Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

L’objectif global de cette méthode est d’obtenir une intégration stable d’un gène d’intérêt dans le génome humain des cellules primaires par le système de la Belle au bois dormant régulé transcriptionnellement et emballé dans l’intégration de vecteurs lentiviraux défectueux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie génique, telles que l’intégration du gène d’intérêt dans les cellules primaires à l’aide du système de la Belle au bois dormant. Les principaux avantages de cette technique sont que le système hyperactif inductible de la Belle au bois dormant délivre efficacement des cellules primaires résistantes à plusieurs méthodes de transfection.

La démonstration de la procédure sera assurée par Daniela Benati, post-doctorante dans mon laboratoire. Avant le jour de la transduction, les kératinocytes primaires humains sont cultivés comme décrit dans le protocole textuel. Pour détacher les kératinocytes subconfluents en culture, retirez le milieu, lavez les cellules avec 1X PBS et ajoutez un millilitre de solution de travail de trypsine préchauffée dans chaque puits.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Remettez soigneusement en suspension les cellules d’un puits et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger contenant deux millilitres de milieu contenant du sérum. Rincez le puits une fois avec trois millilitres de 1X PBS et ajoutez la solution rincée dans le tube à centrifuger avec la suspension cellulaire.

Centrifugez à 580 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS, centrifugez à 580 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Dans un tube en polypropylène de 15 millilitres, diluer 1,6 fois 10 à cinq kératinocytes dans un millilitre de milieu CFAD.

Préparez une dilution pour chaque condition. Les trois vecteurs lentiviraux défectueux d’intégration ou IDLV ont été préparés plus tôt, comme décrit dans le protocole texte. IDLVTKSB transporte les transpositions hyperactives SB100X régulées par TET.

IDLVrtTA code pour le modulateur et IDLVT2 porte le gène d’intérêt. GFP dans cet exemple flanqué de répétitions inversées de transposon. Diluer les vecteurs lentiviraux dans un millilitre de milieu CFAD en présence de 20 microlitres de polybrène comme indiqué dans ce tableau.

Un, deux et trois sont des contrôles négatifs sans vecteurs. Quatre et cinq contiennent IDLVTKSB et IDLVrtTA. Six, sept, huit et neuf contiennent les trois vecteurs lentiviraux.

Transduisez des cellules en suspension en ajoutant chaque dilution de vecteur lentiviral à la suspension de kératinocytes correspondante. Retirez le milieu des cellules nourricières 3T3-J2 irradiées létalement qui se sont retirées il y a un jour et plaquez-y les kératinocytes transduits. Après avoir transducté un puits, passez au suivant.

Incuber à 25 degrés pendant 30 minutes. Transférez ensuite les cellules à 37 degrés pendant six heures. Après six heures, ajoutez un millilitre de milieu CFAD dans chaque puits.

Ajoutez une micromolaire de doxycycline aux puits cinq, huit et neuf. Remettez les cellules à 37 degrés Celsius. Par la suite, traitez les cellules de chaque puits comme décrit dans le protocole texte.

Pour l’analyse cytofluorimétrique, les kératinocytes primaires transduits détachés au troisième et au sixième jour doivent être distingués de la couche nourricière 3T3-J2 en marquant les cellules avec l’anticorps antinourricier monoclonal APC conjugué de souris. Préparez quatre millilitres de tampon de coloration pour chaque échantillon en combinant 5 % de FBS, 500 millimolaires d’EDTA et 1X PBS. Lavez les cellules détachées avec un millilitre de tampon de coloration.

Centrifugez à 580 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Dans un tube d’acquisition par cytométrie en flux, remettre en suspension cinq fois 10 à la quatrième cellules dans 100 microlitres de tampon de coloration. Ajoutez deux microlitres d’anticorps anti-mangeur à une dilution de un à 50 et mélangez bien.

Incuber sur glace dans l’obscurité pendant 30 minutes. Après 30 minutes, laver avec deux millilitres de tampon de coloration. Centrifuger à 580 fois g pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et remettez-le en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration. Utilisez un cytomètre en flux configuré avec un laser bleu, un laser rouge et des filtres pour la détection de la fluorescence GFP et APC afin d’acquérir les signaux APC et GFP. La fraction cellulaire positive à la GFP de la population cellulaire négative APC indique des kératinocytes transduits.

Pour effectuer une PCR en temps réel, configurez des réactions en trois exemplaires dans une plaque de 96 puits dans un volume de réaction final de 25 microlitres. Chaque réaction contient un microlitre d’ADNc, 12,5 microlitres de mélange maître 2X, 1,25 microlitre d’amorces dans un mélange de sonde 20X et 10,25 microlitres d’eau stérile. Exécutez la PCR en temps réel selon ce programme PCR, un cycle à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis 40 cycles de 95 degrés Celsius pendant 15 secondes et 60 degrés Celsius pendant une minute et maintenez à quatre degrés Celsius.

Enfin, analysez les données de PCR en temps réel comme décrit dans le protocole texte. L’analyse de l’expression des cellules HeLa transduites avec des doses croissantes de transposes dans les vecteurs modulateurs plus ou moins la doxycycline a montré que des doses élevées des deux IDLV étaient nécessaires pour induire fortement l’expression de SB100X. L’analyse quantitative de l’expression de SB100X sur les cellules HeLa transduites avec le vecteur transposé en présence ou en l’absence du vecteur modulateur a révélé une activation octuple sur le fond en présence de doxycycline.

Le système de la Belle au bois dormant régulé transcriptionnellement peut également être utilisé dans les cellules primaires. L’expression de SB100X sur les kératinocytes transduits avec des transposés et des vecteurs modulateurs a montré une activation de 15 fois à l’état désactivé. L’expérience de transposition réalisée dans des kératinocytes transduits avec les trois vecteurs IDLV plus ou moins doxycycline a indiqué que 12 % des cellules traitées avec de la doxycycline intégraient de manière stable au moins une copie de la GFP dans leur génome.

Une fois maîtrisée, la transduction vitale dans les cellules primaires peut être effectuée en huit heures, l’analyse cytofluorimétrique en deux heures et l’analyse de l’expression en trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser la combinaison de doses de vecteurs utilisée pour transduire les cellules primaires et d’atteindre le niveau d’expression plus élevé des transpositions inductibles de la Belle au bois dormant. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR quantitative et la PCR médiée par linker peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le nombre de copies de transposon par cellule et l’intégration pour le dépôt du génome.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie au chercheur dans le domaine de la thérapie génique pour explorer l’application du système de la Belle au bois dormant dans l’ingénierie de cellules cliniques. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transduire d’abord les kératinocytes primaires avec les vecteurs IDLV. Deuxièmement, mesurer l’expression des transposes hyperactives à la condition de doxycycline et enfin suivre la transposition par cytométrie en flux.

N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs viraux peut être extrêmement dangereux, de sorte que des précautions telles que BCL pour contenir le niveau et l’approvisionnement disponible doivent toujours être prises avec vous lors de l’exécution de ces procédures.