétri contenant 3 mL de préchauffé 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) à 37 ° C. Remarque : Un incubateur fliptop fixé à 37 ° C peut être utilisé pour maintenir la température. En outre, un verre translucide de température régulée peut également servir pour maintenir la température au cours de la manipulation de l’ovaire.</li>
	<li>Avec des ciseaux chirurgicaux de 3,5 pouces, sacrifier des embryons ou des chiots par l’intermédiaire de décapitation selon les lignes directrices IACUC. Placer les embryons décapités ou petits dans du PBS préchauffé avant dissection plue.</li>
	<li>Disséquer un embryon ou un chiot à un moment dans un séparé 35 mm boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS préchauffé à 37 ° C. Aller de l’avant en coupant le long de la ligne ventrale médiane de la moitié postérieure de l’embryon, le long de la moitié antérieure sous les pattes avant et directement au-dessus des membres postérieurs et queue comme indiqué dans la Figure 2 a–B.</li>
	<li>Ouvrir l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux de 3,5 pouces. À l’aide de pinces à pointe fine de déplacer ou de supprimer le foie et les anses de l’intestin, exposant ainsi les ovaires dans un nouveau 35 mm boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS préchauffé à 37 ° C (voir le guide Figure2 b). Les ovaires sont situés immédiatement en dessous et derrière le rein vers la paroi postérieure de la cavité péritonéale (Figure 2 b–C). Un guide pour différencier les gonades mâles et femelles est fourni à la Figure 2D. Remarque : Pour des conditions optimales, rapidement disséquer des ovaires après que femelle gravide est sacrifiée.</li>
	<li>Retirer les deux ovaires de chaque fœtus féminins à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine sous une étendue de la dissection et l’endroit dans un verres de montre ou puits séparés d’un puits multiples plaque contenant 0,5 à 1,0 mL de PBS préchauffé et maintiennent à 37 ° C.</li>
	<li>Placer chaque paire d’ovaires dans 0,5 mL de tampon hypo-extraction (17 mM citrate trisodique dihydraté, saccharose 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inhibiteur de la protéase, pH 8,2) dans un verre de montre propre ou un petit puits d’une plaque de 9 puits, en veillant à immerger la maquette des ovaires complè. Incuber pendant au moins 15 minutes, mais pas plus de 30 min. Remarque : Faire tampon hypo-extraction douce et utiliser moins de 2 h d’addition de TNT.</li>
	<li>Durant l’incubation, à l’aide d’un stylo PAP barrière hydrophobe, dessinez deux carrés de2 22 x 22 mm sur un verre propre 25 x 75 mm2, lame de microscope une épaisseur de 1 mm comme illustré à la Figure 3 a. NOTE : Diapositives peuvent être préparés en avance.</li>
	<li>Distribuer 45 – 50 µL de saccharose de 100 mM sur une lame propre et transférer une paire d’ovaires à la baisse.</li>
	<li>En utilisant les extrémités pointues des deux aiguilles 27 G, taquiner les ovaires part pour libérer les cellules dans la solution de saccharose. Avec une pince, enlevez les gros morceaux de l’ovaire et soigneusement Pipeter une solution de saccharose pour disperser les cellules.</li>
	<li>Place 40 µL de solution de fixation (paraformaldéhyde à 1 % (PFA), 0,2 % de détergent (voir Table des matières), pH 9,2) dans chaque carré de la diapositive préparée. Avec une pointe de pipette 200 µl, étendre la solution fixateur uniformément sur la surface de glissement.</li>
	<li>Pipeter 20 µL du mélange sur chaque carré de la diapositive contenant le fixateur saccharose. Remarque : Cela équivaut à utiliser une paire d’ovaires par lame.</li>
	<li>Incuber les lames dans une chambre humide fermée du jour au lendemain à la température ambiante. Remarque : L’incubation pendant la nuit peut varier autour (12-15 h) à la température ambiante.</li>
	<li>Ouvrez le couvercle de la chambre et laisser les lames sécher complètement à l’air.</li>
	<li>Les lames dans une coloration contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,4 % (voir la Table des matières) pendant 2 min, sécher à l’air et procéder au protocole d’immunomarquage (étape 6). Remarque : Il peut être possible de stocker les lames à-80 ° C pour une utilisation ultérieure, mais cela varie en fonction de la protéine d’intérêt. Pour des résultats optimaux, procéder immédiatement au protocole immunomarquage (étape 6).</li>
</ol>2. métaphase Je collecte des ovocytes
<ol><li>Afin de maximiser le nombre de follicules antraux isolée de chaque souris, injecter par voie intrapéritonéale des souris femelles sexuellement matures vierges 5 UI de la gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG, également connu sous le nom équine gonadotrophine chorionique (eCG)). Remarque : Pour un rendement optimal d’ovocytes, souris doivent être 1 à 3 mois d’âge, puisque le nombre d’ovocytes récoltés diminuerait avec l’âge. Pour préparer la PMSG, dissoudre la bouteille de 5 000 UI dans 100 mL du PBS stérile (5 mL de U/0.1) grand magasin à usage unique aliquotes de 600 µL à-20 ° C.</li>
	<li>Après 44 – 48 h, préparer, média de collecte minimale indispensable moyen alpha (MEMα) additionné à 5 % sérum fœtal (SVF) et 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA ; MEMΑ/BSA/FBS). Stériliser les médias à travers un filtre de pores de 0,2 µm. Décanter 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS moyen dans un plat en verre par souris et chaud à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %. Remarque : Autres collection et milieux de culture qui sont commercialement disponibles (M2 et M16) sont aussi couramment utilisés. ATTENTION : Nous vous conseillons d’enlever Pétri de l’incubateur de2 CO 5 % un à la fois pour une durée limitée afin de minimiser l’exposition à l’air ambiant pendant les étapes de manipulation.</li>
	<li>Sacrifier les souris par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.</li>
	<li>Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faisant une large ouverture en forme de V. À l’aide de pinces, supplanter les intestins vers la tête de la souris. Localisez chaque corne utérine ; les ovaires sont présenter proximale à la cage thoracique. Maintenez l’oviducte avec une pince fine et couper la matière grasse supérieure à l’ovaire à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 4). Continuez à tenir l’oviducte et une autre série de fines pinces libèrent l’ovaire de la bourse et la place dans plat de collection contenant le support MEMα/BSA/FBS. Remarque : Comme à l’étape 1, il est impératif de maintenir les ovaires à 37 ° C et maintenir à 5 % de CO2. Un incubateur de fliptop relié à 5 % CO2 mélange peut être utilisé pour permettre un entretien optimal de la température et les niveaux de CO2 . En outre, un stade de verre température réglementée devrait aussi servir pour maintenir la température au cours de la manipulation des ovocytes.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 27 (ou de taille similaire), libérer des complexes ovocytes cumulus manuellement perforera les gros follicules antrums.</li>
	<li>Tout en observant à travers un microscope à dissection, recueillir les ovocytes GV-mise en scène en utilisant une pipette de verre bouche-exploité ou capillaire ou une main micromètre-seringue (Figure 5). Ne recueillir que les ovocytes qui sont libérés des follicules antrums. Les ovocytes GV ont un diamètre d’environ 90 µm. les ovocytes GV peut être entourés par 2 ou 3 couches de cellules de la granulosa et ont un diamètre total de près de 200 µm.</li>
	<li>Culture des ovocytes dans un verre de montre propre ou une plaque de 9 puits contenant le support MEMα/BSA/FBS pendant 6 h atteindre la métaphase I, à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.</li>
	<li>Passez à l’étape 4.</li>
</ol>3. métaphase II (MII) ovocyte Collection
<ol><li>Afin de maximiser les ovocytes prélevés chaque souris, injecter par voie intrapéritonéale des souris femelles sexuellement matures vierges 5 UI de PMSG. Après 44 – 48 h, injecter par voie intrapéritonéale avec 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG). Remarque : Pour un rendement optimal d’ovocytes, souris doivent être 1 à 3 mois d’âge, puisque le nombre d’ovocytes récoltés diminuerait avec l’âge. Pour préparer le hCG, dissoudre une bouteille de 10 000 U dans 200 mL de PBS (5 mL de U/0.1). Enregistrez dans parties aliquotes à usage unique de 600 µL à-20 ° C.</li>
	<li>Après 12 à 14 heures, préparer le milieu MEMα/BSA/FBS de collection, comme indiqué au point 2.2, ci-dessus.</li>
	<li>Sacrifier les souris par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.</li>
	<li>Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faisant une large ouverture en forme de V. À l’aide de pinces, supplanter les intestins vers la tête de la souris. Localisez chaque corne utérine, les ovaires sont présents proximale à la cage thoracique. Maintenez l’oviducte avec une pince fine et couper la matière grasse supérieure à l’ovaire à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 4). Puis enlever l’ovaire et l’oviducte et le placer dans le plat de collection contenant le support MEMα/BSA/FBS. NOTE : Tout comme aux étapes 1 et 2, il est impératif de maintenir les ovaires à 37 ° C et maintenir à 5 % de CO2. Un incubateur de fliptop relié à 5 % CO2 mélange peut être utilisé pour permettre un entretien optimal de la température et les niveaux de CO2 . En outre, un stade de verre température réglementée devrait aussi servir pour maintenir la température au cours de la manipulation des ovocytes.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 1 mL avec un 27 G (ou taille similaire) ou dièse forceps, une brèche dans l’ampoule de l’oviducte de libérer les ovocytes MII. NOTE : Veillez à ne pas endommager les ovocytes dans l’ampoule. L’ampoule apparaît enflée et translucides tels que les ovocytes sont visibles (Figure 4).</li>
	<li>Récolte des ovocytes MII de l’ampoule de l’oviducte dans une autre boite avec support de collection utilisant une pipette de verre bouche-exploité ou capillaire ou une main micromètre-seringue (Figure 5).</li>
	<li>Passez à l’étape 4.</li>
</ol>4. ovocyte dépouillant et le retrait de la zone pellucide
<ol><li>Préparer 300 UI/mL d’hyaluronidase dans additionné MEMα à 3 mg/mL de BSA à DDE ovocytes de qui entoure les cellules du cumulus (2,5 mL/souris) dans un verre de montre et garder à 37 ° C, 5 % de CO2. Remarque : L’efficacité Hyaluronidase diminue brusquement après 1 h de préparation. Pour les ovocytes MII, traitement de l’hyaluronidase n’est pas exigé.</li>
	<li>Exposer des complexes de cellules de cumulus-ovocytes à 300 UI/mL d’hyaluronidase dans MEMα/BSA pendant 3 min à la DDE des ovocytes de qui entoure les cellules du cumulus. ATTENTION : Ne dépassez pas 3 min exposition à hyaluronidase, car il endommagerait les ovocytes.</li>
	<li>Pour laver les ovocytes, transférez les ovocytes dans un plat de moyen MEMα/BSA chauffé fraîche. À l’aide d’une pipette en verre de commande bouche petite ou capillaire (légèrement plus grand que le diamètre de l’ovocyte, qui est environ 90 µm), déposer les complexes vers le haut et vers le bas pour détacher complètement les cellules du cumulus. Laissez les ovocytes à récupérer dans l’incubateur tout en préparant l’étape suivante.</li>
	<li>Solution acide Tyrode chaud, MEMα/BSA et médias de Waymouth à 37 ° C (500 µL/souris). Place 300 µL à chaque puits de plaques de verre de 9 puits petites.</li>
	<li>Pour supprimer la zone pellucide (ZP) transférer 5 à 10 ovocytes dans une solution de Tyrode. Exposer les ovocytes pour seulement 30-45 s à la solution. NOTE : Trop peu d’exposition à la solution ne supprime pas la ZP complètement, les ovocytes qui empêchera l’éclatement et de chromosomes de se propager. Une exposition excessive endommagerait et tuer l’ovocyte. Je regarde la dissolution du ZP sous le microscope à dissection peut aider dans l’optimisation du temps d’exposition. ATTENTION : À l’aide d’une solution de Tyrode frais est essentiel, que sa fonction diminue avec l’âge. Utiliser un puits frais de solution Tyrode pour chaque groupe d’ovocytes traitée pour assurer une digestion uniforme de la ZP.</li>
	<li>Immédiatement après le retrait de la ZP, laver les ovocytes en transférant dans un milieu MEMα/BSA/FBS chauffé. Répétez cette étape de lavage. Remarque : Soyez prudent lors du transfert, comme les ovocytes seront collent facilement et à la pipette en verre ou capillaire après le retrait de la ZP. Prémouillage la pipette en verre ou capillaire dans un milieu de Waymouth minimisera les ovocytes collées entre elles.</li>
	<li>Transfert et laisser les ovocytes à récupérer pendant 30 minutes dans un milieu de Waymouth à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.</li>
	<li>Passez à l’étape 5.</li>
</ol>5. MI et MII ovocyte chromatine tartinades
<ol><li>À l’aide d’un stylo PAP, dessinez un rectangle de2 de 11 x 44 mm sur la lame de verre comme sur la Figure 6 a.</li>
	<li>Recouvrir la lame avec une fine couche de fixateur (paraformaldéhyde à 1 %, 0,2 % Triton X 100 H2O, pH 9,2) par la pipette 100 µL de fixateur sur le toboggan et bascule la culasse en arrière. Cliquez sur la diapositive pour se débarrasser de l’excès fixateur.</li>
	<li>Faites glisser l’aiguille en ligne sur la diapositive de fixateur-enduit tout en déposant les ovocytes de 1 cm au-dessus de la lame dans la solution de fixation et relever entre 5 à 10 ovocytes avec une aiguille de pipette petite bouche avec comme support de peu que possible. Effectuez cette étape à l’aide d’un microscope à dissection pour s’assurer que les ovocytes ont été déposés et qu’ils ont fait irruption. Remarque : Les ovocytes éclatera immédiatement sur la diapositive. La hauteur à laquelle les ovocytes sont déposés incidence du degré de diffusion de chromatine. Voir résultats représentatifs dans la Figure 6 pour plus de détails.</li>
	<li>Incuber les lames dans une chambre humidifiée fermée pendant la nuit pour permettre à la chromatine d’adhérer à température ambiante.</li>
	<li>Laisser les lames à sécher complètement et rincer les lames dans une coloration contenant 50 mL de 0,4 % agent mouillant-H2O, pH 8,0.</li>
	<li>Passez à l’étape 6.</li>
</ol>6. immunomarquage
<ol><li>Préparer le tampon de dilution d’anticorps (ADB) décrit dans le tableau 1.</li>
	<li>Préparer deux Jarres Coplin contenant 50 mL de solution tampon (WB) de lavage (10 % ADB dilué dans du PBS) et une coloration contenant 50 mL de solution détergente WB et 0,05 % (par exemple, ajouter 250 µL de 10 % de détergent dans 50 mL WB).</li>
	<li>Laver les diapositives qui ont été établis à l’article 1 et 5 du présent Protocole pendant 10 min dans une coloration contenant 50 mL de WB. ATTENTION : Ne laissez pas les diapositives sécher à tout moment au cours de l’immunomarquage.</li>
	<li>Laver les lames pendant 10 min dans le Coplin jar contenant 50 mL WB et 0,05 % solution détergente. Ensuite, laver les lames dans le restant de Coplin contenant 50 mL de solution de WB pendant 10 min.</li>
	<li>Robinet hors diapositive excès de liquide et le couvercle avec 100 µL de certains anticorps primaires dilué dans ADB. Incuber à 4 ° C durant la nuit dans une chambre humide fermée. Remarque : L’Incubation peut être abrégée en 2 à 3 heures à 37 ° C. Utiliser les petites quantités d’anticorps (par exemple, 50 µL) en couvrant la lame avec une lamelle ou parafilm.</li>
	<li>Rincer les lames dans une coloration contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,2 %, pH 8,0.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.2 et 6.5.</li>
	<li>Robinet hors diapositive excès de liquide et le couvercle avec 100 µL de certains Anticorps secondaires dilué dans ADB. Incuber les lames 1 à 2 heures à 37 ° C dans une chambre humide fermée.</li>
	<li>Les lames 2 fois pendant 10 min dans des Jarres Coplin contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,2 %, pH 8,0.</li>
	<li>Les lames 2 fois pendant 5 min dans des Jarres Coplin contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-H2O de 0,2 %, pH 8,0.</li>
</ol>7. montage diapositives
<ol><li>Pour les tartinades de chromatine prophase préparés à l’étape 2, ajouter 100 µL de milieu de montage contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Pour MI et MII la chromatine propage préparés en étape 5, ajouter 50 µL de milieu de montage contenant DAPI (1.5µg / mL). Éponger doucement le liquide en excès à l’extérieur.</li>
	<li>Placez une lamelle de 22 mm x 60 mm sur le dessus et sceller avec du vernis à ongles transparent. Conserver dans une boîte de glissière à 4 ° C ou -20 ° C jusqu'à l’évaluation par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence. NOTE : Touchez légèrement sur la lamelle couvre-objet pour débarrasser du milieu de montage excédentaire avant scellement avec vernis à ongles.</li>
</ol>

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<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+human+aneuploidy%3A+where+we+have+been%2C+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).</li>
<li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+In+vivo+and+In+vitro%3A+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li>
<li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Préparations de propagation de la chromatine permettent aux chercheurs d’étudier par ordre chronologique la méiose mammifère femelle et la localisation dynamique des protéines impliquées. Les spreads de chromatine embryonnaires et néonatales permettent une analyse attentive des événements tout au long de la prophase méiotique. Métaphase I et métaphase II la chromatine se propage peut servir à distinguer l’unique sœur chromatides de jumelé de sœurs et paires de chromosomes homologues, ainsi qu’évaluer la ploïdie. Par comp...

Au cours de la spermatogenèse, grosses vagues semi-synchrone des cellules germinales méiotiques sont rapidement et continuellement réapprovisionnés dans les testicules au début de la puberté et tout au long de l’âge adulte1. Contrairement aux hommes, la méiose chez les femelles est initiée uniquement pendant le développement du foetus. Après la naissance, les ovocytes restent arrêtées dans un stade de dictyate prolongé de la prophase I avec une vésicule germinale intacte (GV ; enveloppe nucléaire) jusqu'à la puberté. Au début de la puberté, un sous-ensemble d’ovocytes sont cycliquement choisis pour subir la croissance et la maturation, marquant le début de reprise méiotique. Méiotique reprise dans les ovocytes adulte se manifeste par la disparition de la GV dans un processus appelé vésicule germinale ventilation (GVBD). L’ovocyte subit alors la condensation des chromosomes et ségrégation, suivi par extrusion de globule polaire. Les ovocytes deviennent arrêtés à progression au PPFI et sont stimulés pour compléter la deuxième et dernière division méiotique seulement après la fécondation.
La fertilité féminine est fortement tributaire de la réussite de la prophase méiotique j’ai progression. Clé c’est la formation d’une liaison physique entre les chromosomes homologues appelés les chiasmas, médiée par la réparation des induits ADN double brins (CDB) par l’intermédiaire de crossover recombinaison2. Ce processus se produit dans le cadre d’un échafaudage de riches en protéines dynamique appelé complexe synaptonémal (CS) qui se forme entre les chromosomes homologues afin de faciliter leur synapsis3. Le SC est une fermeture à glissière-comme structure tripartite qui se compose de deux éléments latéraux parallèles reliées par des protéines de la région du centre qui détient homologues ensemble tout au long de la réparation de l’ADN en cours. Avant synapsis, précurseurs des éléments latéraux, appelés éléments axiales, forment entre sœur chromatides. Complexe synaptonémal protéines telles que SYCP2 et SYCP3 forment des éléments axiaux qui sont colocalisées pour les axes de la cohésion des chromatides au cours du début de la prophase. Plus tard service accepteurs pour la protéine de filament transversal, SYCP1, ce qui facilite l’assemblage de l’élément central et synapsis entre homologues alignés4. Dans les ovocytes de souris, synapsis complet est indiqué par la présence de 20 complètement chevauchement des tronçons SYCP3 et SYCP1, qui peuvent être visualisées à l’aide de la chromatine propager des préparations. Synapsis est terminé dès l’entrée dans le sous-étage pachytène, par lequel des véhicules multisegments matures qui sont destinés à des chiasmas forme entre homologues sont décorées avec mutL dimères d’homologue (MLH1/3) pour promouvoir leur traitement exact5,6 , 7. l’entretien structurel des complexes de chromosomes (SMC), y compris cohesin, condensin et la SMC5/6 complexes, sont importants pour la régulation de la dynamique des chromosomes et la structure tout au long de la méiose8,9, 10,11,12. Collectivement, ces événements s’assurer bi-orientation correcte des chromosomes homologues à lutter contre les pôles du fuseau après démontage de la SC.
La méiose des cellules est un modèle puissant afin d’examiner les rôles de diverses protéines dans maintenance du génome en raison de l’induction programmée et la réparation ultérieure des ADN CDB. En outre, la méiose chez les mammifères est également un modèle pertinent pour l’étude des modifications épigénétiques et l’empreinte13. Toutefois, il est techniquement difficile d’évaluer ces événements au cours de la méiose femelle, qui se déroule dans les ovaires foetales et néonatales chez les mammifères (Figure 1). Je peux être divisé en 5 sous-stades la prophase : leptonema, du zygotène, pachytène, diplonema et dictyate. Ici, nous décrivons comment isoler et faire la distinction entre fœtales et néonatales des ovaires et des testicules (Figure 2). Adapté de méthodes précédemment décrites, ce manuscrit présente également un protocole (étape 1) avec la vidéo de démonstration pour la préparation de la prophase méiotique femelle je la chromatine propage14,15,16,17 . Lorsqu’il est couplé avec l’immunomarquage, tel que décrit dans les étapes 6 et 7, ce protocole permet une analyse microscopique détaillée de la prophase I événements dans les ovocytes.
L’ovogenèse est sujette aux erreurs et événements de missegregation de chromosomes au cours de la première division méiotique représentent la source la plus fréquente des maladies génétiques dans la descendance18,19. Dans ce manuscrit (étape 2 du protocole), les auteurs décrivent un protocole dans lequel des ovocytes matures étagée de GV sont extraites apprêtées ovaires de souris femelles adultes. Dans des conditions favorables, ovocytes adulte subissent une hormone lutéinisante indépendante reprise de la méiose suite d’isolement et la culture20. La reprise méiotique, ovocytes progressant grâce à la méiose I, puis arrêtent à la métaphase II. Ovocytes restent arrêtées lors de la métaphase II, sauf s’il est fécondé. Dans les étapes 2 à 5, nous adaptons protocoles rapportés antérieurement avec la vidéo de démonstration pour décrire comment collecter, culture et préparer la chromatine se propager préparations21ovocytes MI et MII. Cette chromatine diffusion technique permet clairement immunomarquage des protéines associées aux chromosomes. En outre, ce protocole permet également de distinguer les chromosomes bivalents et vaccin monovalents et peut encore résoudre seule sœur chromatides à faciliter l’appréciation de la ploïdie de l’ovocyte. Par conséquent, en plus de révéler des modèles de localisation des protéines méiotiques, ce protocole peut également servir un outil inestimable pour élucider les causes potentielles de missegregation de chromosomes au cours de la MI et MII.

<table><tbody><tr><td>10X Saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4</td><td>Qualité Biologique</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 60 mm x 15 mm</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 35 mm x 12 mm</td><td>Denville</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de micro-dissection</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Dissectionnement&nbsp ; ciseaux, pointe pointue, 41/2"</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Montre en verre carré 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>Autoclave avant chaque utilisation</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Ajouter au tampon hypotonique immédiatement avant l’utilisation</td></tr><tr><td>50x Inhibiteur de protéase</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Ajouter au tampon hypotonique immédiatement avant utilisation</td></tr><tr><td>Seringue de turberculine avec aiguille (1cc, 27 G x 1/2 in)</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Lames en verre ultra givré Gold seal (25X75mm, 1mm d’épaisseur)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Stylo Super PAP, grand (bloqueur de liquide)</td><td>Microscopie électronique Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde aqueux</td><td>Microscopie électronique Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Détergent en manuscrit</td></tr><tr><td>Chambre d’humidité Immuno tache</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Bocaux Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Sciences de microscopie électronique (EMS)</td><td>74257</td><td>Agent mouillant dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>Stocker les aliquotes à -20C</td></tr><tr><td>Gonadotrophine chorionique humaine (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>Stocker les aliquotes à -20C</td></tr><tr><td>Plaques d’observation PYREX avec neuf cavités concaves</td><td></td> <td>Fisher13-748B</td><td>Autoclave avant chaque utilisation</td></tr><tr><td>Capillaire en verre</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Marque Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Tube en caoutchouc latex (3,2 mm de diamètre intérieur x 6,4 mm de diamètre extérieur)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Tube en caoutchouc latex (diamètre intérieur de 6,4 mm x diamètre extérieur de 11,1 mm)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Embout nasal en caoutchouc de silicone flexible, embout buccal en plastique dur et 15 pouces de tube en latex</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Tête micrométrique Mitutoyo</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Seringue 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0,45 &mu ; m filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre 5 3/4"</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>83 x 0,5 mm Pointe de pipette</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de prélèvement d’ovocytes</td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>le support</td><td>de Waymouth Life Technologies</td><td></td><td></td>11220035</tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>Pour milieu de culture ovocytaire</td></tr><tr><td>500ml unités filtrantes 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s solution</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>Stocker les aliquotes à -20C</td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>Pour tampon ADB/lavage</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>Pour tampon ADB/lavage</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Milieu de montage anti-décoloration avec DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture de microscope (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorps primaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>Facteur de dilution - 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>Facteur de dilution - 1:1000</td></tr><tr><td>Chèvre anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>Facteur de dilution - 1:50</td></tr><tr><td>Protéine anti-centromère humaine</td><td>Anticorps incorporés</td><td>15-235</td><td>Facteur de dilution - 1:100</td></tr><tr><td>Lapin anti- TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>Facteur de dilution - 1:100</td></tr><tr><td>Anti-histone H4 de souris (di méthyl K20, tri méthyle K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>Facteur de dilution - 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Rec8</td><td>Avec l’aimable autorisation de Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>Facteur de dilution - 1:10 000</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Anticorps secondaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugué</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>Facteur de dilution- 1:500</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202 Facteur de</td><td>dilution- 1:500</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugué Thermo-Fisher</td><td>Scientific</td><td>A-31573</td><td>Facteur de dilution- 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre (H+L) Conjugué Alexa Fluor 568</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>Facteur de dilution - 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-humaine de chèvre (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>Facteur de dilution - 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Conjugué Alexa Fluor 568</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Facteur de dilution - 1:500</td></tr></tbody></table>

la chromatine propager des préparations pour l’analyse de progression d’ovocyte de souris de la prophase à la métaphase ii

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Techniques d’étalement de la chromatine ont été largement utilisés pour évaluer la localisation dynamique de diverses protéines lors de la gamétogenèse, particulièrement pour la spermatogenèse. Ces techniques permettent pour la visualisation de protéines et de profils d’ADN localisation lors d’événements méiotiques comme les chromosomes homologues, appariement, Synapse et ADN de réparation. Tandis que quelques protocoles ont été décrits dans la littérature, les techniques d’étalement de chromatine générales à l’aide d’ovocytes chez les mammifères de la prophase sont limitées et difficiles en raison du calendrier de l’initiation de la méiose dans les ovaires foetaux. En comparaison, les spermatocytes de prophase peuvent être collectées de souris mâles juvéniles avec des rendements plus élevés sans nécessiter de microdissection. Toutefois, il est difficile d’obtenir une population pure synchronisée des cellules à des étapes spécifiques en raison de l’hétérogénéité des populations de cellules germinales méiotiques et après méiose dans les testicules juvéniles et adultes. Pour les étapes ultérieures de la méiose, il est avantageux d’évaluer en cours de la méiose I (MI) ou la méiose II (MII), parce que les groupes des ovocytes matures peuvent être prélevés dans des souris femelles adultes et stimulés pour reprendre la méiose dans la culture des ovocytes. Ici, méthodes pour les préparations de chromatine méiotique répartie à l’aide d’ovocytes disséqué de foetale, néonatale et ovaires adultes sont décrits avec des démonstrations vidéo d’accompagnement. Événements missegregation chromosomes dans des ovocytes de mammifères sont fréquentes, en particulier au cours de la MI. Ces techniques permettent d’évaluer et de caractériser les effets de mutations différentes ou des expositions environnementales au cours des différentes étapes de l’ovogenèse. Qu’il sont a des différences distinctes entre l’ovogenèse et la spermatogenèse, les techniques décrites dans sont inestimables pour accroître notre compréhension de l’ovogenèse chez les mammifères et les fonctionnalités présente un dimorphisme sexuel de la dynamique du chromosome et protéines au cours de la méiose .

Nous avons décrit les deux techniques de visualisation et d’évaluer les chromosomes méiotiques dans les ovocytes. La première technique est pris en compte pour évaluer la progression de la prophase dans les ovaires embryonnaires et néonatales. La prophase chromatine propagation préparations sont extrêmement précieuses pour la visualisation de nombreux processus dynamiques au cours de la méiose, y compris les appariements, Synapse et désynapsis, la recombinaison homologue et remodelage épi...

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

L’objectif global de cette préparation de diffusion de la chromatine est de visualiser chronologiquement les modèles de localisation dynamiques des protéines liées à la chromatine et la morphologie chromosomique des ovocytes tout au long de l’ovogenèse des mammifères. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie reproductive féminine, telles que l’appariement des chromosomes homologues, la synapse, la réparation de l’ADN et la ségrégation des chromosomes méiotiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un immunomarquage clair et une visualisation des protéines associées aux chromosomes et une évaluation de la ploïdie des ovocytes.L’ovogenèse est sujette aux erreurs et la mauvaise ségrégation des chromosomes entraîne souvent une maladie génétique. Cette méthode peut être utilisée pour améliorer notre compréhension des causes maternelles de l’aneuploïdie et de l’infertilité. Après avoir euthanasié une souris femelle 14 à 19 jours après le coït, faites une ouverture en forme de V dans la cavité abdomino-pelvienne.Retirez ensuite la corne utérine maternelle. Ensuite, séparez les embryons du placenta et sacrifiez les embr

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Génétique

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Nous présentons ici un protocole pour la caractérisation des ovocytes de souris antraux basés sur une organisation nucléolaire.

Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine

Nous présentons des protocoles pour la collecte, la préparation et l’imagerie d’ovocytes de drosophile matures. Ces méthodes permettent de visualiser le comportement des chromosomes ainsi que l’assemblage et la fonction du fuseau pendant la méiose.

Techniques for Imaging Prométaphase et Metaphase de méiose I fixe<em&gt; Drosophila</em&gt; ovocytes

Ce manuscrit décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes à cheval. Plus précisément, le présent travail illustre comment recueillir des ovocytes à cheval immatures et matures par captage d'ovules guidé par ultrasons (OPU) et comment étudier la ségrégation des chromosomes, la morphologie de la broche, l'acétylation des histones mondiales et l'expression de l'ARNm.

Analyse de la ségrégation chromosomique, de l&#39;acétone d&#39;histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes

La méiose est le processus de développement par lequel les gamètes sont constituées par une seule tournée de réplication de l’ADN et de deux cycles successifs de la ségrégation des chromosomes. La méiose chez les mammifères peut être examinée en utilisant une technique pour préparer les tartinades méiotique. Ici, nous démontrons une méthode de préparation des étalements de noyaux de spermatocytes de souris.

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Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

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L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

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Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter l’impact physique du cytosquelette sur la forme nucléaire et les organites internes sans membrane dans le système ovocytaire de la souris. Le cadre peut être adapté pour être utilisé dans d’autres types de cellules et contextes.

Capture de l’agitation basée sur le cytosquelette du noyau de l’ovocyte de souris à travers les échelles spatiales

Les erreurs méiotiques dans les synapses et la recombinaison sont courantes chez les ovocytes de mammifères. Une analyse rigoureuse des protéines impliquées dans ces processus est essentielle pour comprendre comment et pourquoi l’ovogenèse tourne souvent mal. Les techniques présentées ici permettent un suivi complet de la recombinaison et des synapses pour évaluer la qualité des ovocytes chez la souris.

Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison

Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.

Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Découvrez la préparation d'étalements de chromatine pour l'analyse de l'oogenèse chez la souris. Cette méthode permet de visualiser les protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes, aidant à comprendre les causes maternelles d'anéuploïdie et d'infertilité.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

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