Name: Souris adulte DRG Explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’Infection virale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez la culture de ganglions rachidiens de souris adulte pour étudier la neuroplasticité et les réponses aux infections virales. Cette méthode ex vivo permet d'analyser les interactions neuronales et gliales.

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Nous remercions sincèrement le laboratoire central de l’imagerie à Midwestern University (SM) et le groupe d’étudiants [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo et Casey Sigerson] pour leurs contributions en culture cellulaire et le travail d’imagerie. Ce travail de recherche a été financé par de la SM intra-muros subvention des fonds de démarrage M.F. et recherche de V.T.

Toutes les procédures y compris l’utilisation des animaux ont été approuvés par l’examen de l’établissement approuvé par le Conseil des protocoles (IACUC-Midwestern University).
1. récolte DRG embryons de souris
<ol><li>
Euthanasier les souris adultes par méthode d’asphyxie (CO2) suivis par décapitation. Procéder immédiatement à enlever chirurgicalement la colonne vertébrale.
	<ol>
<li>Exposer la colonne vertébrale en réduisant la couche de peau sur le dos à l’aide des ciseaux. Isoler la colonne vertébrale en coupe par le biais des côtes de chaque côté de la colonne et le sacrum qui la sépare de la colonne vertébrale du reste de l’animal.</li>
		<li>Monter la colonne vertébrale (face ventrale vers le haut) sur un tapis chirurgical à l’aide d’aiguilles/pins.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un double à l’aide des ciseaux faire coupe des deux côtés des corps vertébraux à exposer la face ventrale du canal vertébral.</li>
	<li>Sous un microscope chirurgical (grossissement 4 X la valeur), utiliser des ciseaux pour déplacer doucement la moelle épinière du côté d’exposer les racines spinales dorsales controlatérales et de localiser le PMSI, le long des racines dorsales des nerfs périphériques. Chaque ganglion est partiellement cachée dans le foramen intervertébral.</li>
	<li>Pour récolter le PMSI, pincer la racine dorsale (entre la moelle épinière et la DRG) avec une pince et tirer doucement sur le PMSI depuis le foramen intervertébral.</li>
	<li>Placez la deuxième pince sur le nerf rachidien périphériques à la DRG et tirez la DRG avec le nerf spinal et les racines spinales.</li>
	<li>Placez le PMSI collecté dans une boîte de Pétri contenant 3 mL de sérum glacé médias libres (SFM)34de 35 mm.</li>
	<li>Transférer chaque DRG individuel dans un verre sec Pétri et, sous un microscope chirurgical, nettoyer et couper les fibres de l’excès et du tissu conjonctif encore attaché à la DRG à l’aide d’une lame. Le PMSI est facilement identifiable comme une structure transparente bulgy le long du nerf rachidien/racine blanche. Les vaisseaux sanguins sont souvent trouvés entourant le PMSI.</li>
	<li>Placer la DRG nettoyée dans un nouvelle boîte de Pétri contenant glacee médias de GDF.</li>
	<li>Diluer le mélange de protéines gélatineux (voir Table des matières) dans la GFD glacée (1:1).</li>
	<li>Plaque le DRG ex vivo dans 12 plats revêtus avec 10/20 µL du mélange de protéine gélatineux et mettez-les à l’intérieur de l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 30 à 60 min.</li>
	<li>Ajouter doucement 1,5 à 2 mL de l’AFD pour le système de culture pour couvrir l’explant ensemble et maintenir les explants à (37 ° C et 5 % CO2) des conditions de culture. NOTE : Ceci est une étape cruciale car le PMSI est ancré à la vaisselle en verre que par le mélange de protéines gélatineux polymérisé. Temps de polymérisation et de pipetage compétences sont essentiels pour éviter le flottant.</li>
	<li>Changer le support de plus en plus de DRG toutes les 72 h et laissez la DRG pousse pendant aussi longtemps que nécessaire.</li>
</ol>2. isoler les neurones monocellulaire de DRG
<ol><li>Place tous la DRG recueilli dans un tube stérile de 1,5 mL à 1,2 mL de F12 médias contenant 1,25 mg/mL de collagénase IV et il incuber à 37 ° C et 5 % CO2 pendant 45 min. Répétez cette étape pour un autre 45 min après la première incubation.</li>
	<li>Traiter les explants avec 2 mL de F12 médias contenant de la trypsine (0,025 %) pendant 30 min immédiatement après le traitement de la collagénase IV à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Incuber avec 2 mL de F12 milieux contenant du sérum de veau fœtal (SVF ; 33 %) à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 15 min.</li>
	<li>Laver les explants trois fois avec 2 mL de médias F12 et procéder à leur désolidariser mécaniquement avec une pipette de verre jusqu'à ce que les médias devient trouble. Remarque : Cette procédure comprend la collecte de DRG nettoyer/piqûre de l’animal, comme expliqué dans la section précédente. Lorsque vous effectuez une dissociation mécanique des explants, Soyez doux et ne pas utiliser une force excessive car elle peut conduire à des débordements et perte de matériel de travail.</li>
	<li>La culture de cellules dissociées filtrer sur un filtre de 0,22 µm pour éliminer les impuretés et excès de tissu conjonctif. Centrifuger la cellule filtrée lysate à (2 500 x g) pendant 2 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de milieux neurobasal contenant du supplément pour culture neuronale (1 x), mélange antibiotique (1 x), L-glutamate (0,5 mM) et le facteur de croissance (5 µg/mL) de nerf (voir Table des matières).</li>
	<li>Plaque des cellules dissociées sur glissières laminin-enduit couverture (50 µg/mL ; voir Table des matières) à une densité cellulaire préféré. Déterminer la densité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules. NOTE : Nous avons plaqué cellules à 25 000 diapositives de cellules/couvercle. Cette technique permet la dissociation des neurones et de cellules gliales de satellite. Le composant glial cultivé conjointement avec les neurone neurones joue un rôle essentiel pour la survie des neurones.</li>
</ol>3. le HSV-1 Infection des Explants DRG et DRG dérivées des cellules dissociées
NOTE : Ce travail a été effectué en suivant strictement les biosécurité niveau 2 (BSL-2) exigences auxquelles nous avons un laboratoire entièrement équipé qui est approuvé par le Comité de biosécurité Midwestern University. Une souche de KOS de HSV-1 a été utilisée dans cette étude. Veuillez prendre les mesures appropriées et des mesures de sécurité selon les directives des institutions locales si vous travaillez avec des souches de virus.
<ol><li>Déterminer et préparer le virus dans les dilutions correctes dans les médias de GDF pour infecter le modèle. Le virus utilisé dans cette étude était KOS souche de HSV-1. Lors de l’utilisation des dérivés de DRG dissociées des cellules, utilisez 1 unité de la multiplicité d’infection (MOI) pour l’infection, ce qui signifie que le nombre de virus égale le nombre de cellules.</li>
	<li>Si infectant DRG des explants, utilisez le numéro des virions (p. ex., 10 000 virions) parce que le nombre exact de cellules dans un explant ne peut pas être déterminé.</li>
	<li>Placer les explants/cellules infectées par le virus dans une plaque de cellules stérile ou un tube contenant un mélange de médias de gestion durable des forêts et de virus. NOTE : Nous avons utilisé des virions 25 000 pour une diapositive de couverture contenant 25 000 cellules (1 MOI). Pour infecter un explant, nous utilisons des virions 10 000.</li>
	<li>Placer la plaque cellulaire ou du tube à 37 ° C pour l’infection se dérouler ; temps d’exposition virale peut varier selon l’infectivité virale. NOTE : L’entrée virale a été confirmée en utilisant ortho-nitrophényl-β-galactoside (ONPG) et 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) essais26.</li>
</ol>4. immunofluorescence
<ol><li>Difficulté des explants et des échantillons de cellule unique à 4 % de formol préparé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun dans du PBS.</li>
	<li>Incuber les échantillons avec des anticorps primaires désirés (anti-β-tubuline, anti-périphérine, anticorps d’anti-héparane sulfate (HS), et/ou anti-glycoprotéine de D (gD) ; Voir Table des matières pour les dilutions) dilués dans un tampon PBS contenant 0,3 % Triton-X (PBST) et 10 % de sérum de chèvre normal. Conserver les échantillons à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun avec du PBS. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 1 h dans l’anticorps secondaire approprié (488 et/ou Cy3 ; voir Table des matières pour les dilutions) dilué dans du PBS.</li>
	<li>Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun avec du PBS. Incuber les échantillons avec un colorant Hoechst (1,5 µM) dans du PBS pendant 20 min avant l’étape de montage.</li>
	<li>Monter les échantillons sur lames de verre à l’aide d’un milieu de montage de fluorescence et de la lamelle couvre-objet.</li>
</ol>

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<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à la divulgation.

Le modèle DRG ex vivo est extrêmement utile d’examiner un large éventail d’événements comme des interactions neurone-glie, ainsi que l’effet du microenvironnement sur ces deux métabolismes neuronales et gliales37. En outre, le DRG-modèle pourrait servir comme un outil économique pour répondre à des questions pertinentes en ce qui concerne le mécanisme pathogène et associés des marqueurs en développant ex vivo des systèmes pour la phase chronique et latente aiguë de l’infection ou...

Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode pour obtenir un modèle ex vivo d’organotypique d’un système de modèle DRG souris dérivé comme un micro-environnement tissu préservé pour enquêter sur un large éventail de réactions biologiques aux insultes PNS allant de neurone-gliales interaction, neuroplasticité, marqueurs de l’inflammation, d’infection virale. En outre, nous avons développé plus loin un protocole visant à créer une co-culture primaire de neurones sensoriels unique DRG-dérivés et de cellules satellites.
La DRG sont gris-matière-unités satellites situés à l’extérieur du système nerveux central (CNS) le long des racines spinales dorsales des nerfs rachidiens. Le PMSI, situé à proximité du foramen intervertébral, neurones sensoriels neurone de maison et les cellules gliales par satellite. Les neurone neurones comportent une neurite unique qui se divise en un processus périphérique transportant des apports somatiques et viscérales des périphériques cibles au corps cellulaire et un processus central qui soumet des informations sensorielles du corps cellulaire dans le SNC. Une capsule conjonctive définit et isole ce périphérique cluster des neurones et les cellules gliales du SNC. Aucune migration cellulaire postnatal vers ou à partir de la DRG n’a jamais été décrite et une niche de cellules souches locales est responsable de neurogènes événements qui ont lieu tout au long de la vie1. Par conséquent, ce modèle est particulièrement adapté pour étudier la neurogenèse adulte, axonogénèse, réponse à une lésion traumatique et cellule mort2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Dans le domaine de la neurogenèse, le PMSI récoltées en vivo et explantés in vitro reproduit axonotmésis, une condition de blessures dans les axones sont entièrement rompus et le corps cellulaire neuronal est déconnectée de la cible innervée10 ,11. Il est bien connu que les lésions du nerf périphérique peuvent provoquer l’expression des gènes une diminution et une augmentation dans le PMSI et bon nombre de ces changements sont le résultat de processus de régénération mais beaucoup peuvent aussi être le résultat de la réponse immunitaire ou un autre des cellules non neuronales. En utilisant un ex vivo système de DRG isolé, certaines de cette complexité est retiré et voies mécanistiques puissent être étudiés plus facilement.
En plus de son rôle central dans la transmission des influx sensitifs à la CNS, l’abondance des récepteurs de nombreux neurotransmetteurs dont GABA12,13,14,15 au niveau du soma neuronal ainsi que preuve d’excitation croisée interneuronales peut suggèrent que les DRG sont sophistiqués intégrateurs préliminaires des inputs sensoriels16,17. Ces nouveaux résultats confèrent à l’explant DRG les caractéristiques d’un système de réseau neuronal-mini semblable à d’autres modèles de « mini-cerveau », qui sont organoïdes nerveux-tissu-spécifique utilisé pour des champs expérimentaux plus larges enquête et thérapeutique approche de maladies neurologiques18,19. Ces témoignages ainsi que le fait que le PMSI est un groupe discret et bien défini du tissu neuronal entouré par une capsule conjonctive, en font un organe approprié pour ex vivo de transplantation.
Culture souris DRG présente une option attrayante multicellulaire pour modéliser les pathophysiologies humaines en raison de similitudes structurales et génétiques entre les espèces. En outre, un grand dépôt de lignées de souris transgéniques est très propice à futures études mécanistes. Extension de neurites fois au cours du développement et après une lésion nécessite des interactions mécaniques entre croissance cône et substrat de20,21. Nano et micro-aux motifs de substrats ont servi d’outils pour diriger la croissance neuritique et démontrer leur capacité à répondre à des caractéristiques topographiques dans leurs biocénoses. Les neurones ont démontré que survivre, adhérer, migrer et orienter leurs axones pour naviguer dans les caractéristiques de surface tels que les rainures dans les substrats22,23. Toutefois, ces études ont utilisé généralement de lignées de cellules cultivées et il est difficile de prédire comment les cellules primaires neuronale volonté répondre aux repères bien définis, physique in vivo ou ex vivo.
Le modèle ex vivo explant de souris DRG utilisée pour cette proposition imite l’interaction cellule-cellule réelle et les signaux biochimiques qui entourent les axones croissantes. Parmi beaucoup d’autres paradigmes expérimentaux, allant de la régénération axonale, Neurosphère production, à la neuro-inflammation, le PMSI explantation modèle continue à servir comme un outil précieux pour étudier l’aspect viral infection et latence dans sensorielle les ganglions24,25,26,27.
Le système nerveux (NS) est en général de cible pour les infections virales28,29,30. La plupart des virus infectent la surface des cellules épithéliales et endothéliales et font leur chemin dans les tissus de surface à la NS par l’intermédiaire de nerf périphérique des fibres sensorielles et motrices. En particulier, le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) après une infection initiale dans les cellules épithéliales établit un temps de latence long de la vie dans les ganglions sensitifs de préférence, le PMSI du PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacité d’infecter le PNS conduit finalement à des maladies neurologiques,33.

<table><tbody><tr><td>Souris adultes NIH/Swiss</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 35mm</td><td>Cell Treat</td><td>229635</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel ECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td>Mélange de protéines gélatineuses</td></tr><tr><td>F12 Milieu Gibco</td><td></td><td>11765-054</td><td>*Partie du milieu SFM</td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0.22um filtre</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Média neurobasal</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Complément pour culture neuronale</td></tr><tr><td>Antibiotiques PSN</td><td>Gibco</td><td>15640-055</td><td>*Fait partie du milieu SFM Mélange d’antibiotiques</td></tr><tr><td>L-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>*Fait partie du média SFM</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td>Facteur de croissance nerveuse</td></tr><tr><td>Lame de couverture recouverte de laminine</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td></td></tr><tr><td>ONPG subtrate</td><td>Pierce</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520034</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-B-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8328</td><td>dilution 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-phérine</td><td>Millipore</td><td>AB1530</td><td>dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Colorant Hoechst</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>1.5 &micro ; M concentration finale</td></tr><tr><td>Anti-héparane</td><td>sulfate US Biological</td><td>H1890-10</td><td>0,180555556</td></tr><tr><td>Anticorps anti-gD</td><td>Virostat</td><td>196</td><td>dilution 1:10</td></tr><tr><td>BSA&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>*Fait partie du média SFM</td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>21010-046</td><td>*Fait partie du média SFM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG*</td><td>Fait partie du média SFM</td></tr><tr><td>KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td>*Fait partie du média SFM</td></tr><tr><td>Vitamin-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>*Fait partie du média SFM</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>*Fait partie du média SFM</td></tr><tr><td>488 (anti-souris de chèvre)</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 (anti-lapin)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>laboratories 111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal&nbsp ;</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Formalin Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td>Monture à fluorescence</td></tr><tr><td>Diamond White Glass Coverslides</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-20</td><td></td></tr></tbody></table>

souris adulte drg explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’infection virale

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

Ce protocole décrit un modèle ex vivo de souris-dérivé de la racine dorsale ganglions (GRD) explant et in vitro dérivées de DRG co-culture de dissocié des neurones sensoriels et les cellules gliales par satellite. Ce sont des modèles pour étudier diverses réactions biologiques associés à des troubles physiologiques et pathologiques du système nerveux périphérique (PNS) allant des interactions neurone-gliales, neuroplasticité, utiles et polyvalents neuro-inflammation et infection virale. L’utilisation de l’explant DRG est scientifiquement avantageuse par rapport aux modèles de cellules individuelles simpliste pour de multiples raisons. Par exemple, comme une culture organotypique, l’explant DRG permet aux ex vivo le transfert d’un réseau neuronal entier, y compris le microenvironnement extracellulaire qui jouent un rôle important dans toutes les fonctions neuronales et gliales. En outre, DRG explants peuvent également être maintenus ex vivo pour plusieurs jours et les conditions de culture peuvent être perturbées comme vous le souhaitez. En outre, le PMSI récolté peut être dissocié de plus dans une culture mixte in vitro de neurones sensitifs primaires et de cellules gliales par satellite pour étudier les interactions neuronales et gliales, neuritogenesis, interaction cône axonal avec l’extracellulaire microenvironnement et plus généralement, tout aspect lié au métabolisme neuronal. Par conséquent, le système DRG-explant offre une grande flexibilité pour étudier un large éventail d’événements liés à des conditions biologiques, physiologiques et pathologiques de manière rentable.

Plusieurs aspects de la neuroplasticité et neurone-environment interaction peuvent être étudiées à l’aide de DRG et un modèle de culture de cellules dissociées du même. Nous avons commencé les études en isolant un explant DRG et DRG dérivées des cellules dissociées comme schématiquement représentées dans la Figure 1. Les tissus et modèles de cellules individuelles peuvent être analysés en utilisant une variété de techniques moléculaires tels que l’immunofluorescence, Western blot, analyses g...

Dans le présent rapport, les avantages de culture organotypique et dissocié des cultures primaires des ganglions rachidiens provenant de souris sont mises en évidence afin d’étudier un large éventail de mécanismes associés aux interactions neurone-gliales, neuroplasticité, neuroinflammation et réponse à l’infection virale.

Souris adulte DRG Explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’Infection virale

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

L’objectif global de cette procédure est de créer un modèle ex vivo d’explants de ganglions de la racine dorsale et/ou un modèle de cellule primaire dissociée dérivé de DRG afin d’étudier les réponses neuronales aux signaux environnementaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroplasticité, ou neuro-inflammation en réponse à l’exposition à des agents pathogènes. Le principal avantage de cette technique est que les explants des ganglions de la racine dorsale maintiennent la complexité semblable à celle d’un organe nécessaire pour lancer le cycle cellulaire en action et les changements dans le microenvironnement intercellulaire en raison de traitements spécifiques.Une démonstration attentive de cette méthode est très critique, car l’identification des DRG ainsi que leur récolte peuvent être assez difficiles en raison de leur taille et de leur emplacement. Pour commencer cette procédure, exposez la colonne vertébrale en coupant la couche de peau de l’animal, dorsalement à l’aide de ciseaux fins. Ensuite, isolez la colonne vertébrale en coupant les côtes des deux côtés de la colonne et à travers le sacrum, séparant la colonne vertébrale du

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Cette vidéo présente une méthode pour développer des ganglions de la racine dorsale ou une culture d’explants DRG et des modèles cellulaires dissociés de DRG à l’aide de tissus DRG de souris isolés. Ces modèles aident à étudier divers mécanismes d’interactions neurones-gliales dans un environnement contrôlé.

Génération d’un explant ganglionnaire racinaire dorsal et d’une culture cellulaire dissociée

Cette vidéo démontre la génération d’un modèle de lésion neuronale dans les neurones primaires du granule cérébelleux de souris. Il décrit les étapes impliquées dans l’induction de lésions neuronales à l’aide de NMDA, un agoniste des récepteurs de neurotransmetteurs excitateurs, et de glycine, un co-agoniste. Le NMDA et la glycine se lient à des récepteurs neuronaux spécifiques, provoquant leur surstimulation et entraînant un afflux massif de calcium intracellulaire, ce qui entraîne des...

Modélisation des lésions neuronales dans les neurones granulaires cérébelleux primaires de souris

Cette vidéo décrit la génération d’un modèle de lésion neuronale à l’aide d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les neurones primaires du cervelet de souris. Il détaille le processus d’induction du stress oxydatif par l’ajout de fortes concentrations de peroxyde d’hydrogène. L’exposition aux ROS provoque des cassures de brins d’ADN et une instabilité génomique. De plus, l’oxydation des protéines cellulaires altère leurs fonctions, tandis que la peroxydation lipidique compromet l’intégrité...

Modélisation de la mort neuronale induite par les espèces réactives de l’oxygène dans les neurones des granules cérébelleux de souris

modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d'isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l'embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.

Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Dans cet article, nous décrivons, en détail, un protocole pour la génération des cultures de neurosphère à partir de cellules souches neurales de souris postnatales dérivées des principales niches neogènes de souris. Les neurosphères sont utilisées pour identifier les cellules souches neuronales à partir de tissus cérébraux permettant l’estimation du nombre de cellules précurseurs. En outre, ces structures 3D peuvent être plaquées dans des conditions différenciatives, donnant lieu à des...

Isolement et expansion des neurosphères des niches neurogéniques de souris postnatales (P1-3)

Le modèle d’inoculation de la carte de pied est un outil précieux pour caractériser les réponses neuroinflammatoires induites par le virus in vivo. En particulier, il fournit une évaluation claire de la cinétique virale et des processus immunopathologiques associés initiés dans le système nerveux périphérique.

Modèle d’inoculation de tapis de souris pour étudier les réponses neuroinflammatoires virales induites

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement in vitro de plusieurs populations de cellules gliales à partir d’un SNC de souris. Cette méthode permet la ségrégation de la microglie régionale, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des astrocytes pour étudier les phénotypes de chacun dans une variété de systèmes de culture.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

Nous présentons un modèle in vitro pour évaluer la capacité neurorégénérative olfactive d’ensheathing de glia (OEG), après dommages neuronaux. Il est basé sur une coculture de neurones ganglionnaires rétiniens adultes axotomisés (RGN) sur les monocouches OEG et l’étude subséquente de la régénération axonale, en analysant les marqueurs axonals et somatodendritiques RGN.

Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

Ce protocole présente une façon unique de générer des cultures cellulaires du système nerveux central à partir de cerveaux de souris embryonnaires du jour 17 pour la recherche en neuro(immuno)logie. Ce modèle peut être analysé à l’aide de diverses techniques expérimentales, notamment la RT-qPCR, la microscopie, l’ELISA et la cytométrie en flux.

Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée

Ce protocole décrit l’expression ectopique de Neurod1 à médiation virale après un AVC ischémique cortical. Neurod1 est administré (1) à l’aide du système AAV Cre-Flex chez des souris de type sauvage pendant la phase subaiguë post-AVC (7 jours) et (2) à l’aide d’un seul vecteur AAV chez des souris rapporteures conditionnelles pendant la phase chronique post-AVC (21 jours).

Systèmes AAV et modèles murins pour l’étude de l’expression ectopique de Neurod1 dans des cellules transduites à des moments subaigus et chroniques post-AVC ischémique

Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée pour isoler la rétine de l’œil de la souris pour une expérimentation ex vivo étendue. Ce protocole vise à rendre cette approche techniquement exigeante accessible aux chercheurs qui souhaitent tirer parti des avenues de recherche offertes par le maintien de la glie rétinienne in situ dans les tissus vivants.

Un modèle d’explant ex vivo pour étudier les interactions gliales dans la rétine de la souris

Découvrez la culture de ganglions rachidiens de souris adulte pour étudier la neuroplasticité et les réponses aux infections virales. Cette méthode ex vivo permet d'analyser les interactions neuronales et gliales.

Souris adulte DRG Explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’Infection virale (Vidéo) | JoVE Journal

Souris adulte DRG Explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’Infection virale

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