Name: Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Découvrez l'intégration stable de gènes dans des cellules primaires humaines grâce au système Sleeping Beauty régulé transcriptionnellement. Cette méthode utilise des vecteurs lentiviraux défectueux de l'intégration pour améliorer l'efficacité de la thérapie génique.

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Nous remercions le professeur Zappavigna, Université de Modène et Reggio Emilia, Modène, Italie pour nous avoir fourni le VR-PGKrtTA2S-M2 plasmide. Nous remercions également Prof Z. Ivics (l’Institut Paul Ehrlich, Langen, Allemagne) et le Prof. Z. Izvak (Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, Allemagne) pour les plasmides pCMVSB100X et pT2/BH. Ce travail a été soutenu par DEBRA internationale et le ministère italien de l’Université et de la recherche.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici une méthodologie largement accessible pour un GOI stablement intégrer le génome des cellules cibles de la Belle au bois dormant-médiée par transposition. Bien que le système de SB a été développé pour fournir une méthode nonviral pour l’édition de génome, une prestation efficace de la machinerie de l’intégration (transposase et T2 transposon) est obligatoire. Par conséquent, pour utiliser le système SB sur peine transfectable cellules primaires, une livraison virale des composants SB a été rep...

La transposase SB100X hyperactive, couplée à du transposon axée sur le T2 a déjà été utilisée dans le gène précliniques thérapie demandes1,2,3, génome modifications4,5, et cellules souches pluripotentes induites (iPSC) reprogrammation6,7. En règle générale, les éléments de SB sont transitoirement fournis par transfection de plasmide et un promoteur constitutif fort conduit à l’expression de la transposase. Toutefois, malgré l’amélioration des nouvelles méthodes de transfection, livraison du système bi-composant demeure un défi pour de nombreuses applications. Ainsi, le développement d’un nouveau protocole de livraison a un intérêt croissant. En plus de méthodes de transfection pour plasmide ARNm et8 9, livraison viral basé sur adénoviraux10,11, adeno-associated virus (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 et vecteurs LENTIVIRAUX15 a été proposé dans le passé. Notamment, le système de choix doit garantir une prestation transitoire des composants SB sans intégration du vecteur viral. Néanmoins, l’expression constitutive de la transposase soulève des questions de sécurité en raison du risque de rehopping incontrôlable du transposon.
Par conséquent, la régulation transcriptionnelle de SB100X par un système raffiné de Tet-ON est le premier défi. Mis à jour le promoteur Tet-sensible, obtenu en remplaçant le promoteur développés minime cytomégalovirus (CMV) original avec le promoteur minimal (-81) du gène du Virus Herpès Simplex 1 (HSV1)16, Timidine Kinase (TK) par est cloné en amont de la SB100X ADNc (pTetOTKSB100X). La mutation inverse-tétracycline-transactivateur rtTA2s-M217 est exprimée sous le contrôle du promoteur constitutif fort (promoteur phosphoglycérate, PGK) cloné dans un plasmide différent (VR-PGKrtTA2S-M2). Lors de l’ajout au milieu de culture, dox lie la rtTA2s-modulateur M2 et longes le promoteur Tet ou complex, consistant en une induction étroitement réglementée de SB100X expression18.
Le deuxième grand défi découle de l’inefficacité transfection de cellules humaines primaires par plusieurs méthodes physiques et chimiques. Pour délivrer efficacement la transposase dans les cellules humaines résistants à la transfection, les SB100X et les rtTA2s-cassettes d’expression M2 sont emballés dans deux intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux (IDLVs)19: IDLVTKSB et IDLVrtTA2s- M2. Vecteurs viraux sont transitoirement produits des vecteurs troisième génération de cellules HEK293T20 et Pseudo avec la glycoprotéine G du Virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G), qui lui confère un large spectre de l’infection. Particules de vecteur sont concentrées par ultracentrifugation et titrés par immunocapture de p24 VIH-1 Gag. Pour transmettre des lignées cellulaires et les cellules primaires, particules de vecteur sont complexés avec polybrene et sont incubés avec cellules cibles en présence ou en absence de dox. Activation de toxicomanes de SB100X expression dans les cellules transduits est mesurée par quantitative RT-PCR (qRT-PCR)18.
Une fois que l’expression SB100X Tet réglementés est démontrée, transposition des IgE (p. ex., protéine fluorescente verte, GFP) dans le génome de cellule cible suit les événements moléculaires clairement schématisées par Bak et Mikkelsen21. Une troisième jusque vecteur transportant une cassette d’expression pour les pouvoirs publics indiens cloné entre l’IRs T2-transposon (IDLVT2) doit être construit et conditionnés comme indiqué ci-dessus. Enfin, les trois vecteurs jusque peuvent être utilisés efficacement transduce (p. ex., les kératinocytes primaires) des cellules humaines in vitro et intégrer le gouvernement de l’Inde en présence de doxycycline,18.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' milieu avec 4,5 g/L de glucose sans L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin HyClone (États-Unis), Sérum caractérisé</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td>utilisé HEK293T culture cellulaire pour la production de particules lentivirales.</td></tr><tr><td>Pénicilline 10.000 UI/ml Streptomycine 10.000 UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Réactifs pour milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Réactif pour milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Réactif de chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>pour la préparation HBS 2X.</td></tr><tr><td>Tampon HEPES, 1M Stock dans une solution saline normale</td><td>Lonza</td><td>BE17-737E</td><td>Réactif pour préparation HBS 2X.</td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na2HPO4&middot ; 2H2O), 99,5 %</td><td>Réactif Merck</td><td>106580</td><td>pour préparation HBS 2X.</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique - Réactif ACS 37 % (HCl)</td><td>Réactif 320331 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>pour préparation HBS 2X.</td></tr><tr><td>Eau stérile pour injection</td><td>Fresenius Kabi-Réactif</td><td></td> <td>pour préparation HBS 2X.</td></tr><tr><td>0,45 et micro ; m Filtre PESS</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td>Filtres utilisés pour éliminer les débris cellulaires du surnageant viral.</td></tr><tr><td>Polyallomère Tubes Beckman Beckman</td><td>Coulter</td><td>326823</td><td>Tubes pour la concentration de vecteurs IDLV par ultracentrifugation.</td></tr><tr><td>PBS-1X sans Ca, Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Tampon pour le lavage cellulaire et la remise en suspension de particules lentivirales.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>(Facultatif) Tampon pour la remise en suspension de particules lentivirales.</td></tr><tr><td>HIV-1 Gag p24 kit d’immunocapture</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK50001KT</td><td>Kit pour le titrage des particules IDLV.</td></tr><tr><td>Polybrène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>réactif pour améliorer l’efficacité de la transduction.</td></tr><tr><td>Trypsine (10X) 2,5 % dans HBSS sans Ca, Mg</td><td>GIBCO</td><td>BE17-160E</td><td>Réactif pour détacher les cellules HeLa (solution mère, à diluer).</td></tr><tr><td>Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>100938B</td><td>AnalaR BDH</td><td>Réactif pour la préparation de la solution de travail de la trypsine.</td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA, sans rouge de phénol (10X)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Réactif pour détacher les kératinocytes (solution mère, à diluer).</td></tr><tr><td>Sérum de bovin donneur, origine Nouvelle-Zélande</td><td>GIBCO</td><td>16030-074</td><td>Sérum pour culture cellulaire de souris suisse 3T3-J2 (couche nourricière).</td></tr><tr><td>Jambon s F12 media</td><td>GIBCO</td><td>21765</td><td>Milieu pour kératinocytes.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>Sérum pour milieu de culture cellulaire HeLa.</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, qualifié, Australie Origine</td><td>GIBCO</td><td>10099-141</td><td>Sérum pour milieu de culture primaire de kératinocytes humains.</td></tr><tr><td>Insuline du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Réactifs pour la croissance des kératinocytes.</td></tr><tr><td>Adénine</td><td>VWR</td><td>1152-25</td><td>Réactifs pour la croissance des kératinocytes.</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>VWR</td><td>3867-1</td><td>Réactifs pour la croissance des kératinocytes.</td></tr><tr><td>Toxine cholérique de Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Réactifs pour la croissance des kératinocytes.</td></tr><tr><td>Triiodothyronine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>Réactifs pour la croissance des kératinocytes.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>humain Austral Biological</td><td>GF-010-9</td><td>Réactifs pour la croissance des kératinocytes.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-feeder monoclonal APC conjugué de souris</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-099</td><td>Pour marquer la couche nourricière.</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Kit de purification d’ARN.</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18080051</td><td>Kit de transcriptase inverse.</td></tr><tr><td>Mélange de désoxynucléotides, 10 mM (dNTP)</td><td>Réactif Sigma-Aldrich</td><td>D7295</td><td>pour PCR semi-quantitative.</td></tr><tr><td>Réactif d’eau distillée sans DNase/RNase UltraPure</td><td></td><td></td> <td>pour la PCR semi-quantitative et pour la qRT-PCR.</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Démarrage à chaud Polymérase</td><td>Promega</td><td>M740B</td><td>Taq polymérase.</td></tr><tr><td>Agarose, pour la biologie moléculaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Réactif pour l’électrophorèse sur gel d’agarose.</td></tr><tr><td>Tampon TBE UltraPure, 10X</td><td>Invitrogen</td><td>15581028</td><td>Réactif pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, à diluer (1X) dans ddH2O.</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Réactif pour l’électrophorèse sur gel d’agarose.</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9891</td><td>médicament pour induire l’expression de la transposase dans les cellules HeLa et dans les kératinocytes</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystem</td><td>4304437</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix comprenant des amorces et une sonde.</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger en polypropylène haute clarté de 15 ml, fond conique, avec bouchon à vis à joint en dôme, tubes 352096</td><td>stériles Falcon Corning</td><td></td><td>pour la collecte de cellules et la préparation de dilution de vecteurs.</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire traitée TC de 150 mm avec grille de 20 mm,</td><td>Falcon Corning</td><td>stérile 353025</td><td>Boîte de culture cellulaire pour la production virale.</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire multipuits à fond plat traitée TC, à 6 puits transparents, avec couvercle, emballée individuellement,</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td>Plaque de culture cellulaire stérile pour HeLa et la transduction primaire des kératinocytes humains.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger Safe-Lock, volume 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>Tubes pour la préparation par dilution.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation Safe-Lock, volume 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Tubes pour la préparation de dilution.</td></tr><tr><td>Tubes PCR de 0,2 ml avec bouchons plats, RNase, DNase, ADN et tubes sans inhibiteur de PCR</td><td></td><td></td> <td>pour PCR semi-quantitative.</td></tr><tr><td>Plaque de réaction optique rapide à 96 puits MicroAmp avec code-barres, 4346906 biosystème appliqué de 0,1 ml</td><td></td><td></td><td>à 96 puits pour qRT-PCR.</td></tr><tr><td>Tube en polystyrène à fond rond de 5 ml, sans capuchon</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td>Tubes pour l’acquisition par cytométrie en flux.</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables, polystyrène, emballées individuellement, stériles (différents volumes)</td><td>(toutes)</td><td>-</td><td>Pipettes pour les applications de culture tissulaire stérile.</td></tr><tr><td>Embouts filtrants, stériles et sans RNase, DNase, ADN et pyrogène (différents volumes)</td><td>(tout)</td><td>-</td><td>Embouts filtrants pour les applications de culture de tissus stériles et de biologie moléculaire.</td></tr><tr><td>pH-mètre</td> <td>(tout)</td><td>-Équipement</td> <td>pour la mesure du pH HBS 2X.</td></tr><tr><td>PCR Thermocycleur</td> <td>(tout)</td><td>-Équipement</td> <td>pour PCR semi-quantitative.</td></tr><tr><td>Équipement d’électrophorèse sur gel d’agarose</td> <td>(tout)</td><td>-Équipement</td> <td>pour l’électrophorèse sur gel d’agarose de PCR semi-quantitative.</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II 2LSR 4/2</td><td>Cytomètre BD-Flow</td><td></td><td>.</td></tr><tr><td>7900HT Système de PCR rapide en temps réel</td><td>Applied Biosystem</td><td>7900HT</td><td>Équipement pour qRT-PCR.</td></tr><tr><td>Centrifugeuses de paillasse pour un traitement efficace des échantillons dans les applications de culture cellulaire, réfrigérées, avec godets à microplaques.</td><td>(toute)</td><td>-</td><td>Centrifugeuse pour le traitement de la culture cellulaire et la spinoculation.</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima L-90K équipée d’un rotor SW32TI</td><td>Beckman</td> <td>Coulter-Ultracentrifuge</td> <td>pour la production de particules lentivirales.</td></tr><tr><td>Équipement pour les laboratoires de culture cellulaire et de biologie moléculaire (par exemple, hotte à flux laminaire de classe II conçue pour le travail avec des matériaux BSL2, incubateur de culture cellulaire, réfrigérateurs et congélateurs (+4 &deg ; C, -20 &deg ; C, -80 &deg ; C), micropipettes et aide à la pipette).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blouses de protection, gants, protection faciale conformes aux règles et règlements de l’Institut, en particulier pour la production et la transduction de particules lentivirales.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode de transposition efficace in vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur lentiviral défectueux de l’intégration

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Le transposon de Belle au bois dormant (SB) est un système intégrant non viraux avec une efficacité prouvée pour transfert génétique et la génomique fonctionnelle. Pour optimiser les machines de transposon SB, une transposase hyperactif transcriptionnellement réglementé (SB100X) et le transposon axée sur le T2 sont employés. En règle générale, la transposase et transposons sont fournis transitoirement par transfection de plasmide et expression SB100X est pilotée par un promoteur constitutif. Nous décrivons ici une méthode efficace pour fournir les composants SB aux cellules humaines qui sont résistantes à plusieurs méthodes de transfection physiques et chimiques, pour contrôler l’expression SB100X et stablement intégrer un gène d’intérêt (IGE) à travers un « copier / coller » SB mécanisme. L’expression de la transposase hyperactif est étroitement contrôlée par le système Tet-ON, largement utilisé pour contrôler l’expression des gènes depuis 1992. Le gène d’intérêt est flanqué des séquences inversées répétées (IR) du transposon T2. Les deux composantes de SB sont emballés dans l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux transitoirement produites dans les cellules HEK293T. Les cellules humaines, les lignées cellulaires ou cellules primaires provenant de tissus humains, sont en vitro transitoirement transduites avec des vecteurs viraux. Lors de l’addition de la doxycycline (dox, tétracycline analogique) dans le milieu de culture, un réglage fin de l’expression de la transposase est mesurée et se traduit par une intégration durable du gène d’intérêt dans le génome des cellules traitées. Cette méthode est efficace et applicable à la lignée cellulaire (par exemple, les cellules HeLa) et les cellules primaires (p. ex., les kératinocytes humains primaires) et représente donc un outil précieux pour le génie génétique et transfert de gènes thérapeutiques.

À l’aide de la procédure présentée ici, trois vecteurs jusque supportant les composants réglementés de SB (SB100X, rtTA2S-transposon M2 et T2-GFP) ont été emballés et permettant de délivrer efficacement et étroitement réglementer le système SB dans les cellules humaines. Figure 1 a présente un schéma pour in vitro transduction des cellules HeLa, qui a été réalisée pour évaluer la régulation transcriptionnelle de SB transposase avec la meil...

Ce protocole décrit une méthode pour réaliser l’intégration stable d’un gène d’intérêt dans le génome humain par le système transcriptionnellement réglementé de la Belle au bois dormant . Préparation de l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux, la transduction in vitro des cellules humaines et l’analyse moléculaire sur les cellules transduits sont signalés.

Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

L’objectif global de cette méthode est d’obtenir une intégration stable d’un gène d’intérêt dans le génome humain des cellules primaires par le système de la Belle au bois dormant régulé transcriptionnellement et emballé dans l’intégration de vecteurs lentiviraux défectueux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie génique, telles que l’intégration du gène d’intérêt dans les cellules primaires à l’aide du système de la Belle au bois dormant. Les principaux avantages de cette technique sont que le système hyperactif inductible de la Belle au bois dormant délivre efficacement des cellules primaires résistantes à plusieurs méthodes de transfection.La démonstration de la procédure sera assurée par Daniela Benati, post-doctorante dans mon laboratoire. Avant le jour de la transduction, les kératinocytes primaires humains sont cultivés comme décrit dans le protocole textuel. Pour détacher les kératinocytes subconfluents en culture, retirez le milieu, lavez les cellules avec 1X PBS et ajoutez un millilitre de solution de travail de trypsine préchauffée dans chaque puits.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Remettez soigneusement en suspension les cellules d’un puits et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger contenant deux millilitres de milieu contenant du sérum. Rincez le puits une fois avec trois millilitres de 1X PBS et ajoutez la solution rincée dans le tube à centrifuger avec la suspension cellulaire.Centrifugez à 580 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS, centrifugez à 580 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Dans un tube en polypropylène de 15 millilitres, diluer 1,6 fois 10 à cinq kératinocytes dans un millilitre de milieu CFAD.Préparez une dilution pour chaque condition. Les trois vecteurs lentiviraux défectueux d’intégration ou IDLV ont été préparés plus tôt, comme décrit dans le protocole texte. IDLVTKSB transporte les transpositions hyperactives SB100X régulées par TET.IDLVrtTA code pour le modulateur et IDLVT2 porte le gène d’intérêt. GFP dans cet exemple flanqué de répétitions inversées de transposon. Diluer les vecteurs lentiviraux dans un millilitre de milieu CFAD en présence de 20 microlitres de polybrène comme indiqué dans ce tableau.Un, deux et trois sont des contrôles négatifs sans vecteurs. Quatre et cinq contiennent IDLVTKSB et IDLVrtTA. Six, sept, huit et neuf contiennent les trois vecteurs lentiviraux.Transduisez des cellules en suspension en ajoutant chaque dilution de vecteur lentiviral à la suspension de kératinocytes correspondante. Retirez le milieu des cellules nourricières 3T3-J2 irradiées létalement qui se sont retirées il y a un jour et plaquez-y les kératinocytes transduits. Après avoir transducté un puits, passez au suivant.Incuber à 25 degrés pendant 30 minutes. Transférez ensuite les cellules à 37 degrés pendant six heures. Après six heures, ajoutez un millilitre de milieu CFAD dans chaque puits.Ajoutez une micromolaire de doxycycline aux puits cinq, huit et neuf. Remettez les cellules à 37 degrés Celsius. Par la suite, traitez les cellules de chaque puits comme décrit dans le protocole texte.Pour l’analyse cytofluorimétrique, les kératinocytes primaires transduits détachés au troisième et au sixième jour doivent être distingués de la couche nourricière 3T3-J2 en marquant les cellules avec l’anticorps antinourricier monoclonal APC conjugué de souris. Préparez quatre millilitres de tampon de coloration pour chaque échantillon en combinant 5 % de FBS, 500 millimolaires d’EDTA et 1X PBS. Lavez les cellules détachées avec un millilitre de tampon de coloration.Centrifugez à 580 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Dans un tube d’acquisition par cytométrie en flux, remettre en suspension cinq fois 10 à la quatrième cellules dans 100 microlitres de tampon de coloration. Ajoutez deux microlitres d’anticorps anti-mangeur à une dilution de un à 50 et mélangez bien.Incuber sur glace dans l’obscurité pendant 30 minutes. Après 30 minutes, laver avec deux millilitres de tampon de coloration. Centrifuger à 580 fois g pendant cinq minutes.Jetez le surnageant et remettez-le en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration. Utilisez un cytomètre en flux configuré avec un laser bleu, un laser rouge et des filtres pour la détection de la fluorescence GFP et APC afin d’acquérir les signaux APC et GFP. La fraction cellulaire positive à la GFP de la population cellulaire négative APC indique des kératinocytes transduits.Pour effectuer une PCR en temps réel, configurez des réactions en trois exemplaires dans une plaque de 96 puits dans un volume de réaction final de 25 microlitres. Chaque réaction contient un microlitre d’ADNc, 12,5 microlitres de mélange maître 2X, 1,25 microlitre d’amorces dans un mélange de sonde 20X et 10,25 microlitres d’eau stérile. Exécutez la PCR en temps réel selon ce programme PCR, un cycle à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis 40 cycles de 95 degrés Celsius pendant 15 secondes et 60 degrés Celsius pendant une minute et maintenez à quatre degrés Celsius.Enfin, analysez les données de PCR en temps réel comme décrit dans le protocole texte. L’analyse de l’expression des cellules HeLa transduites avec des doses croissantes de transposes dans les vecteurs modulateurs plus ou moins la doxycycline a montré que des doses élevées des deux IDLV étaient nécessaires pour induire fortement l’expression de SB100X. L’analyse quantitative de l’expression de SB100X sur les cellules HeLa transduites avec le vecteur transposé en présence ou en l’absence du vecteur modulateur a révélé une activation octuple sur le fond en présence de doxycycline.Le système de la Belle au bois dormant régulé transcriptionnellement peut également être utilisé dans les cellules primaires. L’expression de SB100X sur les kératinocytes transduits avec des transposés et des vecteurs modulateurs a montré une activation de 15 fois à l’état désactivé. L’expérience de transposition réalisée dans des kératinocytes transduits avec les trois vecteurs IDLV plus ou moins doxycycline a indiqué que 12 % des cellules traitées avec de la doxycycline intégraient de manière stable au moins une copie de la GFP dans leur génome.Une fois maîtrisée, la transduction vitale dans les cellules primaires peut être effectuée en huit heures, l’analyse cytofluorimétrique en deux heures et l’analyse de l’expression en trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser la combinaison de doses de vecteurs utilisée pour transduire les cellules primaires et d’atteindre le niveau d’expression plus élevé des transpositions inductibles de la Belle au bois dormant. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR quantitative et la PCR médiée par linker peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le nombre de copies de transposon par cellule et l’intégration pour le dépôt du génome.Après son développement, cette technique a ouvert la voie au chercheur dans le domaine de la thérapie génique pour explorer l’application du système de la Belle au bois dormant dans l’ingénierie de cellules cliniques. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transduire d’abord les kératinocytes primaires avec les vecteurs IDLV. Deuxièmement, mesurer l’expression des transposes hyperactives à la condition de doxycycline et enfin suivre la transposition par cytométrie en flux.N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs viraux peut être extrêmement dangereux, de sorte que des précautions telles que BCL pour contenir le niveau et l’approvisionnement disponible doivent toujours être prises avec vous lors de l’exécution de ces procédures.

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Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

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