Name: Combinant la réticulation chimique et spectrométrie de masse des Complexes de protéine intacte pour étudier l’Architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Découvrez une méthode combinant réticulation chimique et spectrométrie de masse native pour étudier l'architecture des assemblages protéiques multi-sous-unités. Ce protocole offre des informations structurales complémentaires essentielles.

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Nous remercions nos collègues pour discussions utiles. Nous remercions également Ilme Schlichting et Karl-Peter Hopfner pour fournir des complexes protéiques. Nous reconnaissons le financement par le ministère fédéral pour l’éducation et la recherche (BMBF, ZIK programme, 03Z22HN22), le Fonds européen de développement régional (FEDER, ZS/2016/04/78115) et de la Halle-Wittenberg MLU C.S. et le financement du Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) à A.P.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Protocoles sont fournis pour l’analyse structurale basé sur la spectrométrie de masse des complexes de plusieurs sous-unités protéiques. Les deux techniques, décrites dans le protocole, pour la plupart donnent des résultats complémentaires et sont bien adaptés pour nous éclairer sur les arrangements structurels au sein de la protéine (-ligand) complexes qui sont difficiles à étudier par des techniques structurelles conventionnelles. Spectrométrie de masse Native offre aperçus de stoechiométries protéines ainsi que des interactions de protéine par l’analyse subcomplexes et modules d’interaction stable. Réticulation, d’autre part, fournit une information sur les sites de contact directs. Selon l’agent utilisé, une certaine souplesse peut ou doit être incluse dans l’analyse.
Les protocoles fournis sont en général facile à effectuer et pas beaucoup de temps. L’ensemble du protocole peut être exécuté dans une semaine et peut être appliqué à presque tous les complexes de protéine, bien qu’une certaine quantité de la protéine complexe est nécessaire pour l’analyse réussie. Préparation de l’échantillon est simple et ne nécessite pas spécifiquement des complexes de protéine purifiée. Toutefois, un piège commun est la contamination de l’échantillon au cours de la préparation des échantillons pour l’identification des protéines basé sur la spectrométrie de masse. Ces contaminations dans la plupart des cas comprennent les kératines qui proviennent de la poussière, la peau et les cheveux. Par conséquent, supplémentaires comme le port de gants et blouses, filtrant les tampons aqueux et l’utilisation de solvants de grande pureté il faut au cours de la préparation des échantillons pour l’identification des protéines basé sur la spectrométrie de masse. Autres protéines contaminantes telles que les accompagnateurs sont généralement introduites au cours de la purification des protéines, par exemple, lors de l’utilisation de balises d’affinité. Dans ces cas, purification des protéines doit être améliorée, par exemple en augmentant les étapes de lavage. Dans tous les cas, des contaminations de protéines dans l’échantillon sont facilement identifiées lors de la recherche de la base de données en omettant le filtre de la taxonomie (c.-à-d.la recherche contre les protéines de toutes les espèces). Si seulement quelques peptides sont observés (c'est-à-dire, une couverture de faible teneur en protéines pourrait être obtenue), même si l’échantillon suffisant est disponible, il pourrait être nécessaire d’utiliser une protéinase différente au cours de la digestion. En général la trypsine donne un nombre suffisant de peptides ; Toutefois, dans certains cas par exemple de protéines membranaires ou domaines membranaires des protéines, le nombre de sites de clivage trypsique est réduit et autres enzymes ciblant des acides aminés hydrophobes sont un meilleur choix.
En ce qui concerne l’instrumentation, un instrument particulièrement mis à jour l’est nécessaire pour la spectrométrie de masse native qui maintient les interactions non covalentes lors du transfert dans la phase gazeuse. Plusieurs types d’instruments ont été introduits, y compris les instruments Q-ToF et Orbitrap valant. Tandis que les spectromètres de masse mis à jour le Q-ToF sont disponibles dans le commerce pour la spectrométrie de masse native depuis plusieurs années, celles-ci ont été introduites que récemment et dans la plupart des cas nécessite la modification spécialisées45. Toutefois, l’application des instruments à haute résolution a permis l’étude de liaison des ligands multiples et leur quantification46,47 et est prometteuse pour les futures applications.
Pour identifier les di-peptides réticulés par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide, les procédures standard avec quelques modifications peuvent être appliquées. Cependant, la recherche de la base de données est le facteur limitant car un logiciel spécialisé peut rarement traitent de grandes bases de données et des bases de données réduits contenant les sous-unités protéiques des complexes sont nécessaires. Des études récentes utilisé la spectrométrie de masse-CLIVABLES agents ciblant les interactions de protéine dans la cellule entière lysats48,49. L’utilisation d’agents chimiques qui se fragmentent pour la plupart dans des expériences de spectrométrie de masse tandem cède peptides linéaires (modifiés par l’agent), qui peuvent être identifiés par une nouvelle fragmentation et base de données, la recherche de peptides linéaires et cela réduit temps de recherche et de l’espace de recherche computationnelle. Cependant, pour effectuer ces expériences, un analyseur de masse piège ionique ou un spectromètre de masse hybride avec un piège ionique est requis. En général, comme les faux positifs sont une question importante, des spectres de masse de peptides réticulés souvent se valident manuellement par la qualité de leurs spectres de fragment qui étend énormément les temps d’analyse de données. Conçoit des systèmes de notation robustes qui peuvent être appliquées sans autres étapes de validation sont donc possibles applications futures. Une façon d’améliorer l’analyse des données et de réduire le nombre de faux positifs a été l’introduction de calculs de taux de fausse découverte et leur application aux ensembles de données50de réticulation.
En général, les techniques décrites ici peuvent être complétés avec d’autres techniques de spectrométrie de masse (par exemple, le marquage covalent) pour augmenter le rendement de l’analyse. Autres modifications et améliorations des protocoles peuvent être facilement mis en œuvre. Ainsi comparative réticulation34 dénoue les changements conformationnels dans l’assemblage des protéines. Évolution de la situation en spectrométrie de masse native aujourd'hui permettre l’analyse des protéines de membrane51,52 et leurs interactions avec les lipides28,52,,du5354 . Nouveaux développements de spectromètres de masse haute résolution pour la spectrométrie de masse native ont étendu l’application et de liaison du ligand, par exemple, liaison des lipides aux protéines de la membrane, peuvent maintenant être inclus dans l’analyse de45, 46. en combinaison avec des approches de modélisation informatique, ces techniques peuvent offrir des modèles structuraux de la variation de résolution55. Si aucune structures cristallines ne sont disponibles pour les sous-unités simples ou complexes intactes, spectrométrie de masse peut fournir des premiers aperçus des interactions de protéine et la topologie du complexe inconnue. Selon les techniques utilisées et les résultats obtenus, les modèles basse résolution du complexe inconnu peuvent être obtenus56,57,58. Si les structures cristallines ou modèles d’homologie sont disponibles, les informations structurelles a reçu de la spectrométrie de masse peuvent produire des modèles même quasi native59.
En comparaison avec d’autres techniques structurelles, spectrométrie de masse a l’avantage qu’il nécessite des quantités d’échantillon faible, il peut traiter les échantillons hétérogènes et s’applique à des complexes protéiques de taille illimitée. En outre, la spectrométrie de masse permet l’étude des systèmes dynamiques de protéines. Des populations différentes de la protéine ou une protéine complexe qui existent en solution sont généralement analysées ensemble et donc, à la différence avec d’autres techniques structurelles qui nécessitent la sélection de certaines populations, toutes les conformations sont maintenues pendant analyse et sont imposable dans une expérience. Approches quantitatives de réticulation ont été récemment introduites34,60,61 et sont prometteurs pour de futures applications décrivant les changements conformationnels dans des conditions différentes.

L’enquête structurelle des ensembles de protéines est devenu particulièrement important pour la compréhension des processus cellulaires. Par conséquent, beaucoup, des techniques ont été développés et améliorés en biologie structurale1. Toutefois, ces techniques sont parfois limitées dans leur application en raison de la taille, souplesse ou hétérogénéité des complexes protéine incriminés. Spectrométrie de masse peut faire face à ces défis et, par conséquent, a émergé comme un outil puissant en biologie structurale2,3,4,5. Le plus grand avantage de la spectrométrie de masse, cependant, est la capacité d’identifier sans ambiguïté les protéines même dans des mélanges complexes et hétérogènes,6. À cette fin, les protéines sont digérées habituellement avec les endoprotéinases et le mélange de peptides qui en résulte est séparé par chromatographie liquide et élué directement dans le spectromètre de masse. Masses de peptide sont déterminés par la suite et les ions précurseurs sont choisies pour plus de fragmentation des peptides. Protéines sont identifiées puis par la recherche de peptide et masses correspondantes de fragment contre une base de données connue. Cette procédure permet non seulement l’identification des peptides/protéines, mais aussi leurs modifications post-traductionnelles qui provoquent un déplacement de masse des ions fragments transportant la modification7et les peptides de précurseur. Certaines des nombreuses techniques en spectrométrie de masse structurelle sont basés sur ce principe4,8. Par exemple, étiquetage des techniques telles que l’hydrogène deutérium échange9,10, chimique étiquetage stratégies11,12, ou le radical hydroxyle pied impression13,14 , donner des aperçus de l’accessibilité de surface des protéines sous certaines conditions.
Une autre technique est la réticulation impliquant la liaison covalente d’acides aminés à proximité par le biais de leurs groupes fonctionnels (chimique). Pour ce faire, des réactifs chimiques, réactifs UV-activable ou acides aminés sont indépendants15,16. Après réticulation, les protéines sont hydrolysées habituellement avec des protéases et réticulés di-peptides sont analysés par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide. L’identification des produits réticulation par base de données, la recherche, cependant, nécessite l’utilisation d’un logiciel spécialisé qui concatènent des séquences peptidiques de diverses protéines et régions disparates17,18,19. L’utilisation d’agents chimiques a l’avantage qu’elle peut être utilisée pour presque chaque complexe de protéine d’intérêt et ne nécessite pas l’incorporation des acides aminés activable par UV, qui ne peut être atteint en exprimant la protéine d’intérêt dans les cellules hôtes. Par conséquent, la réticulation est un outil polyvalent et a été utilisée avec succès dans de nombreuses études structurales des protéines même de grandes assemblées20.
Spectrométrie de masse des complexes de protéine intacte (parfois appelé « indigène » spectrométrie de masse), d’autre part, implique l’analyse des protéines intactes et des complexes de protéine sans hydrolyse en peptides. Il révèle la composition, l’hétérogénéité, stoechiométrie, topologie et les interactions de sous-unité de protéines complexes21,22. En combinaison avec mobilité ionique, spectrométrie de masse native plus permet la détermination de leur conformation23,24. Ce qui rend un outil puissant pour l’enquête structurelle des complexes protéiques qui sont difficiles à évaluer par des techniques structurelles conventionnelles. Spectrométrie de masse native exige toutefois des tampons d’analyse qui tiennent des interactions non-covalentes de protéines au cours de l’ionisation par électronébulisation. Ceci est généralement obtenu en utilisant des tampons aqueux, volatils tels que de l’acétate d’ammonium25. En outre, les modifications de l’instrument sont nécessaires pour prévenir la dissociation lors de la transmission dans la phase gazeuse du spectromètre de masse à26. Appliqué de cette façon, de nombreux complexes de protéine (grand) ont été analysés. Exemples impressionnants sont les études de ribosomes intact27, ATP synthases28ou virus29.
La combinaison de la spectrométrie de masse native et réticulation s’est avérée particulièrement efficace dans des études antérieures. Par exemple, les stoechiométries de complexes de chaperon, y compris un dimère Hsp70 inattendu, pourraient être obtenues à partir des expériences de spectrométrie de masse des complexes des protéines intactes, pendant réticulation chimique a révélé les arrangements des protéines dans le assemblys30,31. Dans une autre étude, nous avons étudié les effets des modifications post-traductionnelles sur une ATP synthase intact en complexe. Spectrométrie de masse native a fourni des renseignements sur la stabilité des protéines complexes en présence ou en absence de phosphorylation ou l’acétylation32,33. Un comparatif de stratégie réticulation34 révèle alors des changements de conformation de la protéine complexe dans les différentes conditions.
Ici, nous fournissons les protocoles pour l’identification des protéines par spectrométrie de masse, réticulation (chimique) et spectrométrie de masse indigène, y compris l’analyse des données et définitions (Figure 1). La combinaison complémentaire résultats tirés de ces méthodes à l’aide de deux complexes de protéines bien caractérisé est démontrée35. Notre protocole peut être appliqué à tout assemblage de protéines qui peut être épuré à certaine pureté et la concentration. L’approche est parfois limité par l’analyse des données de réticulation des données, c'est-à-direla taille de la base de données Employee, qui détermine le temps et l’espace de recherche requis. En outre, la validation manuelle des réticulations identifiées est souvent nécessaire et réduit encore davantage la sortie. Spectrométrie de masse native est surtout limitée par la qualité de l’échantillon, par exemple, tampons et adduits utilisé au cours de la purification et la possibilité des pour échanger par tampons aqueux et volatiles. Toutefois, des complexes de protéine purifiées pour l’analyse structurale habituellement ont la qualité requise pour l’analyse réussie avec nos protocoles.

<table><tbody><tr><td><fort>Produits chimiques, Réactifs, Consommables</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]acide éthanesulfonique (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>tampon Acide acétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Acétonitrile Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrifuge dispositifs (différents MWCO)</td><td>Millipore</td><td>, c’est-à-dire UFC500396</td><td>échange de tampon, concentration,</td></tr><tr><td>solution d’acétate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>native</td></tr><tr><td>MS Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>digestion en gel</td></tr><tr>Solution<td>d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>réticulant</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>réticulant</td></tr><tr><td>Iodure de césium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203033</td><td>étalonnage</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td> digestion <td>en gel</td></tr><tr><td>Capillaires (1,0 OD & fois ; 0,78 ID & fois ; 100 L mm)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>30-0038</td><td>MS natif</td></tr><tr><td>Sous-éthylène disuccinimidyle (DSS)</td><td>Réticulant</td> <td>Thermo Scientific</td><td>21655</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>digestion en gel</td></tr><tr><td>DMSO (sulfoxyde de diméthyle)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Acide formique Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>supplément de solvant</td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie solution de coloration</td><td>expedeon</td><td>ISB1L</td><td>solution de coloration pour électrophorèse</td></tr><tr><td>sur gel Invitrogen NuPAGE 4-12 % Bis-Tris gels (1 mm, 10 puits)</td><td>technologies de vie</td><td>NP0323BOX</td><td>électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Digestion dans le gel</td></tr><tr><td>Alcool isopropylique, grade HPLC</td> Fisher <td>Chemicals</td><td>P750717</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6 colonnes</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>échange de tampon</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxydant</td><td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td>tampon courant, électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 & fois ;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>tampon de chargement d’échantillon (non réducteur) pour électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running</td><td>buffer life technologies</td><td>NP0001</td><td>électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running</td><td>buffer life technologies</td><td>NP0001</td><td>électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>NuPAGE Agent réducteur d’échantillon (10 &times ;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0004</td><td>Agent réducteur pour électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>PBS - solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>tampon SeeBlue Plus2 Marqueur protéique standard précoloré</td><td>invitrogen</td><td>LC5925</td><td>pré-coloré Marqueur protéique pour électrophorèse</td></tr><tr><td>sur gel Acétate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>précipitation d’éthanol</td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>tampon</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td><td>Digestion en gel</td></tr><tr><td>Vivaspin Dispositifs centrifuges (différents MWCO)</td><td>Sartorius</td><td>i.e. VS0101</td><td>échange de tampon, concentration</td></tr><tr><td>Eau pour HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>solvant</td></tr><tr><td><fort>Nom</fort></td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Heraeus Fresco 21, centrifugeuse de paillasse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes Flaming / Brown Modèle P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de gelélectrophorèse Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold Coater Quorum Q150R S</td><td>Quorum Technologies Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de gel horizontal Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse Q-TOF Ultima, MS Vision Mise à niveau de la masse élevée</td><td>Waters (Micromass)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>inversion de phase C18 Acclaim PepMap (C18, 75 mm de diamètre intérieur, 50 cm, taille des pores de 3 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>pré-colonne C18 en phase inverse (C18, 150 mm de diamètre intérieur, 2 cm, taille des pores de 5 mm)</td><td>Bistouri 164213</td><td></td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac SPD121P</td> centrifugeuse <td>sous vide Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons USC-TH, bain de sonication</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Système nano-LC UltiMate Dionex 3000, couplé au spectromètre de masse hybride Q-Exactive plus (source nano-ESI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise<</td><td>strong>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software, Software Tools, Database search</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outil de conversion pXtract</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Méthodes 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinant la réticulation chimique et spectrométrie de masse des complexes de protéine intacte pour étudier l’architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Les protéines interagissent avec leurs ligands aux assemblées de forme active et dynamique qui exercent diverses fonctions cellulaires. Il est donc fondamental pour la compréhension des processus cellulaires d’élucider ces interactions. Cependant, de nombreux complexes de protéine sont des assemblys dynamiques et ne sont pas accessibles par des techniques structurelles conventionnelles. Spectrométrie de masse contribue à l’enquête structurelle de ces assemblées, et particulièrement la combinaison de différentes techniques de spectrométrie de masse fournit des renseignements précieux dans leur agencement structurel.
Dans cet article, nous décrivons l’application et la combinaison de deux techniques complémentaires de spectrométrie de masse, à savoir réticulation chimique couplée à la spectrométrie de masse et spectrométrie de masse native. Réticulation chimique implique la liaison covalente d’acides aminés à proximité en utilisant des réactifs chimiques. Après digestion par les protéases, réticulés di-peptides sont identifiés par spectrométrie de masse et sites des interactions entre protéines sont à découverts. Spectrométrie de masse native est en revanche l’analyse des ensembles de protéines intactes en phase gazeuse d’un spectromètre de masse. Il révèle les stoechiométries de protéines ainsi que des interactions protéiques et de ligand. Les deux techniques fournissent donc des informations complémentaires sur la structure des assemblages de protéine-ligand et leur combinaison s’est avérée puissante lors d’études antérieures.

L’analyse structurale des protéines et les complexes qu’ils forment est fondamentale pour comprendre leur fonction. Spectrométrie de masse contribue considérablement à l’enquête structurelle qu’elle peut être appliquée à presque chaque complexe d’intérêt indépendamment de leur taille ou l’hétérogénéité de l’échantillon. Nous illustrent bien le protocole à l’aide de deux complexes de protéines bien caractérisée ; tout d’abord, l’hétéro-dodécamère RvB1/B2 de c. thermophilum et d’autre part, la CPS hétéro-et complexe d’e. coli.
Tout d’abord, nous avons identifié les constituants protéiques des deux complexes. Pour ce faire, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE (Figure 2) et bandes de gel ont été taillés dans le gel. Après la digestion des protéines en gel, le mélange de peptides a été analysé par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide et masses de peptide et de fragment ont été soumis à la recherche de base de données. Suite à ce flux de travail, nous avons identifié toutes les sous-unités protéiques des deux complexes avec le degré de confiance élevé, c'est-à-direun grand nombre de peptides avec des scores de peptide raisonnable a été observé ce qui donne une couverture pour toutes les sous-unités protéiques (tableau 1 séquence très ).
Ensuite, nous avons analysé le complexe B2/RvB1 intact par spectrométrie de masse native (Figure 3 a). Le spectre de masse a révélé deux espèces, une à environ 8 000 m/z et une autre espèce à environ 11 000-12 000 m/z. Les masses calculées pour ces espèces correspondent à la hexamériques (RvB1)3(RvB2)3 bague (environ 310 kDa) et le dodécamères double-anneau (RvB1)6(RvB2)6 (environ 620 kDa). Les deux séries de crête montrent deux populations ; ils proviennent d’un mélange de sous-unités de RvB2 son marqués et non marqués dans les complexes. Une structure en cristal pour le complexe RvB1/B2 a été précédemment obtenue36 et montre l’arrangement de la double-anneau (Figure 3 b). Le spectre de masse natif confirme donc la stoechiométrie de la dodécamère intact et révèle en outre un complexe stable sous. En outre, les populations coexistants sont identifiées.
Pour identifier les sites d’interaction de protéine dans le complexe RvB1/B2, nous réticulé chimiquement le complexe purifié avec réticulant BS3. Nous avons tout d’abord titré la quantité de BS3 lors de la réaction de réticulation pour déterminer la concentration optimale. BS3 est amine spécifique et par liaison covalente des chaînes latérales lysine liens ainsi que les extrémités N-terminales des protéines. La réaction croisée a été suivie par SDS-PAGE (Figure 2 a). Le complexe non réticulé a montré des sous-unités fois RvB1 et RvB2. Ajouter BS3 au milieu réactionnel causé une liaison covalente des protéines résultant dans les bandes de protéines à poids moléculaire plus élevé. Le gel SDS montre que des quantités croissantes de BS3 produisent des quantités plus élevées d’espèces réticulés tandis que les sous-unités protéiques non réticulé sont réduites. Nous avons ensuite couper les bandes de protéines du gel et suivi le protocole fourni ci-dessus pour identifier les sites d’interaction de protéine. Un spectre d’exemple d’un di-peptide réticulé apparaît (Figure 3). Le spectre montre la série y-ion des deux peptides confirmant cette interaction de la protéine. Au total, nous avons obtenu des interactions protéine 14, y compris quatre liaisons transversales entre les sous-unités RvB1 et RvB2 et deux liens croisés entre les deux exemplaires de RvB2 (tableau 2). Les résultats de BS3 réticulation sont visualisées dans un réseau d’interactions (Figure 3D) montrant des interactions intra moléculaires ainsi que des interactions entre les sous-unités différentes. Liaisons transversales intra moléculaires suggèrent que les sous-unités fois RvB1 et RvB2 plier de façon que les domaines N - et C-terminaux sont à proximité. Notez qu’interactions intra moléculaires ne peuvent être distinguées de leurs interactions de la sous-unité même dans ce cas. Leurs liens croisés entre les deux sous-unités ont aussi été observés. Parmi ceux-ci, deux liens inter moléculaires croisés entre RvB1 et RvB2 pourraient être visualisées dans la structure de valider l’approche de réticulation. Les autres liaisons transversales inter moléculaires sont situés dans des boucles souples qui ne figurent pas dans la structure cristalline. Nous avons aussi identifié deux liaisons transversales à RvB2 contenant les mêmes séquences peptidiques. Ces réticulations sans ambiguïté peuvent être classées comme inter moléculaires comme elles doivent provenir de deux copies de la même protéine (Figure 3D). Nos expériences de réticulation révèlent des sites d’interaction de protéine au sein du complexe, mais aussi dans les sous-unités de protéine fournit des aperçus de leur agencement structurel qui pourrait également être confirmée par la structure existante de cristal (Figure 3 b).
Le deuxième complexe de protéine que nous avons étudié était CPS. Le spectre de masse natif (Figure 4 a) a révélé trois complexes protéiques entre 6 000 et 12 000 m/z. Le plus grand complexe de 640 kDa correspond à l’hétéro-octamère intact. Les petits complexes représentent deux complexes sous ; le dimère de petites et grandes sous-unités CPS (160 kDa) et un hétéro-tétramère contenant deux exemplaires de chaque sous-unité (320 kDa). Ces complexes sous livrer les premiers aperçus de l’Assemblée de la protéine ; par exemple, les grandes et petites sous-unités sont en contact direct (comme l’a révélé l’hétéro-dimères) et le tétramère peut être un produit de deux dimères. Pour obtenir plus d’information sur l’arrangement structurel dans la complexe de CPS intacte, nous avons effectué la spectrométrie de masse tandem (MS/MS) de l’hétéro-octamère et hétéro-tétramère. Dans les deux cas, la petite sous-unité dissociée le précurseur, ce qui suggère que la petite sous-unité est située dans la périphérie de l’Assemblée (Figure 4 b). En effet, la petite sous-unité est périphérique dans le cristal disponibles structure (Figure 4)44.
Réticulation chimique utilisant le réticulant BS3 a également été effectuée. À l’aide de quantités croissantes, la liaison covalente des sous-unités CPS a été améliorée. Après la digestion des protéines et l’analyse des peptides comme décrit ci-dessus, de nombreuses interactions de protéine au sein de la grande sous-unité et un pontage dans la petite sous-unité ont été obtenues (tableau 2). En outre, tout comme le complexe RvB1/B2, nous avons trouvé deux liens inter moléculaires croisés entre deux copies de la grande sous-unité de la CPS. Ces réticulations placer deux sous-unités grandes face à face à leurs côtés de C-terminal. Dans une étude antérieure, combinant la spectrométrie de masse structurelle et la modélisation informatique35, nous avons identifié trois interactions supplémentaires dans la grande sous-unité, qui très probablement sont créés depuis l’interface de deux copies de la grande sous-unité validés par le la structure cristalline et le modèle obtenu (Figure 4 et tableau 2). Ces interactions permettent l’arrangement du noyau CPS complexe composé de quatre grandes sous-unités. Toutefois, aucun inter-sous-unité des liens croisés entre les petites et les grosses sous-unités ont été observés. En inspectant la structure du cristal disponibles (Figure 4), il devient évident que la surface de l’interaction entre le noyau tétramère de ce complexe, composé de la grande sous-unité et les sous-unités de petites périphériques est très faible, ce qui pourrait expliquer l’absence d’interactions entre sous-unités. Ceci est confirmé par spectrométrie de masse native qui a montré que la petite sous-unité se dissocie facilement des complexes intacts très probables due à une interface de liaison petit. Néanmoins, les interactions de protéine dans le CPS complexe combiné de réticulation chimique et spectrométrie de masse native permettent de déduire leur arrangement structural (Figure 4).
Pris ensemble, la combinaison de la spectrométrie de masse native et réticulation chimique couplée à une identification par spectrométrie de masse de peptides réticulés, permet de reconstitution de l’entente structurelle des deux complexes de l’exemple. Réticulation chimique a révélé l’arrangement des sous-unités protéiques, par exemple les interactions entre RvB1 et RvB2 ou dans le noyau tétramère de CPS, spectrométrie de masse native livré stoechiométries de protéine des complexes intacts et subcomplexes courantes. Dans le cas de la CPS, pour qui aucune leurs interactions entre les deux sous-unités ne pourraient être observées par réticulation chimique, spectrométrie de masse native suggère que chaque grande sous-unité interagit avec une petite sous-unité (Figure 4). Spectrométrie de masse a proposé la situation périphérique de la petite sous-unité dans le complexe et une petite interface entre les deux sous-unités.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figure 1 : flux de travail de la spectrométrie de masse native et réticulation. Les deux techniques de livrer des résultats complémentaires. Alors que la spectrométrie de masse native dévoile stoechiométries et modules d’interaction, réticulation donne des indications sur les sites d’interaction de protéine dans les complexes. Notez que seulement de réticulation chimique révèle des interactions binaires. (A) la première étape en spectrométrie de masse native est change de tampon sur un buffer volatil et aqueux à l’aide de blocs filtrants ou colonnes de gel filtration. Spectrométrie de masse des complexes des protéines intactes révèle alors leur stoechiométrie. Dans des expériences de spectrométrie de masse en tandem, sous-unités périphériques sont dissociées. (B) pour la réticulation chimique, le complexe protéique est incubé avec un réactif de réticulation. Les protéines réticulées sont ensuite digérées en peptides qui sont ensuite analysés par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figure 2 : SDS-PAGE de réticulé complexes RvB1/B2 (A) et CPS b. (A) 2,5 µM RvB1/B2 ont été chargés par voie de gel. La concentration de BS3 a été variée. Non réticulé RvB1/B2 montre les sous-unités de deux protéine à environ 50 kDa. Ajout de BS3 causé une liaison covalente des sous-unités protéine résultant dans les bandes de protéines à poids moléculaire plus élevé. Le montant des espèces réticulés est augmenté avec des concentrations plus élevées de BS3. Des conditions optimales de réticulation sont en surbrillance (rouge). (B) 10 µM CPS ont été chargés par voie de gel. Le grand (90 kDa) et petit (40 kDa) on obtient des sous-unités de la CPS. Ajout de BS3 causé une liaison covalente des sous-unités protéine résultant dans les bandes de protéines à poids moléculaire plus élevé. Des conditions optimales de réticulation sont en surbrillance (rouge). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figure 3 : spectrométrie de masse Native et réticulation chimique des RvB1/B2 complexes. (A), le spectre de masse natif révèle deux espèces de RvB1/B2 ; le dodécamère intact (c.-à-d., (RvB1)6(RvB2)6) à environ 11 000 à 12 000 m/z et le hexamérique anneau (RvB1)3(RvB2)3 , à environ 8 000 m/z. Les deux espèces montrent deux populations résultant de son marqués et non marqués RvB2. Le spectre a été modifié par35. Structure (B), le cristal de RvB1/B2 est montré (PDB ID 4WVY). Alternance de RvB1 et RvB2 sous-unités forment deux anneaux hexamérique. (C) spectre de Fragmentation d’un di-peptide réticulé. L’extrémité N-terminale de RvB1 a été réticulé avec K23 de RvB1. série y-ion ont été obtenus pour les deux peptides (rouge et cyan). (D) Intra - et inter - protein interactions obtenues dans le complexe RvB1/B2. Intra-cross-liens apparaissent en rouge, inter-cross-links sont indiqués en bleu. L’encart montre deux liens inter moléculaires croisés entre les sous-unités RvB1 et RvB2 qui pourraient être visualisées dans la structure cristalline (verte, insertion). Les interactions qui proviennent de deux copies de RvB2 sont affichées sous forme de lignes pointillées bleues. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figure 4 : spectrométrie de masse Native et réticulation chimique des CPS. (A), le spectre de masse natif de CPS montre trois complexes. L’hétéro-dimères (160 kDa), Hétéro-tétramère (320 kDa) et l’hétéro-octamère (640 kDa). Le spectre a été modifié par35. (B) spectrométrie de masse de la dissociation révélée complexe CPS de la petite sous-unité de CPS, tétramère et et. (C), le crystal structure du CPS est montré (PDB ID 1BXR). Les grosses sous-unités forment un noyau tétramère et les petites sous-unités sont situées à la périphérie du complexe. Leurs liens croisés entre les deux copies de la grande sous-unité apparaissent (verts). (D) les Interactions des sous-unités CPS petites et grandes. Spectrométrie de masse native a révélé subcomplexes et suggère une situation périphérique de la petite sous-unité. Réticulations chimiques indiquent des arrangements dans le noyau tétramère de CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : résultats de recherche de base de données. Les protéines ont été identifiés par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide et la recherche de base de données. Les noms de protéine, d’adhésion nombre et description comme protéine de masse sont donnés. Le score de protéine, nombre de spectres observés par les protéines et le nombre de séquences peptidiques observées sont répertoriés. Les cinq peptides avec les meilleurs scores de peptides mascotte sont répertoriés pour chaque sous-unité protéique. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau 2 : liaisons transversales observées en RvB1/B2 et CPS. Les sous-unités des complexes et les résidus réticulés sont données. Le type de pontage (intra - ou inter moléculaires) a été révélé de chevauchement des séquences peptidiques ou une précédente étude35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

L’architecture des complexes protéiques est essentiel pour leur fonction. Combinant différentes techniques de spectrométrie de masse s’est avérée puissante pour étudier leur assemblage. Nous fournissons des protocoles pour la réticulation chimique et spectrométrie de masse native et montrer comment ces techniques complémentaires contribuer à élucider l’architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques.

Combinant la réticulation chimique et spectrométrie de masse des Complexes de protéine intacte pour étudier l’Architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

L’objectif global de la combinaison de la réticulation avec la spectrométrie de masse native est d’obtenir des informations structurelles complémentaires sur les assemblages de protéines multi-sous-unitaires, ce qui aide à élucider leur arrangement tridimensionnel. La réticulation chimique et la spectrométrie de masse native aident à répondre à des questions clés en biologie structurale telles que la composition, la connectivité et la stœchiométrie. Le principal avantage de combiner plusieurs techniques est d’obtenir des informations complémentaires qui ne sont pas disponibles avec une seule technique.Notre flux de travail peut être appliqué à n’importe quel autre complexe protéique. Il peut être purifié à partir de sels ou de tissus ou qui peut être reconstitué à partir de protéines purifiées. Tout d’abord, appliquez 7,5 microlitres de tampon simple à quatre fois et trois microlitres d’agent réducteur à 10 fois sur le complexe protéique souhaité.Faites tourner l’échantillon pendant une minute à 16, 200 fois la gravité. Après la centrifugation, chauffez l’échantillon pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius. Préparez un gel de gradient de quatre à 12 % pour l’électrophorèse et placez le gel dans la chambre d’électrophorèse.Diluez 20 fois le tampon de coulée préalablement préparé avec de l’eau et remplissez la chambre d’électrophorèse. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre d’antioxygène dans la chambre intérieure. Chargez un marqueur protéique approprié dans la première cavité du gel et les échantillons de protéines dans les cavités restantes.Ensuite, séparez les protéines pendant la durée appropriée à 200 volts. Pour colorer les bandes protéiques, transférez le gel dans une boîte de coloration de gel et recouvrez le gel d’une solution sur pied de Coomassie à base d’eau. Incuber le gel pendant la nuit à température ambiante sur un agitateur de gel horizontal.Le lendemain, détachez le gel en remplaçant la solution de coloration par de l’eau. Répétez l’étape précédente environ trois à cinq fois jusqu’à ce que le fond de gel apparaisse clair. Maintenant, coupez les bandes de protéines qui sont visualisées par la coloration bleue de Coomassie des gels à l’aide d’un scalpel.Coupez soigneusement les bandes de protéines en petits morceaux d’environ un millilitre. Ensuite, lavez les bandes protéinées avec de l’eau et de l’acétonitrile. Réduire les liaisons disulfure avec le DTT, puis alkyler les résidus de cystéine avec de l’iodoacétamide.Ensuite, digérez les protéines avec de la trypsine comme décrit dans le protocole de texte. Pour extraire les peptides, incubez les morceaux de gel avec du bicarbonate d’ammonium et de l’acétonitrile et collectez le surnageant contenant des peptides. Ensuite, incubez les morceaux de gel avec de l’acide formique à 5 % et de l’acétonitrile et collectez le surnageant contenant du peptide.Après avoir recueilli le surnageant contenant le peptide, combinez les deux surnageants et séchez les peptides extraits en évaporant les solvants dans une centrifugeuse à vide. Une fois que les peptides sont secs, mélangez-les avec 20 microlitres de solution d’acétonitrile à 2 % et d’acide formique à 0,1 %. Dissoudre les peptides avec un bain de sonication pendant deux à trois minutes.Ensuite, faites tourner l’échantillon dans une centrifugeuse à 16, 200 fois la gravité pendant 30 minutes. Après avoir transféré l’échantillon dans un flacon d’échantillonneur automatique, injectez cinq microlitres dans un système nano LC-MS/MS et chargez le mélange de peptides sur une pré-colonne C18 en phase inverse pour dessaler et concentrer les peptides en ligne. Retirez la mémoire tampon de stockage d’une colonne de centrifugation à 1 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant une minute.Après avoir jeté le flux, laver la colonne trois fois en ajoutant 500 microlitres d’acétate d’ammonium de 200 millimolaires suivi d’une centrifugation. Après la centrifugation, chargez 20 microlitres de l’échantillon de protéines sur la colonne et centrifugez-le à 1 000 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Maintenant, placez un capillaire recouvert d’or préalablement préparé dans un support capillaire.Ouvrez la pointe d’une aiguille et remplissez le capillaire avec un à quatre microlitres d’échantillon de protéines. Connectez le support capillaire à la source de nano électronébulisation du spectromètre de masse et positionnez l’extrémité du capillaire à 0,5 à 1,5 centimètre de l’orifice du cône. Utilisez 80 à 150 litres de gaz nanoflow par heure pour initier la pulvérisation et ajustez le débit de gaz pour maintenir une pulvérisation stable.Ajustez les paramètres et la page d’accord de l’instrument Q-TOF. Ensuite, lancez l’acquisition en cliquant sur le bouton Acquérir et combinez autant de balayages que possible pour obtenir un bon spectre de masse. Dissoudre 1,43 milligramme de BS3 et 100 microlitres d’eau pour préparer une solution mère de 25 millimolaires.Ensuite, ajoutez BS3 au complexe protéique. Utilisez des quantités variables de BS3 pour identifier la concentration optimale de réticulant. Incuber les mélanges réactionnels à 25 degrés Celsius pendant une heure dans un thermomélangeur.Maintenant, effectuez la page SDS des protéines réticulées avec un gel à gradient de quatre à 12 %. Coupez les bandes de gel et digérez la protéine par digestion dans le gel comme décrit précédemment. Après avoir obtenu les peptides par digestion dans le gel, effectuer une spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide comme décrit précédemment.Toutes les sous-unités protéiques de l’hétérododécamère RvB1/B2 et des complexes hétérooctamères CPS ont été identifiées avec un niveau de confiance élevé. Le spectre de masse de RvB1/RvB2 révèle deux espèces qui correspondent aux doubles cycles hexamériques et dodécamériques. Une structure cristalline pour le complexe RvB1/B2 montre la disposition du double anneau.L’ajout de BS3 au complexe RvB1/RvB2 provoque une liaison covalente des protéines, ce qui entraîne des bandes de protéines de poids moléculaire plus élevé. Et des quantités croissantes de BS3 produisent des quantités plus élevées d’espèces réticulées, tandis que les sous-unités protéiques non réticulées sont réduites. Le spectre des dipeptides réticulés montre une série d’ions Y des deux peptides, confirmant cette interaction protéique.Les résultats de la réticulation de BS3 sont visualisés dans un réseau d’interactions montrant les interactions intramoléculaires ainsi que les interactions entre différentes sous-unités. Le spectre de masse natif de CPS montre l’hétérodimère, l’hétérotétramère et l’hétérooctamère. La spectrométrie de masse en tandem des CPS tétramique et octamérique révèle une dissociation de la petite sous-unité CPS.La réticulation chimique de la CPS avec la réticulation BS3 montre plusieurs réticulations intramoléculaires entre deux copies de la grande sous-unité de la CPS. La structure cristalline révèle que la surface d’interaction entre le noyau tétramique et les petites sous-unités périphériques est très petite, ce qui pourrait expliquer l’absence d’interactions entre sous-unités. Une fois maîtrisé, notre flux de travail peut être effectué une semaine s’il est exécuté correctement.Comme l’assemblage des protéines est trop complexe, il faut plus de temps pour l’analyse des données. Suite à cette procédure, une modélisation informatique peut ensuite être effectuée pour obtenir des modèles tridimensionnels des complexes protéiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de réticulation chimique et de spectrométrie de masse native jusqu’à ce que ces deux techniques complémentaires aident à élucider les structures des assemblages de protéines.

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