Name: Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Découvrez l'électrophorèse bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse pour analyser le protéome des adénomes hypophysaires humains. Cette méthode permet d'identifier les protéines d'abondance faible avec une grande sensibilité.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 81572278 et 81272798 à XZ), les subventions de projet de Plan de la Chine « 863 » (Grant No. 2014AA020610-1 à XZ), les fonds de l’hôpital Xiangya pour Introduction de Talent (à XZ) et le Hunan La Fondation provinciale des sciences naturelles de Chine (subvention no 14JJ7008 à XZ). Les auteurs reconnaissent également la contribution scientifique du Dr Dominic M. Desiderio dans le Health Science Center de l’Université du Tennessee. X.Z. continuellement développé et utilisé méthodes 2DE-SM pour analyser proteome Adénome hypophysaire à partir de 2001, conçu le concept pour le présent manuscrit, a écrit et révisé le manuscrit, a coordonné les travaux pertinent et était responsable de la soutien financier et les travaux correspondant. Y.L. a participé à la révision du manuscrit. Y.H a participé à la collection de références et la révision du manuscrit. Tous les auteurs approuvés le manuscrit final.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.

2de, couplées avec les méthodes MS y compris 2DE-MS PMF et 2DE-MS/MS, a été utilisé avec succès dans notre programme à long terme - l’utilisation de la protéomique pour étudier les variations de protéomiques humaines NFPA et variations de réseau moléculaire pour l’élucidation des mécanismes moléculaires et découverte de biomarqueurs efficaces pour NFPAs. Protéomique comparative basée sur 2de avec bonne reproductibilité joue un rôle important dans l’identification des normes NFPA protéomiques variations9...

PA est une tumeur commune qui se produit dans l’hypophyse humaine dans les systèmes d’axe hypothalamus-pituitaire-ciblées orgue, qui jouent un rôle important dans le système endocrinien humain. PA comprend cliniquement fonctionnelles et non fonctionnelles PAs (FPA et NFPA)1,2. NFPA est difficile dans le diagnostic de stade précoce et le traitement en raison de niveaux d’hormones seulement légèrement élevé (p. ex., LH et FSH) dans le sang par rapport à la FPA, qui a considérablement augmenté les niveaux d’hormones correspondantes dans sang3,4 ,,5. La clarification des mécanismes moléculaires et la découverte de biomarqueurs efficaces a une importance clinique dans le diagnostic, traitement et pronostic de la NFPA. Notre objectif à long terme est de développer et utiliser des méthodes protéomiques pour étudier NFPA pour la découverte de biomarqueurs fiables pour clarifier ses mécanismes moléculaires et reconnaître des cibles thérapeutiques efficaces ainsi que des marqueurs diagnostiques et pronostiques. 2-DE couplée avec des méthodes de MS ont été largement utilisés dans notre programme de recherche à long terme au sujet humain PA proteome1,2,6,7, y compris établissement de référence du protéome cartes3,8, analyse de protéines différentiellement exprimés profils9,10,11,12,13, variantes de l’hormone14 ,15, modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation14 et la tyrosine nitration16,17,18, la variation de la protéomique des envahissantes relatif à non invasive NFPAs19et l’hétérogénéité de la protéomique de la NFPA sous-types13, qui a conduit à la découverte des multiples réseaux voie importante (dysfonctionnement mitochondrial, dérèglement du cycle cellulaire, stress oxydatif et signalisation MAPK anomalie du système) qui sont altérées dans NFPA13,19,20.
2de sépare les protéines selon leur point isoélectrique (pI) (focalisation isoélectrique, IEF) et leur poids moléculaire (via sodium dodecyl sulfate polyacrylamide électrophorèse sur gel, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. il s’agit d’une technique de séparation classique et communes dans le domaine de la protéomique, depuis l’introduction des concepts du protéome et protéomique en 1995,24. MS est la technique indispensable pour découvrir l’identité des protéines séparées 2DE, y compris les stratégies FMP et MS/MS. Le développement très rapide des instruments MS, surtout dans les aspects de la sensibilité de détection et de résolution, en combinaison avec l’amélioration du système de LC, qui améliore grandement l’identité des protéines de faible ou très faible abondance dans un proteome pour maximiser la couverture d’un proteome. Il conteste également nos concepts traditionnels qu’une seule ou deux protéines sont présents dans un gel 2D dans une analyse du protéome complexe de tissus humains et offre la possibilité d’identifier plusieurs protéines dans un gel 2D spot dans l’analyse des tissus humains complexes protéome et maximiser la couverture NFPA proteome.
Nous décrivons ici les protocoles détaillés de 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS/MS et 2DE-LC-MS/MS, qui ont été utilisées avec succès dans l’analyse du protéome humain de NFPA. Les protocoles comprennent la préparation des échantillons, tout d’abord de dimension (focalisation isoélectrique, IEF), deuxième dimension (SDS-PAGE), visualisation de protéines (coloration à l’argent et la coloration bleu de Coomassie), analyse de gel 2D, la digestion trypsique de dans-gel, d’image purification de peptides tryptiques, CMR, MS/MS et base de données, saisir3,8,25,26. De plus, ce protocole traduit facilement pour l’analyse des autres protéomes de tissus humains.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGphor 3&nbsp ;</td><td>Système de mise au point isoélectrique</td> <td>GE Healthcare</td><td></td>.</tr><tr><td>Ettan DALTsix coulée multigel</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALT II System</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>Le système d’électrophorèse verticale</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor porte-bandelettes</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix roulette multigel</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, États-Unis</td><td></td><td>Roulette multigel</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp ;</td><td>ABI, Foster City, CA</td><td></td><td>MALDI-MS PMF</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td><td>Spectromètre de masse MALDI-MS/MS</td></tr><tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis Spectromètre</td><td></td><td>de masse ESI-MS/MS</td></tr><tr><td>EASY-nano LC system&nbsp ;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Danemark</td><td></td><td>Système de chromatographie liquide haute performance</td></tr><tr><td>PepMap C18 colonne piège.</td><td>300 &mu ; m i.d. et temps ; Longueur 5 mm ; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 colonne</td><td>75 &mu ; m id., longueur 15 cm ; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimvipe&nbsp ;</td><td></td><td>Essuie-tout insoluble</td></tr><tr><td>Watter</td><td>Fabriqué par PURELAB flex instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron Modèle P710/35 Homogénéisateur</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp ; Hercules, CA</td><td></td><td>Logiciel d’analyse d’images de gel 2D</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp ;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version n° 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td> DataExplore (ver. 4.0.0.0) <td>Logiciel MS Logiciel de traitement du spectre</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td> Mascot <td>Logiciel de recherche de protéines basé sur PMF&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td> Mascot <td>Logiciel de recherche de protéines basé sur MS/MS</td></tr><tr><td>Logiciel Proteome Discoverer v.1.3 beta</td><td>Logiciel Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur v.2.1</td><td></td><td></td><td>Logiciel de gestion des données acquises MS/MS</td></tr><tr><td>Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>Base de données sur les protéines humaines</td></tr><tr><td>SEQUEST (version n° 1.3.0.339)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Logiciel de recherche de protéines basé sur MS/MS I</td></tr><tr><td>MASCOT (version 2.3.02)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Logiciel de recherche de protéines basé sur MS/MS II</td></tr><tr><td>C18 ZipTip microcolonne</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass Standard kit&nbsp ;</td><td>Perspective Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Kit de dosage des protéines&nbsp ;</td><td>Thermo&nbsp ; Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-ACRYLAMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>ACRYLAMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>FDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tampon IPG pH 3-10, NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>Bande Sèche Immobiline pH 3-10NL,18cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus adénome hypophysaire humaine

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Adénome hypophysaire humaine (PA) est une tumeur commune qui se produit dans l’hypophyse humaine dans les systèmes d’axes orgue hypothalamus-pituitaire-ciblées et peut-être être classifiée comme PA soit cliniquement fonctionnel ou non fonctionnel (FPA et NFPA). NFPA est difficile pour le diagnostic de stade précoce et le traitement en raison de l’élévation à peine les hormones dans le sang par rapport à la FPA. Notre objectif à long terme consiste à utiliser des méthodes de la protéomique pour découvrir des biomarqueurs fiables de clarification des mécanismes moléculaires de la PA et reconnu efficaces marqueurs diagnostiques, pronostiques et cibles thérapeutiques. Efficace électrophorèse bidimensionnelle (2DE) couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse (MS) ont été présentés ici pour analyser des protéomes PA humains, y compris la préparation d’échantillons, électrophorèse 2D, visualisation de protéines, analyse d’image, en gel la digestion trypsique, empreinte digitale masse de peptide (CMR) et tandem de masse spectrométrie (MS/MS). 2-dimensional gel électrophorèse laser assistée par matrice désorption-ionisation spectrométrie de masse PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS et MS/MS des chromatographie en 2DE (LC) procédures ont été appliquées avec succès dans une analyse du protéome de la NFPA. Avec l’utilisation d’un spectromètre de masse de haute sensibilité, plusieurs protéines ont été identifiés avec la méthode 2DE-LC-MS/MS dans chaque endroit dans une analyse du tissu complexe de PA pour maximiser la couverture de la human proteome PA de gel 2D.

1. 2DE MALDI MS PMF : avec la procédure expérimentale décrite ci-dessus, un total de 150 µg protéines ont été extraites des tissus de la NFPA exprimés FSH (femelle ; 50 ans, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-) FSH (+) et TSH (-)) et Range sur un 18 cm Bande de l’IPG (NL pH 3-10) et un gel SDS-PAGE grand format, puis visualisées avec coloration à l’argent. Nous avons obtenu un modèle de gel 2DE reproductibles et bonne de NFPA tissu protéome (<strong class="x...

Nous présentons ici une électrophorèse bidimensionnelle (2DE) couplée à la spectrométrie de masse (MS) pour séparer et identifier le protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine, qui présente un motif de 2DE bon et reproductible. Plusieurs protéines sont observées dans chaque endroit de 2DE lors de l’analyse complexe cancer proteome avec l’utilisation de MS de haute sensibilité.

Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

L’objectif global de cette électrophorèse sur gel bidimensionnelle couplée à une procédure de spectrométrie de masse est de séparer et d’identifier le protéome du tissu de l’adénome hypophysaire humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéomes. Comme le haut du protéome.Et la découverte de la situation des protéines, de la protéine quatre et de la protéine spacieuse. Le principal avantage de cette technique est que l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle est facilement couplée à la spectrométrie de masse à haute sensibilité pour identifier le protéome, en particulier les protéines de faible abondance. Situation protéique, protéine quatre, et protéine spacieuse.Les mises en œuvre de cette technique tendent vers la QP de la thérapie animale. En raison de la protéine clé pour la protéine spacieuse ou le modèle protéique est utile dans le diagnostic des patients. Nous montrons qu’une démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes d’électrophorèse sur gel bidimensionnelles sont difficiles à apprendre car cela prend du temps et demande beaucoup de travail et il existe plusieurs astuces expérimentales.Pour commencer cette proc

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Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’une méthode d’électrophorèse sur gel bidimensionnelle qui sépare des protéines individuelles d’un mélange complexe de protéines obtenues à partir de tissus tumoraux d’adénome hypophysaire non fonctionnel humain (NFPA). Les protéines sont séparées en fonction de leur charge électrique dans la première dimension et séparées en fonction des poids moléculaires dans la deuxième dimension.

Électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide : technique de séparation pour l’analyse des protéines dans un mélange complexe de protéines basé sur la charge et la masse moléculaire

Source : Wulf, M., et.al.  Protocole basé sur la microdissection laser pour l’analyse LC-MS/MS du profil protéomique des granules de neuromélanine. J. Vis. Exp. (2021). Cette vidéo montre l’analyse d’échantillons de peptides à partir de granules de neuromélanine (NMG) isolés dans des tissus cérébraux humains post-mortem. Les peptides sont d’abord séparés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), puis analysés par spectrométrie de masse pour déterminer leur rapport masse/charge...

Analyse LC-MS/MS du profil protéomique de granules de neuromélanine isolés dans le tissu cérébral humain

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d&#39;extraction pour l&#39;étude de l&#39;homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d'identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d'échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l'identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pronostiques.

D&#39;un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique

Des analyses approfondies des protéomes de cellules cancéreuses facilitent l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses et de biomarqueurs diagnostiques. Nous décrivons un flux de travail expérimental pour l’analyse quantitative des (phospho-)protéomes dans des sous-populations de cellules cancéreuses dérivées de tumeurs liquides et solides. Ceci est réalisé en combinant des stratégies d’enrichissement cellulaire avec la spectrométrie de masse quantitative basée sur Super-SILAC.

Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Cette méthode décrit une stratégie simple et rapide pour la caractérisation et l’investigation des protéoformes d’histones.

Dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2D-TAU

Ici, nous établissons une méthode protéomique basée sur la spectrométrie de masse en utilisant des régions d’intérêt isolées dans des coupes de tissus fixées au formol et incluses dans la paraffine. Ce protocole est utilisé pour analyser le protéome de zones tissulaires spécifiques dans des coupes de tissus archivées fixées au formol et incluses dans la paraffine.

Une approche simplifiée pour la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à l’aide de régions tissulaires sélectionnées

Ce protocole a préparé avec succès suffisamment de tissus néovasculaires de haute qualité à partir d’échantillons de gliome en utilisant une microdissection par capture laser pour l’analyse quantitative de protéomique de l’angiogenèse tumorale, surmontant les limites des études traditionnellement axées principalement sur les facteurs angiogéniques et fournissant un profil protéomique à grande échelle de l’angiogenèse du gliome.

Préparation des tissus néovasculaires à partir de tissus gliomes humains pour l’analyse quantitative de la protéomique de l’angiogenèse tumorale

Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d'ADN pour quantifier la longueur des télomères.

Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

Découvrez l'électrophorèse bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse pour analyser le protéome des adénomes hypophysaires humains. Cette méthode permet d'identifier les protéines d'abondance faible avec une grande sensibilité.

Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine (Vidéo) | JoVE Journal

Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine

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