Name: Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver les cellules stromales de la moelle osseuse de souris. Cette méthode rapide et reproductible permet d'obtenir des progéniteurs pour la différenciation ostéoblastique et adipocytaire.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01 AR061164-01 a 1).

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Institut de recherche Centre médical du Maine et d’institutionnels animalier.
1. collection de Tubes de préparation
<ol><li>Rendre les milieux de culture BMSC en complétant un milieu Minimum essentiel α (α MEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de la pénicilline/streptomycine.</li>
	<li>Déposer 100 µL de milieux de culture BMSC en tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. 3 OS correspondront généralement à un tube unique afin de préparer en conséquence.</li>
	<li>Couper les extrémités de 200 pointes de pipette µL, assez pour qu’ils s’insèrent dans les tubes à centrifuger. Insérez les extrémités à l’intérieur des tubes et faire en sorte que les couvercles peuvent fermer avant de placer les tubes sur la glace. Remarque : Vous pouvez également tubes de microcentrifuge de 0,75 mL avec les extrémités coupées peuvent être insérés dans le tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
</ol>2. récolte des os des souris
<ol><li>Euthanasier les animaux à l’aide de CO2 suivi par dislocation cervicale et pulvériser avec l’éthanol à 70 %. Remarque : S’assurer que les animaux de même sexe et de préférence du même âge est utilisés. Nous utilisons systématiquement des animaux âgés de 7 à 8 semaines. Nous recommandons la mise en commun des cellules provenant d’au moins 3 animaux par groupes expérimentaux pour produire une population de cellules représentatifs et reproductibles mieux.</li>
	<li>
Placez la souris euthanasiée sur le dos sur une planche de dissection. Forceps permet de créer une tente de peau sur l’abdomen. Faire une petite incision (environ 1 cm) à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Peler la peau vers les membres et les pieds de la coupe afin d’exposer le bas-ventre et les jambes.
	<ol>
<li>Couper sous la cheville mixte pour enlever le pied. Découper le long de la crête iliaque, au niveau des hanches pour séparer la tête du fémur de l’os iliaque. Alors que la souris est toujours sur le dos, faites une incision au milieu de l’os iliaque pour séparer les deux OS iliaques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l’aide de chiffons non pelucheux, retirer délicatement le muscle de la fémurs, tibias et OS iliaques. NOTE : Couper autant de tendons et les muscles de l’os comme le rend possible le nettoyage plus rapide et plus facile avec les lingettes pelucheux (p. ex., kimwipes). Soyez prudent en manipulant les os car ils ont tendance à casser facilement et leur fragilité ne peut-être être augmentée avec certains génotypes.</li>
	<li>Une fois que tous les échantillons ont été disséqués, les placer dans du PBS sur la glace et se déplacer à une hotte de culture stériles pour les étapes restantes de l’isolement. NOTE : Travail aseptiquement autant que possible permettra de réduire le risque de contamination dans les cultures.</li>
	<li>Faire des petites coupures (environ 1 à 2 mm) aux extrémités proximales et distales des os avant de les placer dans les extrémités sectionnées dans les tubes à centrifuger. Remarque : Vérifier que vous pour couper une quantité suffisante pour que la moelle osseuse peut être centrifugé Cependant, il faut pour éviter de couper trop comme populations de cellules ont tendance à varier selon la proximité dans l’espace de la moelle osseuse.</li>
	<li>Centrifuger à 10 000 x g pendant 15 s à température ambiante. S’assurer que toute la moelle est rincée et granulée au fond du tube 1,5 mL tandis que les os sont à l’intérieur les inserts (soit 200 µL pipette Astuce ou 0,75 mL tube microcentrifuge). Une fois que toute la moelle est rassemblée, enlever les inserts avec les os les tubes de prélèvement. Remarque : Si tous la moelle est vidée, les OS apparaît blancs. Cependant, si la moelle reste dans certains os, réessayez la coupe se termine et centrifuger.</li>
</ol>3. Suspension cellulaire
<ol><li>À l’aide d’une aiguille 25 G, tirez la cellule pastilles de haut en bas lentement pour briser les mottes et combiner tous les échantillons dans un tube conique unique de 15 mL. Ajouter 10 mL de milieu de Culture BMSC par 500 µL d’échantillons.</li>
	<li>Placer un filtre 70 µm au sommet d’un tube conique de 50 mL et passer la suspension cellulaire par ce filtre afin d’éliminer les fragments d’os possible.</li>
</ol>4. électrodéposition et de la Culture de peuplements mixtes de cellules de moelle osseuse (ca Total)
Remarque : Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur avec 5 % de CO2.
<ol><li>Calculer le nombre de cellules et leur plaque à 1,0 x 106 cellules/cm2 dans des milieux de culture. Permettre à 72 h de culture mixte pour les cellules d’attacher. Remarque : Nous recommandons de diluer la cellule suspension 20 x dans les milieux de culture et diluer à nouveau en bleu avant de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre trypan. Pour les souris C57Bl6/J mâles âgés de 7 semaines, nous cédons systématiquement un numéro de cellulaire d’environ 50 x 106 cellules mais âge, le sexe et la souche peuvent influer grandement sur nombre de cellules. Remarque : Une mélange population de cellules joigne au bas de la culture bien.</li>
	<li>Après 72 h, retirez le support et le remplacer par les supports neufs. Continuer de changer les médias tous les autres jours et recherchez de confluence. Lorsque les cellules atteignent la confluence de 80 à 100 %, ils sont prêts pour la différenciation. NOTE : Parce que cette culture est mélangée avec les BMSC et CSH, il peut être directement utilisé pour osteoblastogenèse, l’adipogenèse ainsi qu’osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. électrodéposition et de la Culture de la Population de Split de BMSC (BMSC adhérentes)
Remarque : Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur avec 5 % de CO2.
<ol><li>Plaque de toutes les cellules prélevées les fémurs, tibias et OS iliaques d’une souris dans une boîte de Petri de 10 cm (55 cm2 de zone de culture). Remarque : Lorsque la mise en commun de souris C57BL/6J 2-3, nous plaque généralement cette population « total » de la moelle osseuse dans une fiole de2 150 cm.</li>
	<li>Après 48 h de culture mixte, retirez le support de culture (contenant le CSH non adhérents). Si osteoclastogenesis expériences sont à effectuer, définir cette population de cellules non adhérentes côté (voir section 7), sinon, aspirer et jeter ces cellules.</li>
	<li>Laver la plaque/ballon avec PBS soigneusement quant à ne pas déranger les cellules attachées.</li>
	<li>Retirer le PBS et soulever les cellules en ajoutant la trypsine 0,25 % et incuber à 37 ° C pendant 1-3 min. trempe la trypsine en ajoutant les milieux cellulaires à la suspension de cellules. À ce stade, BMSC, qui sont maintenant levées, peut être comptés (comme fait précédemment en étape 4.1) et plaqué pour de futures expériences.</li>
	<li>Calculer le nombre de cellules nécessaires pour le placage. Centrifuger le volume requis de suspension de cellules à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Remarque : Les cellules sont plaquées généralement basé sur des expériences de point final. Par exemple, si la protéine/ARN doit être isolé nous plaque généralement à une densité plus élevée (~1.0-2.0 x 106 cellules/puits dans plaque 6 puits).</li>
	<li>Retirez le support et Resuspendre le culot dans le volume des milieux de culture nécessaire pour l’électrodéposition. Les cellules dans les milieux de culture selon les expériences de la plaque et laissez-les fixer pour quelques jours. Quand le BMSC atteindre confluence, procéder pour effectuer la différenciation.</li>
</ol>6. différenciation des BMSC
<ol><li>
Ostéoblastes
	<ol>
<li>Faire médias de différenciation ostéoblastique en ajoutant 800 µL de 1 M β-glycérol phosphate dans du PBS et 200 µL d’acide ascorbique 0,5 M dans du PBS à 99 mL BMSC de milieux de culture (Voir l’étape 1.1 pour la composition des médias culture BMSC).<ol>
<li>Une fois les cultures BMSC (ca total de l’étape 4.3) ou adhérent BMSC de point 5.6 confluentes, eux se différencient en ostéoblastes en changeant les milieux de culture, aux médias de différenciation ostéoblastique.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remplacer les médias de différenciation tous les deux jours. Les cellules commencent à produire des nodules blancs de minéralisation. Les visualiser à le œil nu au fond du puits ; Ce processus peut se produire dans les prochains jours à 3 semaines.<ol>
<li>Afin d’évaluer les osteoblastogenèse, effectuer la coloration de la phosphatase alcaline ou Von Kossa coloration sur les puits comme décrit à l’article 8. Remarque : Changer les médias soigneusement en inclinant les plaques avec un léger angle afin d’éviter toute perturbation de la monocouche cellulaire.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>Rendre les adipocytes base médias en mélangeant 90 mL d’hyperglycémie moyenne d’Eagle modifié Dulbecco (DMEM), 10 mL de sérum de veau fœtal, 1 mL de pénicilline/streptomycine, 100 µL 20 mM Rosiglitazone et 100 µL de 2 mM de l’insuline. Le cas échéant, stocker ce média à 4 ° C pour la semaine au cours de l’expérience de différenciation.</li>
		<li>Faire des adipocytes induction médiatique en ajoutant 200 µL de 62,5 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) et 25 µL de 1 mM de dexaméthasone à 25 mL d’adipocytes Base Media.</li>
		<li>Une fois les cultures BMSC (ca total de l’étape 4.3) ou adhérent BMSC de point 5.6 confluentes, remplacez les médias médias induction adipocyte. Considérons ce jour 0 de différenciation.</li>
		<li>Après 48 h, retirez le support et actualiser la culture avec les médias d’induction adipocyte.</li>
		<li>Le jour 4, placez-vous dans media base adipocyte. Remarque : Les gouttelettes lipidiques peuvent commencent à apparaître dès 2 jours ou 4 jours.</li>
		<li>Au jour 7, observent que les cellules ont accumulé des gouttelettes lipidiques maximale et présentent un phénotype similaire à un adipocyte mature. La culture pas au-delà de ce point, car elle peut entraîner la mort/détachement de cellules.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. différenciation des CSH en ostéoclastes
<ol><li>Faire médias différenciation ostéoclastique en ajoutant 50 µL de 25 µg/mL de récepteur activateur de NFKB Ligand (RANKL) et 15 µL de 25 µg/mL de macrophage Colony Stimulating Factor (mCSF) à 25 mL de milieu de Culture BMSC.</li>
	<li>Une fois que le ca total (de l’étape 4.3) ou les cellules non adhérentes (de l’étape 5.2) sont attachés au puits, milieux de culture peut être commuté aux médias de différenciation ostéoclastique. Reconstituer les médias de différenciation tous les deux jours.</li>
	<li>Respecter les cultures des ostéoclastes chaque jour sous un microscope à grossissement de 10 X. Observer que les ostéoclastes fusionnent et forment des cellules multinucléées, généralement autour du jour 5-7 de différenciation.</li>
</ol>8. coloration
<ol><li>
Ostéoblastes NOTE : La coloration de la Phosphatase alcaline (PA), nous avons souvent utiliser une coloration d’AP de l’ensemble (voir Table des matières) conformément aux lignes directrices.<ol>
<li>Effectuer AP coloration en suivant les instructions du fabricant de kit.<ol>
<li>Aspirer les médias et rincer les cellules avec du PBS. Fixer les cellules avec 4 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 12 min à température ambiante.</li>
			<li>Entre-temps, faire la solution de l’AP à l’aide des réactifs de l’AP kit de coloration en ajoutant 500 µL Nitrite de Sodium 500 µL de solution alcaline-FRV et mélanger délicatement ; laisser reposer pendant 2 min. Ajouter 22,5 mL dH2O et 500 µL Naphthol AS-BI alcaline. Mélanger doucement. ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.</li>
			<li>Une fois que les cellules sont fixées, rincer avec du PBS et ajouter la solution AP dans chaque cupule (1 à 2 mL par puits). Couvrir de papier d’aluminium et laisser tache pendant 30 min à température ambiante, abrie de la lumière. Aspirer la solution, rincer à l’eau distillée et laissez sécher la plaque.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisition d’images de colonies teintés à l’aide d’une caméra afin d’observer les cellules positives de la phosphatase alcaline.</li>
		<li>Vous pouvez également exécuter Von Kossa au lieu de la coloration de la phosphatase alcaline. Pour cela, laver les puits avec de l’eau distillée comme n’importe quel autres PBS précipitera avec nitrate d’argent.
		<ol>
<li>Fixer les cellules avec 4 % PFA dans du PBS pendant 12 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez suffisamment 5 % de solution de nitrate d’argent pour couvrir le puits et l’exposer à une forte lumière pendant 1 h à température ambiante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enlever la solution de nitrate d’argent et rincer chaque puits avec de l’eau distillée. Ajouter la solution de thiosulfate de sodium 5 % pour les cellules et laisser reposer pendant 3 min.</li>
		<li>Aspirer le thiosulfate de sodium et laver à l’eau distillée. Laisser la plaque sécher et observer le gisement minéral teinté brun foncé/noir avec l’oeil nu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>Pour la coloration de l’huile rouge O (ORO), fixer les cellules à l’aide de 10 % formol tamponné de neutre pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Pendant ce temps, faire la Solution Stock de ORO en dissolvant 0,035 g dans 10 mL d’isopropanol. Cela est suffisant pour une plaque 6 puits. Mélanger et passer la solution à l’aide d’un papier filtre (pore taille 11 µm).</li>
		<li>Faire la Solution diluée de ORO en diluant avec 9 mL de solution mère de ORO 6 ml d’eau distillée. Laisser la solution sur un rocker jusqu’au prêt à l’emploi.</li>
		<li>Préparer l’isopropanol de 60 % dans l’eau distillée (assez pour couvrir chacun faire bien).</li>
		<li>Une fois que les cellules sont fixées, retirer la fixateur et laver une fois à l’eau distillée. Remplacez l’eau par la solution d’isopropanol 60 % pendant 1 min. NOTE : Ajouter du liquide lentement pendant le basculement de la plaque ; adipocytes déloger très facilement.</li>
		<li>Retirez l’isopropanol et ajouter assez de Solution de travail ORO pour couvrir toutes les cellules. Incuber pendant 15 minutes sur un rocker basse vitesse à la température ambiante. Enlever ORO et laver deux fois avec de l’eau distillée. Remarque : À ce stade, gouttelettes lipidiques ORO teinté peuvent être visualisées au microscope.</li>
		<li>Afin de quantifier l’ORO, décolorer l’ORO en ajoutant 1 mL d’isopropanol 100 % à chaque puits et en balançant doucement pendant 10 min.</li>
		<li>Pendant ce temps, préparer une série de dilution pour créer une courbe standard basée sur les normes suivantes de 8 à l’aide de la Solution diluée de ORO (2 100 µg/mL) et l’isopropanol comme diluant : 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 et 0 µg/mL.</li>
		<li>200 µL des normes et des échantillons destained en géométrie sur une plaque de charge et de lire l’absorbance à 490 nm.<ol>
<li>Déterminer la concentration de ORO pour chaque échantillon basé sur la courbe d’étalonnage. Remarque : Nous recommandons la normalisation de la concentration de ORO à nombre de cellules. Le nombre de cellules peut être quantifié en cristal violet de coloration ou de la quantité d’ADN.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ostéoclastes Remarque : Lorsque vous êtes prêt, nous suggérons de coloration des ostéoclastes pour kit de Tartrate-résistantes Acid Phosphatase (TRAP) en utilisant la coloration du piège (voir Table des matières).<ol>
<li>Pour piège à coloration, fixer les cellules pendant 30 min à température ambiante avec le glutaraldéhyde à 2,5 % dans du PBS. Pendant ce temps, faire la solution de piège en mélangeant 50 µL de la Solution de Base rapide grenats, 50 µL de Nitrite de Sodium, 4,55 mL d’eau distillée, 50 µL de Napthol AS-Biphosphate, 200 µL de solution d’acétate et 100 µL de solution de Tartrate.</li>
		<li>Aspirer au large de fixateur et rincer les cellules avec du PBS à deux fois avant d’ajouter la solution piège pendant 1 h à 37 ° C.</li>
		<li>Laver à l’eau distillée avant le dépouillement des ostéoclastes sous un microscope (grossissement 10 X). Les cellules de piège+ apparaissent pourpres avec 3 ou plusieurs noyaux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40(2012).</li>
<li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs divulguer qu’ils n’ont aucun conflit financier d’intérêts.

Dans cet article, deux méthodes de culture de BMSC sont présentées avec leurs avantages et leurs limites. Isoler les cellules provenant de la moelle osseuse est un processus relativement sans effort. Cependant, il peut être difficile en raison de l’environnement cellulaire diverse de la cavité de moelle d’obtenir une population de cellules représentante des cellules souches mésenchymateuses ou progéniteurs ostéoclastiques.
Cultivant l’intégralité du contenu de la moelle osseuse fournit une rep...

BMSC murine primaires est utilisées comme modèle in vitro de cellules souches mésenchymateuses depuis leur découverte dans le début des années 19801. En effet, les cultures de cellules adhérentes plastique vidées de la cavité de la moelle osseuse des os longs maintiennent la capacité à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes, chondrocytes ou adipocytes dans nombreuses études2,3, 4 , 5. Toutefois, la moelle osseuse est un tissu unique composé de plusieurs différentes populations cellulaires y compris, mais non limité à, BMSC, CSH, les cellules endothéliales et immunitaires. Ainsi, d’isolement et des techniques de culture peuvent produire des populations de cellules avec différente homogénéité. En utilisant ces techniques pour tester la potentiel de différenciation des cellules peut être difficile. Par exemple, lorsque l'on compare les cellules des souris avec des génotypes différents, commençant par une population de cellules mixtes limite l’interprétation des données. À l’inverse, obtention des populations homogènes de BMSC et csh peut être techniquement difficile et ne peut pas être aussi représentatif d’un modèle ex vivo .
Dans notre laboratoire, nous nous intéressons principalement à l’utilisation du BMSC en raison de leur potentiel à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes. Nous présentons ici les techniques d’isolement BMSC et GPX et de la culture utilisée pour évaluer l’osteoblastogenèse ou l’adipogenèse le in vitro, ainsi que des cultures de CSH se différencier en ostéoclastes. Une méthode utilise une population mixte de cellules de moelle osseuse (BMC) contenant BMSC et GPX directement adapté pour l’adipogenèse, osteoblastogenèse et osteoclastogenesis (appelé ca Total). Cette méthode est une représentation plus proche ex vivo de l’hétérogénéité trouvée parmi les cellules du microenvironnement de la moelle osseuse. Une autre méthode sépare adhérentes de cellules non adhérentes dans une tentative de culture plus « pur » des populations de BMSC et csh (appelé adhérent BMSC). La méthode plus tard autorise la culture cellulaire des expériences pour démarrer avec un nombre plus précis du BMSC ou GPX et réduit le potentiel des effets indirects complexes des autres populations de cellules qui restent dans la culture. Les deux méthodes ont été précédemment publiés et utilisés pour traiter différents recherche questions6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&mu ; L pointes de pipette&nbsp ;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tubes à centrifuger</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube conique&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Science</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Outils</td><td></td><td></td><td></td>de dissection</tr><tr><td>70 &mu ; m filters</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25 % trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Kit de phosphatase alcaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Thiosulfate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Huile Rouge O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10 % Neutre Tamponné Formol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Whatman Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>Kit de phosphatase acide résistante au tartrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Electron</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alpha ;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-phosphate de glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman Chemical</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer microscope à onduleur</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolement, culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) constituent une population de cellules utilisée couramment comme une représentation de cellules souches mésenchymateuses in vitro. Ils résident dans la cavité de la moelle osseuse aux côtés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui peut donner lieu à des globules rouges, progéniteurs immunitaires et les ostéoclastes. Ainsi, les extractions de populations de cellules des moelle osseuse des résultats dans un mélange très hétérogène de diverses populations de cellules, qui peuvent présenter des défis dans une conception expérimentale et confondre l’interprétation des données. Plusieurs d’isolement et des techniques de culture ont été développés dans les laboratoires afin d’obtenir des populations plus ou moins homogènes de BMSC et csh invitro. Nous présentons ici deux méthodes pour isoler BMSC et GPX des os longs souris : une méthode qui génère une population mixte de BMSC et csh et une méthode qui tente de séparer les populations de deux cellules basées sur le respect. Les deux méthodes offrent adapté aux cellules ostéogéniques et différenciation adipocytaire expérimente des essais ainsi que fonctionnels.

Aperçu des Cultures cellulaires Les techniques de deux culture permettent l’évaluation de la différenciation sur une population mixte de BMC composé BMSC et csh (ca Total, Figure 1 a) ou d’une population de BMSC se sépare du CSH (BMSC Adherent, Figure 1 b). 48 h après que les cellules de la moelle sont isolés et plaqués (Figure 1), ils attachent au fond de la plaque de culture en ...

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour isoler et de différencier les cellules stromales de la moelle osseuse et de cellules souches hématopoïétiques des os longs de souris. Deux protocoles différents sont présentés agronomiques différentes populations cellulaires appropriées pour l’expansion et la différenciation dans les ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes.

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des cellules stromales de moelle osseuse, ou BMSC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’os et des adipocytes sur les cellules progénitrices. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’isoler les BMSC de manière relativement rapide, reproductible et peu coûteuse.Une démonstration visuelle de cette méthode est utile, car les étapes de dissection peuvent être difficiles à expliquer avec du texte seul. Avant de commencer la procédure de prélèvement osseux, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture de cellules souches de moelle osseuse dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour trois os à prélever. Et coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres par tube de microcentrifugation, de sorte que chaque pointe puisse tenir dans un seul tube avec les couvercles fermés.Ensuite, placez la première souris euthanasiée de 78 semaines en position couchée sur une planche de dissection et vaporisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des pinces pour créer une tente de peau sur l’abdomen et utilisez des ciseaux de dissection stéri

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement et la culture de cellules stromales de moelle osseuse à partir des os longs de souris. Les BMSC adhérents isolés peuvent être utilisés pour une analyse plus approfondie.

Isolement et culture de cellules stromales de moelle osseuse à partir d’un tibia de souris

Cette vidéo démontre la différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) en adipocytes. Dans le processus en deux étapes, en présence de facteurs de croissance et d’hormones spécifiques, les BMSC indifférenciés se différencient d’abord en préadipocytes. La deuxième étape impliquant un traitement au glucose et à l’insuline conduit à la formation d’adipocytes matures avec plusieurs gouttelettes lipidiques.

Différenciation in vitro des cellules stromales de la moelle osseuse de souris en adipocytes

Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

La signalisation Notch est une forme de communication cellulaire qui repose sur le contact direct entre les cellules. Pour induire correctement la signalisation Notch in vitro, les ligands Notch doivent être présentés aux cellules dans un état immobilisé. Ce protocole décrit des méthodes de stimulation in vitro de la signalisation Notch chez les précurseurs d’ostéoclastes de souris.

Stimulation de Notch Signalisation dans Souris ostéoclastes Précurseurs

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques.  Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Apprenez à isoler et cultiver les cellules stromales de la moelle osseuse de souris. Cette méthode rapide et reproductible permet d'obtenir des progéniteurs pour la différenciation ostéoblastique et adipocytaire.

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

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