Visualisation de SNARE intracellulaire traite par Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

L’objectif général de cette expérience est de visualiser la formation complexe de protéines SNARE dans des cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du trafic membranaire, telles que l’identification des ensembles de protéines SNARE qui catalysent les étapes spécifiques du trafic d’organes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser directement les emplacements cellulaires où les SNARE s’engagent dans une formation complexe.

Dans cette expérience, 900 000 cellules HeLa réparties dans trois tubes d’Eppendorf sont utilisées pour la transfection. Transfectez les cellules comme décrit dans le protocole de texte avec les constructions suivantes. Échantillon numéro un avec la construction mCitrine syntaxinine-4, échantillon numéro deux avec la mCitrine syntaxinine-4 et VAMP3-mCherry, et échantillon numéro trois avec syntaxinine-3 fusionnée à la fois à mCitrine et mCherry.

Cultivez les cellules transfectées dans du DMEM à haute teneur en glucose alimenté avec 10 % de FCS et 1 % d’antimicotique antibiotique à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain, aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec un milieu d’imagerie de cellules vivantes pendant deux minutes. Après cela, placez les cellules dans un support d’imagerie frais.

Pour commencer cette procédure, placez l’échantillon numéro deux à 37 degrés Celsius, sur une platine chauffée, sous un microscope confocal d’imagerie à durée de vie de fluorescence dans le domaine temporel avec une source d’excitation pulsée pour le fluorophore donneur et une acquisition de données résolues en temps. Avant chaque mesure de microscopie d’imagerie à vie de fluorescence ou FLIM, sélectionnez une cellule avec une expression visible des protéines SNARE marquées mCitrine et mCherry et enregistrez une image confocale de 256 par 256 pixels avec excitation simultanée des deux fluorophores. Enregistrez une image FLIM en cliquant sur Exécuter FLIM, l’image FLIM étant enregistrée avec les mêmes dimensions et la même résolution spatiale que l’image confocale enregistrée précédemment.

Enregistrez l’image avec au moins 50 000 photons pour l’analyse FLIM de cellules entières ou au moins 400 photons par pixel. Il est important d’enregistrer les mesures FLIM à au moins un micromètre de la surface du verre pour éviter une vue par réflexion. Répétez l’imagerie à partir de plusieurs cellules dans l’échantillon numéro deux et pour les cellules de l’échantillon numéro un et de l’échantillon numéro trois.

Ensuite, placez une lamelle en verre propre sur la platine du microscope pour enregistrer une fonction de réponse de l’instrument ou IRF. Réglez le monochromateur du détecteur d’émission sur la longueur d’onde d’excitation et cliquez sur le bouton exécuter FLIM pour enregistrer une image FLIM avec la rétrodiffusion de la lamelle de verre. Les enregistrements photo seront convertis en images FLIM à l’aide du logiciel de conversion PT32ICS.

Configurez le logiciel. Définissez la sortie sur ImageJ pour générer des images FLIM. Réglez la taille de l’image sur 256 x 256 pixels et le canal sur deux.

Appuyez sur convertir et chargez une ou plusieurs traces de photons. Maintenez la touche de contrôle enfoncée pour sélectionner plusieurs traces de photons. Les images FLIM doivent être générées dans le même dossier que celui où les traces de photons sont enregistrées.

Commencez par ouvrir le logiciel d’analyse de données capable de s’adapter à la déconvolution. Importez le fichier texte contenant l’histogramme de chaque trace de photon. Réorganisez la table de sorte que l’IRF se trouve dans la deuxième colonne de la table, à côté des valeurs temporelles de la colonne A.Déterminez la qualité des traces de photons enregistrées en sélectionnant toutes les colonnes.

N’analysez pas les traces de photons avec un pic de réflexion élevé. Un exemple est présenté ici. Utilisez la touche Ctrl pour sélectionner toutes les colonnes contenant les histogrammes de durée de vie contrôlés qui seront ajustés, ainsi que l’IRF dans la colonne B, et chargez l’ajustement non linéaire.

Chargez la fonction d’ajustement déconvoluté en ajoutant cette fonction au logiciel d’analyse. Sélectionnez le fichier de fonction d’ajustement. Cette fonction aligne les histogrammes de durée de vie de fluorescence avec une fonction de décroissance exponentielle mono déconvolutée avec l’IRF.

Effectuez la mise à l’échelle de l’axe X des courbes ajustées. Ajustez les courbes en appuyant sur ajuster. Cela convertira l’ajustement et générera une feuille de rapport dans le réseau avec la table contenant les durées de vie de fluorescence, les décalages et les amplitudes.

Il générera également une fiche technique avec les courbes ajustées et les résidus de l’ajustement. On voit des images confocales représentatives d’hélocellules qui n’expriment que la syntaxine quatre mCitrine, la snytaxine quatre mCitrine avec VAMP3 mCherry, ou la syntaxine trois mCitrine mCherry en tandem. Dans les images de durée de vie de fluorescence qui les accompagnent, la couleur indique la durée de vie fluorescente apparente moyenne.

Les images ont ensuite été alambiquées avec les intensités de fluorescence du fluorophore donneur de mCitrine. Viennent ensuite les mêmes images avec ajustement avec des fonctions de décroissance bi-exponentielle. Les couleurs des pixels indiquent les fractions estimées de syntaxe en quatre en complexe avec VAMP3.

La fonction de réponse de l’instrument de l’installation a été mesurée à l’aide de la rétrodiffusion sur l’interface verre-eau. Des histogrammes de durée de vie de cellules entières sont présentés pour des cellules exprimant uniquement la syntaxine quatre mCitrine, co-exprimant la syntaxine quatre mCitrine avec VAMP3 mCherry et exprimant la syntaxine trois mCitrine mCherry construction tandem. Le panneau E montre une superposition des courbes de décroissance des panneaux B, C et D.Les incrustations montrent les mêmes graphiques, mais avec une échelle logarithmique de l’axe Y.

Un histogramme de durée de vie fluorescent enregistré trop près de la surface de la lamelle du microscope a entraîné un grand pic de réflexion, représenté par la zone ombrée en jaune. Enfin, un histogramme à vie avec un ajustement représentatif avec une fonction de décroissance bi-exponentielle est présenté. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre heures si elle est bien exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’enregistrer plusieurs cellules tandis que les niveaux d’expression du donneur et de l’intercepteur SNARES peuvent influencer la durée de vie. À la suite de cette procédure, les cellules peuvent être activées afin de répondre à des questions spécifiques au type cellulaire liées au réenracinement du trafic membranaire médié par SNARE. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du trafic membranaire pour explorer les voies intercellulaires du trafic des organites dans toutes les cellules eucaryotes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer et d’analyser les données FLIM. N’oubliez pas que travailler avec des organismes génétiquement modifiés et des lasers de haute puissance peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que des gants et des lunettes de protection, doivent toujours être prises lors de cette procédure.