Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des cellules stromales de moelle osseuse, ou BMSC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’os et des adipocytes sur les cellules progénitrices. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’isoler les BMSC de manière relativement rapide, reproductible et peu coûteuse.

Une démonstration visuelle de cette méthode est utile, car les étapes de dissection peuvent être difficiles à expliquer avec du texte seul. Avant de commencer la procédure de prélèvement osseux, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture de cellules souches de moelle osseuse dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour trois os à prélever. Et coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres par tube de microcentrifugation, de sorte que chaque pointe puisse tenir dans un seul tube avec les couvercles fermés.

Ensuite, placez la première souris euthanasiée de 78 semaines en position couchée sur une planche de dissection et vaporisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des pinces pour créer une tente de peau sur l’abdomen et utilisez des ciseaux de dissection stériles pour faire une incision cutanée d’environ un centimètre. Pelez la peau pour exposer le bas-ventre et les jambes.

Coupez le long de la crête iliaque de chaque hanche pour séparer les têtes de fémur du bassin, et faites une incision à travers la ligne médiane du bassin pour séparer les os iliaques, et coupez sous les articulations de la cheville pour enlever les pieds. Ensuite, séparez le tibia du fémur en coupant au niveau de l’articulation du genou. Ensuite, utilisez des lingettes non pelucheuses pour retirer soigneusement le muscle des fémurs, des tibias et des os iliaques.

Lorsque tous les os ont été prélevés, placez les échantillons dans du PBS sur de la glace et transférez-les dans une hotte de culture stérile. À l’aide d’une technique stérile, faites des incisions d’un à deux millimètres aux extrémités proximale et distale de chaque os avant de placer trois os dans chaque pointe de micropipette modifiée dans les tubes de microcentrifugation. Récoltez la moelle osseuse des os par centrifugation, en confirmant si la moelle a été complètement granulée au fond de chaque tube de microcentrifugation à la fin de l’essorage.

Si toute la moelle a été collectée, les os apparaîtront blancs. Retirez les pointes des micropipettes et les os des tubes de prélèvement pour une élimination en toute sécurité biologique. Pour plaquer les cellules de la moelle osseuse, utilisez d’abord une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 25 pour remettre lentement les granules en suspension et briser les amas de pommeaux, puis regroupez les échantillons dans un seul tube conique de 15 millilitres.

Ajoutez 10 millilitres de milieu de culture de cellules souches de moelle osseuse par 500 microlitres d’échantillon, et filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres pour éliminer tous les fragments d’os. Après le comptage, ensemencez les cellules de la moelle osseuse à une fois de 10 à six cellules par centimètre carré de densité dans un milieu de culture frais pour une incubation de 72 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le troisième jour, remplacez le surnageant par un milieu frais, en changeant le milieu tous les deux jours par la suite jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 % à 100 %.

Pour plaquer une culture de population de cellules de moelle osseuse divisée, plaquez les cellules de moelle osseuse récoltées d’une souris dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres pendant 48 heures dans un milieu de culture frais dans un incubateur de culture cellulaire. Le deuxième jour de la culture, retirez le surnageant contenant des cellules souches hématopoïétiques non adhérentes et lavez soigneusement la plaque avec du PBS, sans perturber les cellules adhérentes de la moelle osseuse. Remplacez le PBS par 0,25 % de trypsine.

Après une à trois minutes à 37 degrés Celsius, éteignez la réaction avec un milieu de culture cellulaire frais et comptez les cellules dans la suspension cellulaire résultante. Centrifugez le nombre approprié de cellules pour le placage et remettez la pastille en suspension dans suffisamment de milieu de culture frais pour obtenir la densité de placage souhaitée. Ensuite, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce qu’elles soient confluentes.

Pour induire la différenciation des ostéoblastes des cellules souches de la moelle osseuse, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu de différenciation tous les deux jours, jusqu’à ce que les cellules commencent à produire des nodules blancs de minéralisation qui peuvent être observés macroscopiquement. Pour induire la différenciation adipocytaire des cellules souches de la moelle osseuse, remplacez le milieu de culture cellulaire d’une culture cellulaire de moelle osseuse confluente par un milieu d’induction adipocytaire. Après deux jours de culture, remplacer le surnageant par un milieu d’induction adipocytaire frais, en passant au milieu adipocytaire base le quatrième jour.

Le septième jour, confirmez que les cellules ont accumulé des gouttelettes lipidiques et qu’elles présentent un phénotype similaire à celui des adipocytes matures. Pour différencier les cellules souches hématopoïétiques en ostéoclastes, lorsqu’une culture cellulaire totale de moelle osseuse ou une culture cellulaire non adhérente devient adhérente, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu de différenciation ostéoclaste. Changez de milieu tous les deux jours et vérifiez quotidiennement la différenciation des ostéoclastes au microscope optique à un grossissement de 10x jusqu’à ce que les ostéoclastes fusionnent et forment des cellules multinucléées, généralement vers les jours cinq à sept de la différenciation.

Les cultures confluentes de BMSC peuvent être différenciées en ostéoblastes à l’aide d’un milieu ostéogénique composé d’acide ascorbique et de bêta-glycérophosphate. Après quelques jours de différenciation, les ostéoblastes commencent à exprimer la phosphatase alcaline. Et une différenciation plus poussée déclenchera la production de matrice ostéoïde et, en fin de compte, la minéralisation de cette matrice.

Il est intéressant de noter que seule une proportion des cellules se différenciera en ostéoblastes in vitro, comme le révèle la coloration au violet cristallin. Qu’il s’agisse de populations mixtes ou de populations de cellules de moelle osseuse divisées, seule une proportion des cellules se différenciera en adipocytes, qui apparaissent comme des cellules rondes avec de multiples vacuoles lipidiques qui peuvent être colorées avec un colorant O rouge huile. Les cultures de cellules souches humaines complétées par le facteur de stimulation des cellules murines et RANKL fusionneront rapidement pour former des cellules multinucléées dont la coloration est positive pour TRAP.

Ces ostéoclastes sont capables de résorber la matrice minérale in vitro et peuvent être utilisés pour évaluer l’activité ostéoclastique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure, si elle est correctement exécutée, en fonction du nombre de souris. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de stériliser les outils et de préparer les milieux à l’avance, afin de pouvoir travailler aussi rapidement et de manière aussi aseptique que possible.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver des cellules stromales de moelle osseuse.