Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser des nanosphères d’or fonctionnalisées recouvertes de polymères de 10 nanomètres de diamètre, biocompatibles, ayant un temps de circulation prolongé et pouvant être imagées par microscopie à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en cardiologie sur la perméabilité de l’endothélium dans des conditions pathologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle crée des particules ultra-petites biocompatibles qui ont des groupes fonctionnels disponibles pour une personnalisation plus poussée.

Tout d’abord, dans un micro tube à centrifuger, diluez 12 microlitres de 80 % de THPC avec un millilitre d’eau ultra pure. Fixez une fiole à fond rond de 100 millilitres sur une plaque d’agitation magnétique. Ajouter dans la fiole 45 millilitres d’eau et un petit pain d’agitation en forme d’œuf.

Commencez à remuer l’eau à 300 tr/min. Ajouter dans le flacon 0,5 millilitre d’une solution molaire d’hydroxyde de sodium et un millilitre de solution diluée de THPC. Continuez à remuer vigoureusement le mélange réactionnel pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez deux millilitres d’une solution d’acide chloroaurique de 25 millimolaires au mélange réactionnel tout en remuant. Confirmez que le mélange réactionnel jaune devient brun foncé en quelques secondes, indiquant la formation de nanoparticules d’or coiffées de THPC et chargées négativement. Continuez à remuer le mélange pendant 15 minutes.

Pendant que le mélange agite, préparez une solution aqueuse d’amine hétérobifonctionnelle PEG thiol, de carboxyméthyl PEG thiol et de méthoxy PEG thiol monofonctionnel. Une fois que le mélange réactionnel de nanoparticules d’or a agité pendant 15 minutes, réduisez la vitesse d’agitation à 100 tr/min. Ajouter les solutions de PEG goutte à goutte au mélange tout en remuant.

Continuez à remuer doucement le mélange pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, fermez une extrémité d’une membrane cellulosique MWCO de 12 à 14 kilodaltons à l’aide d’une pince de dialyse. À l’aide d’une pipette, transférez le mélange réactionnel dans la membrane.

Fermez l’autre extrémité de la membrane à l’aide d’une deuxième pince de dialyse. Dialyser le mélange de nanoparticules contre quatre litres d’eau agitée à 60 tr/min pendant 72 heures. Changez l’eau toutes les deux heures pendant les six premières heures, et toutes les six à 12 heures par la suite.

Ensuite, filtrez le mélange de nanoparticules d’or pégylé semi-purifié à travers un filtre à seringue de 0,2 micromètre, dans un tube conique de 50 millilitres. Congelez la solution de nanoparticules purifiées à moins 80 degrés Celsius pendant environ cinq heures. lyophiliser les nanoparticules purifiées à l’aide d’un lyophilisateur.

Pour commencer à préparer les nanoparticules d’or pégylées fluorescentes, fixez une fiole à fond rond de 100 millilitres sur une plaque d’agitation magnétique. Ajoutez 18 millilitres d’eau ultra pure et une petite barre d’agitation en forme d’œuf dans la fiole et commencez à remuer à 100 tr/min. Dans un tube conique de quatre millilitres, combinez deux milligrammes de nanoparticules d’or pégylées lyophilisées avec deux millilitres d’eau.

Ensuite, transférez la solution de nanoparticules dans le ballon à fond rond pour une reconstitution supplémentaire. Ajoutez un millilitre d’un tampon carbonaté de pH 8,8, 0,1 molaire aux nanoparticules reconstituées tout en remuant. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’une solution de 10 milligrammes par millilitre d’un ester d’anhydroxysuccinimide fluorescent dans du sulfoxyde de diméthyle.

Enveloppez le ballon dans du papier d’aluminium pour exclure complètement la lumière. Continuez à remuer le mélange de nanoparticules fluorescentes pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, dialysez le mélange contre quatre litres d’eau pendant 72 heures en utilisant la procédure décrite dans la préparation des nanoparticules d’or pégylées.

Gardez le récipient recouvert d’une feuille d’aluminium tout au long de la dialyse. Réservez un millilitre de nanoparticules pégylées fluorescentes purifiées pour la caractérisation. Congelez, lyophilisez et stockez les nanoparticules fluorescentes restantes à quatre degrés Celsius.

Pour visualiser le noyau de nanoparticules d’or avec la microscopie électronique à transmission, placez d’abord 10 microlitres de la solution de nanoparticules fluorescentes purifiées sur une grille TEM à mailles recouvertes de carbone. Laissez la goutte reposer pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez du papier filtre pour évacuer soigneusement l’excès de liquide du bord de la grille TEM, jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un film de nanoparticules fluorescentes sur la grille.

Imagez les nanoparticules à 80 kilovolts, avec un grossissement de 50 000 à 150 000. Pour mesurer la taille des nanoparticules hydrodynamiques, placez un milligramme de nanoparticules d’or enrobées de THPC lyophilisé dans un microtube à centrifuger. Ajoutez un millilitre d’eau dans chaque tube et transférez les solutions dans des cuvettes en plastique transparent d’un millilitre.

Évaluez chaque solution avec une diffusion dynamique de la lumière et mesurez les diamètres hydrodynamiques sphériques des particules. Ensuite, transférez la cuvette contenant les nanoparticules d’or pégylées fluorescentes dans un spectrofluorimètre. Réglez la longueur d’onde d’exotation sur 633 nanomètres et lisez les signaux d’émission de 650 à 800 nanomètres.

Ensuite, pour évaluer la biocompatibilité à des concentrations de 7 nanoparticules, pipetez d’abord 100 microlitres d’une suspension de cellules endothéliales en DMEM dans chacun des 21 puits d’une plaque traitée pour culture de tissus stériles à fond transparent de 96 biens. Incuber les cellules jusqu’à ce que la confluence soit atteinte, puis obtenir sept solutions de nanoparticules fluorescentes dans du DMEM avec des concentrations allant de zéro à 1000 microgrammes par millilitre. Aspirez le DMEM des puits.

Placez 100 microlitres de chacune des sept solutions de nanoparticules dans chacun des puits séparés en trois exemplaires. Laissez les cellules et les nanoparticules co-incuber pendant 16 heures. Ensuite, aspirez le DMEM et les nanoparticules en suspension ou faiblement attachées des puits.

Ajoutez 100 microlitres de DMEM frais contenant 20 microlitres d’une solution MTS/PES dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, évaluez la viabilité cellulaire par analyse chlorométrique à 492 nanomètres avec le lecteur de plaques.

Ensuite, ensemencez les cellules endothéliales du coussinet adipeux de rat sur un couvercle en verre stérile de 12 millilitres à 10 000 cellules par centimètre carré. Nourrissez les cellules avec du DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine. Incuber les cellules jusqu’à ce que la confluence complète soit atteinte.

Modifiez le glycocalyx endothélial si vous le souhaitez, puis incubez les cellules avec 550 microgrammes par millilitre de nanoparticules d’or fluorescentes pendant 16 heures. Préparez les cellules pour la microscopie par immunofluorescence. Montez chaque lamelle de protection sur une lame de microscope avec un support de montage anti-décoloration contenant du DAPI.

Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Imagez les cellules endothéliales immuno-colorées par microscopie confocale. Visualisez les noyaux, le glycocalyx de sulfate d’héparine et les nanoparticules avec des canaux bleus, verts et rouges lointains, respectivement.

TEM de nanoparticules d’or recouvertes de THPC, a montré des diamètres de particules de deux à trois nanomètres. Le TEM des nanoparticules pegylées n’a pu que confirmer la présence de particules dispersées, car le PEG n’est pas visible sur les images TEM. Le DLS des nanoparticules enrobées et pégylées de THPC a montré un décalage du diamètre maximal des particules de 2,5 nanomètres à 10,5 nanomètres.

L’émission fluorescente avait un maximum entre 660 et 672 nanomètres lorsqu’elle était excitée avec une lumière de 633 nanomètres, ce qui était cohérent avec l’émission maximale attendue à 665 nanomètres pour la sonde fluorescente utilisée. Les cellules endothéliales du coussinet adipeux de rat ont montré des niveaux de viabilité similaires après 16 heures de co-incubation avec des nanoparticules d’or pégolées fluorescentes à des concentrations allant jusqu’à un milligramme par millilitre, n’indiquant aucune toxicité significative des nanoparticules. Une absorption minimale de nanoparticules a été observée dans les cellules endothéliales du coussinet adipeux de rat avec des glycocalyx sains.

Une absorption significativement plus importante s’est produite dans les cellules avec des glycocalyx dégradés, comme le montre l’augmentation des signaux fluorescents rouges des nanoparticules. À la suite de cette procédure, d’autres modifications, telles que la conjugaison sur les groupes fonctionnels ouverts, peuvent être effectuées pour modifier les particules afin de cibler spécifiquement un composant de l’endothélium ou d’administrer un médicament.