Name: Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez la synthèse de nanoparticules d'or de 10 nm revêtues de polymère pour le ciblage de l'endothélium et la livraison thérapeutique. Cette méthode biocompatible permet l'imagerie et la personnalisation pour des applications cardiovasculaires.

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Ce travail a été soutenu par le département de génie chimique Université Northeastern, fonds d’amorçage et une bourse d’études de pilote Tier 1 de la Northeastern University Provost Office, NIH K01 HL125499 et NSF-IGERT accordent NSF/DGE-096843. Les auteurs tiens également à remercier Thomas J. Webster et son laboratoire pour leur aide ainsi que de la nanomédecine Science et Technology Center et Département des Sciences pharmaceutiques à la Northeastern University.

1. la préparation ou l’acquisition de Solutions mères (doivent être conservés à température ambiante ou au congélateur jusqu'à utilisation)
<ol><li>Préparer une solution 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) en dissolvant 400 mg NaOH dans 10 mL d’eau ultrapure à température ambiante et bien mélanger les matières. NOTE : L’eau Ultrapure est définie comme l’eau sans impuretés telles que particules, bactéries, nucléases, des ions ou des traces de matières organiques. Un système de purification est utilisé pour obtenir l’eau ultrapure, entraînant sa résistivité de jusqu'à 18,2 mΩ·cm, ce qui indique une faible contamination anionique. L’utilisation de l’eau ultrapure embouteillée commercialement disponible n’est pas recommandée. Désormais, cette eau ultrapure désignera pour que l’eau, sauf indication contraire.</li>
	<li>Préparer une solution NaOH 6M en dissolvant 2,4 g de NaOH dans 10 mL d’eau et conserver la solution à température ambiante.</li>
	<li>Préparer une solution d’acide chloraurique (HAuCl4) 250 mM en dissolvant 1 g secs HAuCl4 à 10,16 mL d’eau. Diluer 1 mL de 250 mM HAuCl4 avec 9 mL d’eau pour obtenir la concentration de travail de 25 mM HAuCl4. Stocker la solution de4 HAuCl à la température ambiante.</li>
	<li>Préparer un tampon de carbonate de 0,1 M à pH 8,8, dissoudre le bicarbonate de sodium de 84 mg dans 10 mL d’eau et en ajustant le pH à 8,8 par ajout de 6 M de NaOH à l’étape 1.2. Stocker le tampon de carbonate à température ambiante.</li>
	<li>Mélangez 20 mL de tétrazolium composé, 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium sel (MTS), avec un agent stabilisant, phénazine ethosulfate (PES) (voir la Table des matières). Conserver le mélange MTS/PES dans parties aliquotes (pour un maximum de 10 cycles de gel-dégel) à-20 ° C dans l’obscurité.</li>
</ol>2. synthèse des nanoparticules or coeurs
<ol><li>Préparer une solution diluée de THPC en ajoutant 12 µL de 80 % THPC dans l’eau à 1 mL d’eau dans un tube à microcentrifugation à température ambiante.</li>
	<li>Fixer un ballon à fond rond de 100 mL au centre d’une plaque d’agitation magnétique. Versez 45 mL d’eau dans la fiole et agiter l’eau à 300 tr/min en utilisant une barre de petite agitation magnétique en forme de œuf. Ajouter 0,5 mL de 1 NaOH M et 1 mL de solution diluée de THPC. Continuez à remuer le mélange réactionnel vigoureusement pendant 5 min.</li>
	<li>Continuez à remuer le mélange et ajouter 2 mL de 25 mM HAuCl4 solution. La couleur du mélange passe du jaune au brun foncé dans les secondes, indiquant que la formation de THPC plafonné AuNPs avec une charge négative. Agiter le mélange pendant une 15 minutes supplémentaires permettre la formation complète des noyaux or.</li>
</ol>3. Ajout de la Couronne de polymère autour des nanoparticules d’or
<ol><li>Pendant la période de 15 min indiquée au point 2.3, préparer la cheville solutions par dissolution de chacun des éléments suivants dans 1 mL d’eau dans des flacons en verre 4 mL : 30 mg NH2-PEG-SH ; 7,5 mg m-PEG-SH ; 7,5 mg COOH-PEG-SH. Remarque : Les concentrations résultantes doivent être 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH et 3,75 M COOH-PEG-SH.</li>
	<li>Après avoir réduit la vitesse d’agitation de la solution dans le ballon à 100 tr/min, ajouter que les solutions de PEG à la solution de THPC plafonné AuNPs goutte à goutte. Continuez à remuer le mélange doucement pendant la nuit, à température ambiante, afin d’assurer une élimination efficace des THPC et le remplacement par PEG.</li>
	<li>Pour le prochaine 72 h, utiliser une membrane de cellulose coupure de 12-14 kDa poids moléculaire pour dialyser le mélange agité contre un seau de 4 L d’eau agité à 60 t/mn. Nouer les extrémités des membranes par des clips de dialyse et transvaser la solution par l’intermédiaire de pipette. Remarque : Ce processus de dialyse avec la membrane coupure de 12-14 kDa ne supprime que PEG n’ayant pas réagie, THPC et autres réactifs chimiques, par la diffusion le long d’un gradient de concentration.</li>
	<li>Pour maintenir le gradient de concentration élevé et promouvoir la diffusion continue, changez l’eau toutes les 2 h pour les 6 premières heures et toutes les 6 à 12 h pour le restant de 66 h. Remarque : L’objectif de la présente annexe de changement de l’eau est d’accueillir la diffusion rapide qui se produit dès le départ, en raison de la concentration initialement élevée au sein de l’échantillon. Le processus de dialyse susmentionnés feuilles de la solution de nanoparticules semi-purifiée, parce que les nanoparticules, précipités, les agrégats et autres impuretés de grande taille ne peut pas passer à travers les pores de la membrane coupure de 12-14 kDa.</li>
	<li>Filtrer la solution de nanoparticules semi-purifiée dans un tube conique de 50mL à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm pour éliminer les précipités restantes, les agrégats et autres impuretés de grande taille.</li>
	<li>Placer le tube à fond conique dans un congélateur à-80 ° C et laisser la solution purifiée de PEGylated AuNP (PEG-AuNP) de geler pendant environ 5 h.</li>
	<li>Utiliser un sécheur de gel à lyophiliser le PEG-AuNP purifiée.</li>
	<li>Conserver le PEG-AuNP sec et purifié à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>4. conjugaison des Fluorophores à l’aide de N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester sur les NH2 groupes sur le PEG-AuNP
<ol><li>Fixer un ballon à fond rond 50 mL sur le centre d’une plaque d’agitation magnétique. Remplir le flacon 18 ml d’eau et agiter l’eau à 100 tr/min à l’aide d’une barre d’agitation magnétique en forme de œuf.</li>
	<li>Peser 2 mg de la PEG-AuNP lyophilisée dans un tube conique de 4 mL, à l’aide d’une échelle de benchtop de haute précision. Utilisez un pistolet antistatique pour éliminer la charge statique et s’accrochant de la poudre de PEG-AuNP à la surface du tube. Ajouter 2 mL d’eau dans le tube. Versez les 2 mL PEG-AuNP solution dans le ballon pour davantage de reconstitution dans un total de 20 mL d’eau. Continuez à remuer le mélange à 100 tr/min à l’aide d’une barre d’agitation magnétique en forme de œuf.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 0,1 M, pH 8,8 carbonate de tampon à la 20 mL de reconstitué AuNP contenue dans le ballon. Continuer à remuer.</li>
	<li>Ajouter 5 µL de l’ester de NHS fluorescent 10 mg/mL dans le diméthylsulfoxyde. Remarque : N’importe quel colorant fluorescent peut être utilisé dans ce processus. Remuer la cheville fluorescente du jour au lendemain. Gardez-le à température ambiante et recouverts de papier.</li>
	<li>Pour le prochaine 72 h, enlever des fluorophores excès en utilisant le protocole décrit à l’étape 3.3. En bref, dialyser le mélange brassé à l’aide d’un seau de 4 L d’eau et d’une membrane de cellulose coupure de 12-14 kDa poids moléculaire. Changez l’eau toutes les 2 h pour les 6 premiers h et toutes les 6 à 12 h pour le restant de 66 h.</li>
	<li>Obtenir 1 mL de la solution purifiée de PEG-AuNP fluorescente, à utiliser pour la caractérisation décrite ci-dessous dans la section 5. Gel et lyophiliser le reste de la solution afin d’obtenir des nanoparticules fluorescentes sous forme de poudre pour le stockage à 4 ° C, comme indiqué aux paragraphes 3.5 à 3.7.</li>
	<li>Utilisez un filtre de seringue 0,2 µm pour stériliser et enlever tout précipités potentielles une fois reconstituées pour applications de culture de cellules.</li>
</ol>5. caractérisation des nanoparticules fluorescentes pégylé or
<ol><li>Pour visualiser le noyau de la NANOPARTICULE or et quantifier les tailles à l’aide de microscopie électronique à transmission (TEM)<ol>
<li>Déposer 10 µL de la solution purifiée de PEG-AuNP fluorescente vers une grille de TEM de maille de carbone enduit.</li>
		<li>Après 5 min, utilisez un morceau de papier filtre à mèche soigneusement le liquide en excès loin du bord de la grille TEM jusqu'à un film contenant les fluorescentes que PEG-AuNPs est laissé pour compte.</li>
		<li>Découvre le PEG-AuNPs fluorescent à 80 kV et à un grossissement de 50 000-150 000. Prendre des photos numériques. Remarque : Uniquement le noyau or sera visible parce que la cheville n’est pas dense sur le TEM aux électrons.</li>
		<li>À l’aide d’un logiciel de mesure, de définir l’échelle de mesure en corrélation avec la barre d’échelle. Calculer le diamètre d’environ 20 cœurs or et ensuite déterminer le diamètre de noyau or moyen. Remarque : Le système d’imagerie TEM place automatiquement une échelle graphique sur les photos numériques.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesure de la taille de nanoparticules hydrodynamique à l’aide de diffusion dynamique de la lumière (DLS)<ol>
<li>Transférer 1 mg de lyophilisé THPC-enduit AuNPs dans un tube de microcentrifuge à l’aide de l’approche décrite à l’étape 4.2. Le transfert de 1 mg de PEG-AuNP lyophilisé dans une éprouvette. Ajouter 1 mL d’eau dans chaque tube et transférer chaque solution AuNP à un 1 mL en plastique transparent.</li>
		<li>Placez une cuvette dans un instrument DLS et mesurer les diamètres hydrodynamiques sphériques en utilisant le logiciel d’analyseur de particules qui est intégré dans le système de listes de distribution.</li>
		<li>Tracer les diamètres hydrodynamiques mesurés à l’aide d’un format d’histogramme. Remarque : L’histogramme regroupera les nanoparticules de taille. Le plus grand groupe de nanoparticules permettra de clarifier le diamètre qui correspond le mieux à la taille de la AuNPs synthétisés dans le présent protocole.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmation de fluorescence fluorimétrique Remarque : Le même échantillon et la cuvette de l’étape 5.2 peuvent servir à mesurer le signal fluorescent.<ol>
<li>Retirez la cuve de la DLS et insérez un spectrofluorimètre. Ensemble des signaux de la longueur d’onde d’excitation à 633 nm et lire la fluorescence émise le long d’une plage de longueur d’onde de 650 à 800 nm.</li>
		<li>Confirmer que le pic est environ 665 nm, qui correspond au pic d’émission pour le NHS. Remarque : Ajuster les longueurs d’onde d’excitation et d’émission selon le fluorophore utilisés dans le processus.</li>
	</ol></li>
	<li>11 afin d’évaluer la biocompatibilité de dosage de MTS<ol>
<li>Dans un fond transparent 96 puits stériles vitroplants traités sur plaque, pipette 100 µL de milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline/streptomycine) et 3,2 x 103 cellules dans chaque puits. Remarque : Dans cette étude, les cellules endothéliales de rat coussinets adipeux sont utilisés. Un total de 21 puits sont utilisés pour permettre 3 répétitions pour chacune des 7 concentrations différentes de nanoparticules (Voir l’étape 5.4.3 pour des concentrations spécifiques d’intérêt).</li>
		<li>Laissez les cellules à confluence en humidité et 5 % CO2 contrôlée incubateur à 37 ° C11.</li>
		<li>Préparer les tubes de microcentrifuge individuels, chacun contenant 300 µL de DMEM avec des nanoparticules de diverses concentrations. Cette étude nécessite 7 différents tubes de DMEM avec les concentrations suivantes de PEG-AuNP : 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL et 1 000 µg/mL.</li>
		<li>Aspirer le DMEM du tube. Remplir les puits en trois exemplaires avec 100 µL de milieu DMEM contenant du 0, 10, 50, 100, 250, 500 ou 1 000 µg/mL de AuNP.</li>
		<li>Laissez les cellules et les nanoparticules co incubés pendant une durée prédéterminée, ici pendant 16 h.</li>
		<li>Vers la fin de la période d’incubation, décongeler le mélange MTS/PES de l’étape 1.5.</li>
		<li>Après incubation, aspirer le DMEM et les nanoparticules suspendus, lâchement attachés par les puits. Ajouter 100 µL de DMEM fraîche avec 20 µL de solution MTS/PES pour obtenir 1:5 MTS/PES ratio DMEM selon le protocole du fabricant. Incuber les cellules avec MTS/PES à 37 ° C pendant 2 h. Remarque : Ce temps d’incubation de 2 h est déterminé par l’activité métabolique des cellules endothéliales et peut être augmenté jusqu'à 4 h pour les autres types de cellules. Dans le délai de 2 h, le système commercial multilatéral est métabolisé par les cellules endothéliales en formazan colorée qui mêle le DMEM. Biocompatibilité des PEG-AuNP et la probabilité de la viabilité cellulaire seront en démonstration avec formazan plus coloré. Toxicité du PEG-AuNP et la possibilité que les cellules meurent s’affichera avec des couleurs moins intenses.</li>
		<li>Effectuer une analyse colorimétrique de chaque puits par lecture d’absorbance à 492 nm avec un lecteur compatible.</li>
		<li>Pour chaque concentration de nanoparticules, calculer l’absorbance moyenne de valeurs d’absorbance en triple. Diviser l’absorption moyenne de la valeur obtenue par absorption dans les puits contenant des nanoparticules 0 µg/mL en moyenne. Remarque : Ces puits contenant aucune AuNPs servent de commandes pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire en réponse aux nanoparticules traitement administré dans les autres puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluation de microscopie confocal fluorescence de nanoparticules absorption dans les cellules endothéliales adhérentes avec glycocalyx intacts ou dysfonctionnel11<ol>
<li>Semences 1,0 x 104 cellules/cm2 rat gras touche des cellules endothéliales sur couvre-objet en verre stérile 12 mm et nourrir les cellules avec DMEM additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline/streptomycine. Laissez les cellules à se développer à confluence pleine d’humidité et de CO2 contrôlée incubateurs à 37 ° C, pendant environ 3 jours.</li>
		<li>Ajouter des traitements pour modifier le glycocalyx, le cas échéant. Par exemple, 2 h de traitement des cellules endothéliales cultivées avec 2,5 x 10-6 IU héparinase enzyme III dégrade le glycocalyx par clivage spécifiquement sa composante de sulfate d’héparane. NOTE : Glycocalyx sain peut être modélisé par les cellules endothéliales de plus en plus comme indiqué au point 5.5.1 sans l’ajout d’enzymes de dégradation.</li>
		<li>Avec le glycocalyx endothélial laissés intacts ou rendu dysfonctionnel, incuber les cellules endothéliales avec AuNPs fluorescent à 550 µg/mL pendant 16 h ou autre moment désiré.</li>
		<li>Laver délicatement les cellules avec 2 mL de 37 ° C 1 % d’albumine sérique bovine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; contenant 100 mg/L de calcium et de magnésium 100 mg/L). Plonger les cellules dans 2 mL de paraformaldéhyde à 2 % et 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBS et laisser les cellules à fixer pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Enlever la solution de fixation d’aldéhyde et laver les cellules avec température ambiante PBS pour trois cycles de 5 min.</li>
		<li>Avant l’application de l’anticorps primaire, exposer les cellules endothéliales au sérum de chèvre de 2 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les sites de fixation non spécifique. Les cellules doivent être entièrement couverts par la solution de saturation.</li>
		<li>Incuber les cellules endothéliales du jour au lendemain avec 1 % anti-héparane sulfate primaire un anticorps dans le sérum de chèvre de 2 % dans du PBS à 4 ° C d’étiqueter la composante de sulfate d’héparane du glycocalyx. Assurez-vous que les cellules fixes sont entièrement en contact avec la solution d’anticorps.</li>
		<li>Le lendemain, lavez l’anticorps avec température ambiante PBS pour trois cycles de 10 min.</li>
		<li>Incuber les cellules endothéliales avec dilution de 1 : 1 000 de l’anticorps secondaire fluorescent approprié pendant 30 min à température ambiante, dans le sombre ou recouverte de papier d’aluminium.</li>
		<li>Lavez l’anticorps secondaire avec température ambiante PBS pour trois cycles de 10 min.</li>
		<li>Monter la lamelle sur lames de microscope utilisant un milieu anti-fondu montage contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) pour la coloration des noyaux. Sceller les bords de la lamelle à l’aide de vernis à ongles.</li>
		<li>Image de la cellule endothéliale immunomarquage fluorescent échantillons avec la microscopie confocale, à l’aide de canaux bleus, vert et rouges sombre pour visualiser les noyaux, héparane sulfate glycocalyx et les nanoparticules, respectivement.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+magnetic+nanoparticles+for+targeted+drug+delivery+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugated+polymer+nanoparticles+for+drug+delivery+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Cette technique est une méthode efficace pour la synthèse personnalisable, que PEG ultrapetits enduit AuNPs. Une partie importante de cette procédure est que la formation initiale des THPC plafonné or nanoparticles, qui peut être confirmé par le changement de couleur du jaune au brun qui se produira après que HAuCl4 a été ajouté au contenu dans le ballon (étape 2.3 du protocole). Aucun changement de couleur n’indique qu’il n’y a aucun nanoparticules formés et que des premières mesures devraient être vérifiés et répétés avant de procéder. Dans le cas de que la couleur passe à autre chose que le brun comme le vin rouge ou gris, les particules qui en résulte ne sera probablement pas autour de la cible 2,5 nm et convient aussi bien un nouveau lot.
Après la formation du noyau or, l’échange de THPC PEG et les procédures de purification contient plusieurs étapes clés pour la réussite du protocole. Mélange du jour au lendemain permet la réaction de remplacement aller jusqu'à la fin. Échec de purification peut se produire si l’eau de dialyse n’est pas modifiée avec la fréquence prescrite. L’agrégation et la précipitation des particules peuvent également se produire si les particules sont laissés dans la dialyse pendant plus de 72 h. Autres problèmes potentiels a peuvent être observées au cours de la lyophilisation. Si la cheville ultrapetits enduit AuNP solution n’était pas complètement gelée ou si le lyophilisateur n’était pas configuré correctement, les échantillons peuvent être perdues. Reportez-vous au manuel lyophilisateur, car certains appareils peuvent exiger des différentes préparations.
La facilité de synthèse et de la biocompatibilité des particules qui en résultent représentent des avantages pour l’utilisation de ces PEG-AuNPs. En outre, ces nanoparticules ont l’avantage de pouvoir interagir avec Nano structures cellulaires, comme en témoigne la capacité d’identifier le glycocalyx dégradée par l’absorption de ces nanoparticules. Cet avantage peut être exploité pour le développement de nouveaux traitements de l’athérosclérose et des mesures préventives. Au-delà de ce que nous présentons ici, un autre avantage de ce protocole est qu’il permet une personnalisation étendue des particules ainsi augmenté de stabilité et de capacités de stockage en attachant le thiol contenant PEG sur les nanoparticules d’or4. L’autre extrémité de la chaîne de cheville peut contenir n’importe quel groupe fonctionnel, et une myriade de molécules peut être conjuguée à ces groupes. Dans le présent protocole, les trois groupes fonctionnels communs sont attachés (méthyl, carboxyle et aminés). Le ratio de la cheville est choisi de prioriser la détection par fluorescence tout d’abord, puis la capacité d’incorporer une portion de ciblage secondaire à l’aide du groupe d’acide carboxylique. Les rapports de ces groupes peuvent être modifiés selon l’application, et les longueurs et les formes des polymères peuvent être réglés aussi bien.
Pour mesurer l’absorption de particules, nous avons conjugué une sonde fluorescente à l’un des groupes fonctionnels. Il est à noter que toute la conjugaison au-delà de ce que nous avons décrit se traduira par un changement des propriétés de surface de la NANOPARTICULE. Chaque itération des nanoparticules en ce qui concerne les réactions de conjugaison et de composants supplémentaires devrait être testée pour les propriétés désirées.
Cette méthode produit des nanoparticules d’or ultrapetits vise à surmonter les propriétés défensives du glycocalyx endothélial extracellulaire, qui freine l’absorption des nanoparticules classiquement de tailles. Cependant, la petite taille se prête à la difficulté dans l’imagerie et l’aspect de chargement de drogue. Ces particules sont significativement plus petites que les tailles de nanoparticules typique, et ainsi la surface disponible pour les pièces jointes des thérapeutiques et ciblant les moitiés est nettement diminuée. Cela peut entraîner des difficultés ramasser des signaux individuels dans l’imagerie des applications, bien que les amas de particules puissent toujours être aisément identifiés, comme le montre les images confocales. La surface réduite pour les pièces jointes du ciblage des ligands et la thérapeutique peut exiger plus de particules pour être administré pour atteindre les exigences en matière de dosage cible. Cependant, les particules plus petites sera plus efficaces dans la prestation en tenant compte de la glycocalice.
Ces nouvelles particules ultrapetits sont capables de la livraison en difficile pour atteindre les zones de nanoscale dans le corps avec une perturbation minimale du microenvironnement. L’ajout de la cheville permet une biocompatibilité et propose des groupes fonctionnels pour la personnalisation lourde des particules pour diverses applications. La plus petite taille par rapport aux nanoparticules typiques est livré avec quelques lacunes, mais si développé stratégiquement, la particule ultrasmall est une approche prometteuse pour l’hébergement des difficiles à pénétrer, glycocalyx complexe et fragile en vasculaire livraison de ciblage et de la drogue.

NANOPARTICULES ont été appliquées à l’administration de médicaments et d’imagerie pour sa capacité à naviguer à travers le corps pour atteindre des zones cibles d’intérêt1,2. Les particules peuvent s’accumuler dans les tumeurs via le système vasculaire qui fuit ou localiser où un ligand de la cible est surexprimé et exposé. Or, précisément, est devenu un matériau de nanoparticules couramment utilisés en raison de ses propriétés chimiques et physiques uniques qui affectent le transport et la libération de produits thérapeutiques3. Or est un matériau de nanoparticules efficace car sa surface peut être modifiée pour lier des thiols et a haute biocompatibilité en raison de sa faible toxicité4. AuNPs sont susceptibles d’être porteurs de grandes biomoléculaire médicaments et ont réussi à livrer des peptides, acides nucléiques et des protéines, ce qui permet de AuNPs d’être favorables afin de cibler les2,4.
Malheureusement, l’efficacité thérapeutique de livraison nanoparticules a été entravée par le glycocalyx chargé négativement, qui est la couche extracellulaire sur la membrane des cellules de mammifères plus et a la taille des pores jusqu'à 7 nm5,6. Cette taille des pores est plus petite que la plupart des nanoparticules transporteurs drogues, qui ont des diamètres typiques allant de 50 à 200 nm. Dans des conditions de la maladie, ces pores glycocalyx deviennent plus importante en raison de la dégradation, augmentation de la perméabilité grâce aux cellules endothéliales. Cependant, la plupart des nanoparticules sont encore trop grandes pour profiter de ce changement structurel dans le glycocalyx. Une des conséquences de cette différence de taille est que classiquement de taille de particules n’interagissent pas favorablement avec les cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins. Cela affecte la livraison de particules administrées par voie intraveineuse à l’endothélium et peut aussi être dit du transport des particules à travers le sang cerveau barrière7,8,9,10.
Une approche pour lutter contre ce problème consiste à utiliser des particules plus petites pour passer à travers les petits pores dans le glycocalyx. Ici, nous avons synthétiser un 10,5 nm ultrapetits or NANOPARTICULE, qui devrait normalement être dissuadés de glycocalyx intact, en bonne santé. Dès que le glycocalyx commence à être compromise, la NANOPARTICULE doit pénétrer facilement dans les cellules par l’intermédiaire de la taille croissante des pores. Le protocole dans le présent document détaille une synthèse du ultrapetits core or recouvert de PEG, qui augmente la biocompatibilité et réduit la clairance systémique4. La cheville peut également contenir plusieurs types de groupements fonctionnels, ouvrant des possibilités de conjugaison du ciblage des ligands, fluorophores et thérapeutique. Auparavant, les résultats publiés indiquent que ces nanoparticules ultrapetits ont tendance à être absorbé plus favorablement dans les régions de glycocalyx endothéliale perturbée fonction même sans n’importe quel actif ciblant4,11. Ceci indique la faisabilité et l’importance de l’utilisation de particules d’une taille correcte pour les applications de la livraison. Le protocole suivant présente la synthèse, la purification et la caractérisation de l’enduit de PEG AuNPs (PEG-AuNP), la discussion pour adapter les groupes fonctionnels et les conjugaisons pour d’autres applications.

<table><tbody><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’or (III) trihydraté (HAuCl4.3H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de phosphnium Tetrakis (hydroxyméthyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-thiol monofonctionnel</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td>Mw : 2 000 Da</td></tr><tr><td>hétéro bi-fonctionnel anime-PEG-thiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>NH2-PEG-SH-3400-1g</td><td>MW : 3 400 Da</td></tr><tr><td>Carboxyméthyl-PEG-thiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>CM-PEG-SH-2000-1g</td><td>Mw : 2 000 Da</td></tr><tr><td>Membrane de dialyse cellulosique (12-14 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td></td></tr><tr><td>Instrument antistatique Zerostat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z108812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647) acide carboxylique ester succinimidylique</td><td>Fisher</td><td>A20006</td><td>Fluorophore</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cercles de papier filtre ordinaire de qualité qualitative - P5</td><td>grade Thermo Fisher Scientific</td><td>09-801-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à transmission</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JEM-1000</td><td>TEM</td></tr><tr><td>Diffusion dynamique de la lumière</td><td>Brookhaven Instruments Corporation</td><td>Brookhaven 90 Plus Analyseur de taille</td><td>de particules DLS</td></tr><tr><td>Fluorimètre</td><td>Horiba Scientific</td><td>Jobin Yvon Fluromax 4</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Cell Propagation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Molecular Devices SpectraMax</td><td>M4</td><td>Lecteur de plaques</td></tr><tr><td>10E4 épitope HS souris monoclonal IgM (anticorps primaire)</td><td>Amsbio</td><td>370255</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (anticorps secondaire)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37120</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>VECTASHIELD support de montage avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Avec</td></tr><tr><td>microscope confocal</td><td>DAPI Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 700</td><td>Microscopie Confocol</td></tr></tbody></table>

synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et medicaments

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Nanoparticules d’or (AuNPs) ont été largement utilisés dans la recherche médicale en raison de leur taille, leur biocompatibilité et surface modifiable. Remise spécifique de ciblage et de la drogue sont quelques-unes des applications de ces AuNPs, mais l’absorption de particules panier des endothéliales matrices extracellulaires propriétés défensives. Pour résoudre ce problème, nous décrivons une méthode de synthèse de nanoparticules d’or ultrapetits améliorer la prestation vasculaire, avec des groupes fonctionnels personnalisables et longueurs de polymère réglage supplémentaire. Le protocole rendements 2,5 nm AuNPs qui sont recouvertes de chlorure de tétrakis (hydroxyméthyl) phosphonium (THPC). Le remplacement de THPC avec hétéro-fonctionnelle polyéthylène glycol (PEG) sur la surface de la AuNP augmente le rayon hydrodynamique à 10,5 nm tout en offrant différents groupes fonctionnels sur la surface. La dernière partie du protocole comprend un ajout optionnel d’un fluorophore pour permettre le AuNPs à visualiser sous fluorescence pour suivre les nanoparticules absorption. Dialyse et lyophilisation servaient de purifier et d’isoler le AuNPs. Ces nanoparticules fluorescentes peuvent être visualisées dans des expériences in vitro et in vivo en raison de la biocompatible sondes PEG enduite et fluorescente. En outre, la gamme de taille de ces nanoparticules rendent une candidate idéale pour sonder le glycocalyx sans perturber la fonction système vasculaire normale, ce qui peut conduire à améliorer l’exécution et la thérapeutique.

Le AuNPs synthétisés, recouverts de THPC ou PEG (Figure 1 a et Figure 1 b, respectivement), sont imagés avec TEM et les particules de tailles sont évalués en utilisant le TEM et les listes de distribution pour assurer la distribution de taille appropriée de nanoparticules. La figure 2 illustre l’image TEM d’un échantillon de THPC-AuNP à 80 kV et 150 000 x grossissement. Les diamètres de la gamme THPC-AuNP de particules de 2 à 3 nm, basé sur la barre d’étalonnage dans les images TEM. Cette taille THPC-AuNP est également évidente dans l’histogramme de mesure taille DLS illustré à la Figure 2, à qui la THPC enduit AuNP s’est avéré avoir un pic à 2,5 nm. PEGylation n’est pas visible sous TEM comme les polymères ne sont pas denses aux électrons. L’imagerie TEM d’échantillons PEG-AuNP confirme simplement la présence des particules dispersées, ce qui est prévue parce que la Couronne de polymère de PEG autour de nanoparticules de l’aide dans la prévention de l’agrégation. Pour ces exemples de PEG-AuNP, l’histogramme de mesure de taille DLS montre un changement dans le pic, à environ 10,5 nm sur les listes de distribution. Pièces jointes d’autres ligands ou médicaments sur des groupes fonctionnels affectera la taille de la NANOPARTICULE, aussi bien et devraient prendre en considération lors de la mesure du diamètre.
L’ajout de fluorophore (Figure 1) est confirmé en utilisant un fluorimètre pour mesurer le signal de fluorescence de l’échantillon de nanoparticules, comme illustré à la Figure 3. Lorsqu’il est excité avec une longueur d’onde 633 nm, l’émission est mesurée pour avoir un maximum entre 660 et 672 nm, qui correspond à des informations de produit du fabricant de rayonnement maximum 665 nm. Raccordement d’autres sondes fluorescentes doit être vérifiée de manière similaire pour assurer une réponse fluorescente.
La biocompatibilité des particules et la viabilité cellulaire connexes sont évalués en utilisant le test MTS pour contrôler le métabolisme cellulaire relative de MTS après 16 h d’incubation avec différentes concentrations de nanoparticules. Le fluorophore conjugués PEGylated AuNPs ne montre aucune toxicité importante, comme en témoigne les niveaux semblables de la viabilité cellulaire à toutes les concentrations jusqu'à 1 mg/mL (Figure 4 a). Cette biocompatibilité peut changer selon la thérapeutique ou le ligand attaché aux groupes fonctionnels restants pour personnaliser davantage les particules. Pièce détachée de drogue ont tendance à augmenter la toxicité, mais selon les concentrations de travail, il peut ne pas affecter la viabilité d’une manière significative.
Absorption de fluorescent, PEGylated AuNPs (Figure 1) par les cellules adhérentes est évaluée au moyen de cellules endothéliales cultivées de rats coussinets adipeux avec intact ou dysfonctionnel glycocalyx (Figure 4 b). Les conditions de glycocalyx dysfonctionnel sont obtenues par ajout d’enzyme III héparinase à la culture, ce qui a entraîné une dégradation de la composante de glycocalyx héparane sulfate et compromettre la matrice12. Figure 4 b montre les différents niveaux d’absorption du PEG-AuNPs, comme des points rouges sur la vue en coupe des cellules endothéliales représentatives. Un glycocalyx sain décourage l’absorption de ces nanoparticules d’or, mais une augmentation importante est observée lorsque l’enzyme est travailleur11. Ce résultat met en évidence le potentiel de ces nanoparticules ultrapetits d’offrir des produits thérapeutiques aux cellules endothéliales de manière contrôlée par des interactions distinctes qui sont basées sur la santé de glycocalyx.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig1.jpg"> Figure 1 : schémas de nanoparticule or. (A) THPC enduit AuNP nanosphere avant remplacement de PEG. (B) PEGylated AuNP avec 3 types de terminaisons de PEG, y compris COOH, NH2et CH3. Vagues bleues représentent le polymère. (C) conjugués des nanoparticules pour l’imagerie de fluorescence. Étoiles rouges montrent les fluorophores conjugués au NH2 des groupes fonctionnels. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig2.jpg"> Figure 2 : taille des mensurations des nanoparticules d’or. A gauche : TEM de nanoparticules d’or avant l’addition de PEG à 80 kV et un grossissement de X 150 000, avec barre d’échelle indiquée. A droite : Histogramme de la taille de la NANOPARTICULE mesurée par DLS avant (AuNP) et après (PEG-AuNP) le THPC remplacement par PEG. Les résultats DLS pour enduit THPC AuNP quantifient ce qui est visualisé en TEM. Les résultats de DLS PEG-enduit AuNP surmonter le défi de l’impossibilité de visualiser le PEG de TEM en raison de ces polymères n’est ne pas dense aux électrons. Un TEM de PEG-AuNP montrera seulement les nanoparticules de base or et aura la même apparence comme un diablotin THPC AuNP. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig3.jpg"> Figure 3 : données de Fluorescence de la fluorescence PEG-AuNP. Le pic de fluorescence à 667 nm matches, l’émission du fluorophore conjuguée au PEG-AuNP. A. u. : unités arbitraires.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig4.jpg"> Figure 4 : Cell interactions avec le PEG-AuNP fluorescent. (A) parcelle de viabilité (métabolisme MTS) cellule pour fat rat pad cellules endothéliales après incubation co 16 h avec PEG-AuNP fluorescent. (B) des images en coupe Confocal de graisse rat fixe touche des cellules endothéliales colorées au DAPI pour les noyaux (bleus) et les anticorps contre l’héparane sulfate, un composant de glycocalyx (vert). Image du haut est un glycocalyx sain et bas est une couche de glycocalyx dégradées ; Il y a significativement plus de fluorescence rouge de nanoparticules dans l’échantillon avec le glycocalyx dégradée. Barre d’échelle est 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous décrivons une méthode de synthèse de nanoparticules or biocompatibles de 10 nm, fonctionnalisés par revêtement poly-éthylène glycol sur la surface. Ces particules peuvent être utilisés in vitro et in vivo pour livrer des produits thérapeutiques à échelle nanométrique des espaces cellulaires et extracellulaires qui sont difficiles d’accès avec des tailles de nanoparticules classiques.

Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser des nanosphères d’or fonctionnalisées recouvertes de polymères de 10 nanomètres de diamètre, biocompatibles, ayant un temps de circulation prolongé et pouvant être imagées par microscopie à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en cardiologie sur la perméabilité de l’endothélium dans des conditions pathologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle crée des particules ultra-petites biocompatibles qui ont des groupes fonctionnels disponibles pour une personnalisation plus poussée.Tout d’abord, dans un micro tube à centrifuger, diluez 12 microlitres de 80 % de THPC avec un millilitre d’eau ultra pure. Fixez une fiole à fond rond de 100 millilitres sur une plaque d’agitation magnétique. Ajouter dans la fiole 45 millilitres d’eau et un petit pain d’agitation en forme d’œuf.Commencez à remuer l’eau à 300 tr/min. Ajouter dans le flacon 0,5 millilitre d’une solution molaire d’hydroxyde de sodium et un millilitre de solution diluée de THPC. Continuez à remuer vigoureusement le mélange réactionnel pendant cinq minutes.Ensuite, ajoutez deux millilitres d’une solution d’acide chloroaurique de 25 millimolaires au mélange réactionnel tout en remuant. Confirmez que le mélange réactionnel jaune devient brun foncé en quelques secondes, indiquant la formation de nanoparticules d’or coiffées de THPC et chargées négativement. Continuez à remuer le mélange pendant 15 minutes.Pendant que le mélange agite, préparez une solution aqueuse d’amine hétérobifonctionnelle PEG thiol, de carboxyméthyl PEG thiol et de méthoxy PEG thiol monofonctionnel. Une fois que le mélange réactionnel de nanoparticules d’or a agité pendant 15 minutes, réduisez la vitesse d’agitation à 100 tr/min. Ajouter les solutions de PEG goutte à goutte au mélange tout en remuant.Continuez à remuer doucement le mélange pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, fermez une extrémité d’une membrane cellulosique MWCO de 12 à 14 kilodaltons à l’aide d’une pince de dialyse. À l’aide d’une pipette, transférez le mélange réactionnel dans la membrane.Fermez l’autre extrémité de la membrane à l’aide d’une deuxième pince de dialyse. Dialyser le mélange de nanoparticules contre quatre litres d’eau agitée à 60 tr/min pendant 72 heures. Changez l’eau toutes les deux heures pendant les six premières heures, et toutes les six à 12 heures par la suite.Ensuite, filtrez le mélange de nanoparticules d’or pégylé semi-purifié à travers un filtre à seringue de 0,2 micromètre, dans un tube conique de 50 millilitres. Congelez la solution de nanoparticules purifiées à moins 80 degrés Celsius pendant environ cinq heures. lyophiliser les nanoparticules purifiées à l’aide d’un lyophilisateur.Pour commencer à préparer les nanoparticules d’or pégylées fluorescentes, fixez une fiole à fond rond de 100 millilitres sur une plaque d’agitation magnétique. Ajoutez 18 millilitres d’eau ultra pure et une petite barre d’agitation en forme d’œuf dans la fiole et commencez à remuer à 100 tr/min. Dans un tube conique de quatre millilitres, combinez deux milligrammes de nanoparticules d’or pégylées lyophilisées avec deux millilitres d’eau.Ensuite, transférez la solution de nanoparticules dans le ballon à fond rond pour une reconstitution supplémentaire. Ajoutez un millilitre d’un tampon carbonaté de pH 8,8, 0,1 molaire aux nanoparticules reconstituées tout en remuant. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’une solution de 10 milligrammes par millilitre d’un ester d’anhydroxysuccinimide fluorescent dans du sulfoxyde de diméthyle.Enveloppez le ballon dans du papier d’aluminium pour exclure complètement la lumière. Continuez à remuer le mélange de nanoparticules fluorescentes pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, dialysez le mélange contre quatre litres d’eau pendant 72 heures en utilisant la procédure décrite dans la préparation des nanoparticules d’or pégylées.Gardez le récipient recouvert d’une feuille d’aluminium tout au long de la dialyse. Réservez un millilitre de nanoparticules pégylées fluorescentes purifiées pour la caractérisation. Congelez, lyophilisez et stockez les nanoparticules fluorescentes restantes à quatre degrés Celsius.Pour visualiser le noyau de nanoparticules d’or avec la microscopie électronique à transmission, placez d’abord 10 microlitres de la solution de nanoparticules fluorescentes purifiées sur une grille TEM à mailles recouvertes de carbone. Laissez la goutte reposer pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez du papier filtre pour évacuer soigneusement l’excès de liquide du bord de la grille TEM, jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un film de nanoparticules fluorescentes sur la grille.Imagez les nanoparticules à 80 kilovolts, avec un grossissement de 50 000 à 150 000. Pour mesurer la taille des nanoparticules hydrodynamiques, placez un milligramme de nanoparticules d’or enrobées de THPC lyophilisé dans un microtube à centrifuger. Ajoutez un millilitre d’eau dans chaque tube et transférez les solutions dans des cuvettes en plastique transparent d’un millilitre.Évaluez chaque solution avec une diffusion dynamique de la lumière et mesurez les diamètres hydrodynamiques sphériques des particules. Ensuite, transférez la cuvette contenant les nanoparticules d’or pégylées fluorescentes dans un spectrofluorimètre. Réglez la longueur d’onde d’exotation sur 633 nanomètres et lisez les signaux d’émission de 650 à 800 nanomètres.Ensuite, pour évaluer la biocompatibilité à des concentrations de 7 nanoparticules, pipetez d’abord 100 microlitres d’une suspension de cellules endothéliales en DMEM dans chacun des 21 puits d’une plaque traitée pour culture de tissus stériles à fond transparent de 96 biens. Incuber les cellules jusqu’à ce que la confluence soit atteinte, puis obtenir sept solutions de nanoparticules fluorescentes dans du DMEM avec des concentrations allant de zéro à 1000 microgrammes par millilitre. Aspirez le DMEM des puits.Placez 100 microlitres de chacune des sept solutions de nanoparticules dans chacun des puits séparés en trois exemplaires. Laissez les cellules et les nanoparticules co-incuber pendant 16 heures. Ensuite, aspirez le DMEM et les nanoparticules en suspension ou faiblement attachées des puits.Ajoutez 100 microlitres de DMEM frais contenant 20 microlitres d’une solution MTS/PES dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, évaluez la viabilité cellulaire par analyse chlorométrique à 492 nanomètres avec le lecteur de plaques.Ensuite, ensemencez les cellules endothéliales du coussinet adipeux de rat sur un couvercle en verre stérile de 12 millilitres à 10 000 cellules par centimètre carré. Nourrissez les cellules avec du DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine. Incuber les cellules jusqu’à ce que la confluence complète soit atteinte.Modifiez le glycocalyx endothélial si vous le souhaitez, puis incubez les cellules avec 550 microgrammes par millilitre de nanoparticules d’or fluorescentes pendant 16 heures. Préparez les cellules pour la microscopie par immunofluorescence. Montez chaque lamelle de protection sur une lame de microscope avec un support de montage anti-décoloration contenant du DAPI.Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Imagez les cellules endothéliales immuno-colorées par microscopie confocale. Visualisez les noyaux, le glycocalyx de sulfate d’héparine et les nanoparticules avec des canaux bleus, verts et rouges lointains, respectivement.TEM de nanoparticules d’or recouvertes de THPC, a montré des diamètres de particules de deux à trois nanomètres. Le TEM des nanoparticules pegylées n’a pu que confirmer la présence de particules dispersées, car le PEG n’est pas visible sur les images TEM. Le DLS des nanoparticules enrobées et pégylées de THPC a montré un décalage du diamètre maximal des particules de 2,5 nanomètres à 10,5 nanomètres.L’émission fluorescente avait un maximum entre 660 et 672 nanomètres lorsqu’elle était excitée avec une lumière de 633 nanomètres, ce qui était cohérent avec l’émission maximale attendue à 665 nanomètres pour la sonde fluorescente utilisée. Les cellules endothéliales du coussinet adipeux de rat ont montré des niveaux de viabilité similaires après 16 heures de co-incubation avec des nanoparticules d’or pégolées fluorescentes à des concentrations allant jusqu’à un milligramme par millilitre, n’indiquant aucune toxicité significative des nanoparticules. Une absorption minimale de nanoparticules a été observée dans les cellules endothéliales du coussinet adipeux de rat avec des glycocalyx sains.Une absorption significativement plus importante s’est produite dans les cellules avec des glycocalyx dégradés, comme le montre l’augmentation des signaux fluorescents rouges des nanoparticules. À la suite de cette procédure, d’autres modifications, telles que la conjugaison sur les groupes fonctionnels ouverts, peuvent être effectuées pour modifier les particules afin de cibler spécifiquement un composant de l’endothélium ou d’administrer un médicament.

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