Name: Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Apprenez un essai de dot blot quantitatif pour le titrage d'AAV et l'évaluation des protéines AAP dans l'assemblage des capsides virales. Cette méthode simple et économique utilise des cellules HEK 293.

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Xiao Xiao à l’University of North Carolina at Chapel Hill nous remercions de nous avoir fourni le plasmide pEMBL-CMV-GFP. Nous remercions Christopher Cheng et Samuel J. Huang pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par Service de santé publique accorde (NIH R01 NS088399 et EY232113 T32).

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<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
<li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li>
<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+Virus+%28AAV%29+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4%2C+5%2C+and+11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
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<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li>
<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Fagone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+errors+in+quantitative+polymerase+chain+reaction+titration+of+self-complementary+adeno-associated+viral+vectors+and+improved+alternative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).</li>
<li>Farkas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parvovirus+isolated+from+royal+python+%28Python+regius%29+is+a+member+of+the+genus+Dependovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).</li>
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<li>Chen, W. J., Liao, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bovine+pancreatic+deoxyribonuclease+I%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I.</a> Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce rapport, l’utilité des quantitatifs dot blot dosages pour étudier AAPs AAV et leur rôle dans l’assemblage de la capside est décrite. Connaissances acquises grâce à ces études peuvent fournir un aperçu détaillé les différences innées dans le processus de montage de capside AAV et le rôle fonctionnel de l’AAPs entre sérotypes différents. À cet égard, le point de croix-complémentation AAV VP3-PAA blot assay a révélé que Snake AAV VP3 affiche une dépendance stricte sur la co-expression de ses apparenté PAA pour l’ass...

Adeno-associated virus (AAV) est un virus à ADN petit, non enveloppés, simple brin avec un génome d’environ 4,7 kilobases (kb). Le génome de l’AAV contient des cadres de lecture ouvert (ORF) pour les gènes rep et cap . En 2010, une protéine non structuraux inconnue codée par un ORF décalés dans le cadre de + 1 gène de cap de l’AAV2 a été découvert par Sonntag et coll. et jugée jouent un rôle essentiel dans l’assemblage de AAV2 protéines de la capside VP monomère dans le viral 1de capside. Cette nouvelle protéine a été baptisée Assemblée-activating protein (PAA) le rôle qu’elle joue dans la promotion de capside Assemblée1.
L’ORFs PAA été bioinformatically identifié dans les génomes de tous les parvovirus dans le genre Dependoparvovirus, mais pas dans les génomes des virus de différents genres de la parvovirose famille1,2. Des études fonctionnelles de cette nouvelle protéine étaient initialement axées sur le PAA du prototype AAV2 (AAP2), qui a établi le rôle essentiel du AAP2 pour cibler les protéines VP démontées le nucléole pour leur accumulation et leur formation en entièrement assemblé des capsides1,3,4. L’incapacité des capsides AAV2 à assembler en l’absence d’expression de l’AAP a été indépendamment confirmé par plusieurs groupes, y compris la nôtre,1,2,3,4,5 . Des études ultérieures sur les sérotypes d’AAV 1, 8 et 9 corroborent le rôle crucial de l’AAPs dans Assemblée de capside, sous forme de protéines VP3 monomère de AAV1, 8, et 9 ont été incapables de former une capside entièrement Assemblée en l’absence de la co-expression de PAA2.
Récemment, grâce à des méthodes qui incluent l’utilisation quantitative dot blot essais, nous avons étudié la capacité des AAV1 à 12 VP3 monomères d’assembler dans des capsides en l’absence d’expression de la PAA et la capacité de AAP1 à 12 pour promouvoir l’Assemblée de VP3 monomères de sérotypes hétérologues. Cette étude a révélé que AAV4, 5 et 11 VP3 monomères peuvent se réunir sans PAA. En outre, il a été constaté que huit des douze sérotypes PAA nous avons examiné (c'est-à-diretous sauf AAP4, 5, 11 et 12) affiche une large capacité pour soutenir l’assemblage de la capside des capsides de sérotype AAV hétérologues, tout en AAP4, 5, 11 et 12 affiché un substantiellement capacité limitée à cet égard6. Ces quatre sérotypes sont phylogénétiquement éloignées des autres PAA sérotypes2,3. En outre, l’étude a révélé une hétérogénéité significative dans des localisations subcellulaires des différents AAPs6. En outre, l’étude a suggéré que l’association serrée PAA avec capsides assemblés et le nucléole, la marque distinctive d’AAV2 Assemblée de capside, ne peut nécessairement être étendue à d’autres sérotypes, y compris AAV5, 8 et 9, qui affichent des nucléole exclusion de capsides assemblé6. Ainsi, l’information obtenue grâce à l’étude d’un sérotype particulier PAA n’est pas applicable à tous les biologie du PAA. Telle nature curieux de biologie PAA souligne la nécessité d’enquêter sur le rôle et la fonction de chaque AAP de sérotypes d’AAV canoniques et non canoniques.
Le rôle biologique du PAA en assemblage de la capside peut être évalué en déterminant que les titres de particule virale AAV emballé entièrement produit en rein embryonnaire humain (HEK) 293 cellules, la lignée de cellules plus couramment utilisés pour la production de vecteur d’AAV, avec ou sans protéine PAA expression. Les méthodes standards pour le dosage de l’AAV sont PCR quantitative (qPCR)-dosages selon7,8 et quantitative dot blot-basé assays9. Autres méthodes de quantification des particules virales AAV comme enzyme-linked immunosorbent assay10,11 ou de mesure de densité optique12 ne sont pas idéales pour les échantillons provenant de nombreux différents sérotypes d’AAV ou échantillons contaminés par des impuretés (lysats bruts ou milieux de culture), qui sont souvent les échantillons utilisés pour la recherche de l’AAV. Actuellement, qPCR est plus largement utilisé pour le dosage de l’AAV ; Toutefois, il est nécessaire de reconnaître d’éventuels avertissements du dosage qPCR-basé, comme le dosage peuvent entraîner des erreurs systémiques et titre importantes variations13,14. Les analyses basées sur la PCR sont affectés par un certain nombre de facteurs, comme la présence de covalence fermés barettes terminales dans les modèles de PCR qui inhibent l’amplification13potentiellement confondants. Même une personne expérimentée peut introduire le potentiel des facteurs confondants dans une base de qPCR dosage inconsciemment13. En revanche, quantitative dot blot dosages sont une technique classique de biologie moléculaire qui ne comporte pas d’amplification du génome et utilise de manière beaucoup plus simple avec un risque minimal d’erreurs par rapport aux analyses qPCR. La méthode est moins techniquement difficile ; par conséquent, les résultats de titrage sont raisonnablement reproductibles même par des personnes inexpérimentées.
Dans ce rapport, nous décrivons les détails méthodologiques d’un test de la tache point quantitatif régulièrement, nous utilisons pour le dosage de vecteur AAV et fournissent un exemple de Comment veut appliquer l’analyse pour étudier le rôle de l’Assemblée-promotion du PAE en commun sérotypes (AAV5 et AAV9) et une auparavant non caractérisé PAA du serpent AAV14. Dans la nature, AAV VP protéines et protéines de l’AAP sont exprimés en cis d’un seul gène (c'est-à-dire, VP-PAA cis-complémentation), tandis que dans l’essai décrit ici, protéines VP et AAP sont fournis en trans de deux plasmides distincts (c.-à-d., VP-PAA TRANS-complémentation). Étant donné que chaque protéine VP ou PAA de sérotypes différents peut être exprimée de chaque plasmide indépendant, il devient possible de tester les combinaisons de VP-PAA hétérologues pour l’assemblage de la capside (c.-à-d., VP-PAA Croix-complémentation). Brièvement, AAV VP3 de différents sérotypes est exprimée dans les cellules HEK 293 par transfection d’ADN plasmidique pour empaqueter un génome de vecteur d’AAV en présence ou en absence du sérotype apparenté du PAA, ou en présence d’un sérotype hétérologue du PAA. Production, milieux de culture et de lysats cellulaires sont soumis à un essai de tache de dot pour quantifier le génome viral dans la coquille de la capside. La première étape du test dot blot est de traiter des échantillons avec une nucléase pour supprimer contaminantes plasmide DNAs et non emballés AAV génomes dans les échantillons. Faute de quoi augmenterait les signaux de fond en particulier lorsque des échantillons non-purifiés sont dosés. Ceci est alors suivi d’un traitement de protéase à briser les capsides virales et libérer des génomes viraux nucléase-résistante dans exemples de solutions. Prochaines, virales de génomes sont dénaturés, effacés sur une membrane et hybridés avec une sonde d’ADN spécifiques d’un génome virale à la quantification. Dans l’analyse de l’exemple rapporté ici, nous démontrons que Snake AAV VP3 exige PAA de serpent pour l’assemblage de la capside et que Snake PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9 contrairement à beaucoup de l’AAPs dérivée de sérotypes PAA-dépendante qui peuvent aussi favoriser l’Assemblée de capsides sérotype hétérologue. Enfin, nous présentons une mise en garde importante à qPCR ou quantification de VAA axée sur la tache point essais que le choix de la nucléase affecte significativement les résultats de titrage.

<table><tbody><tr><td>Benzonase</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td><td>Désigné sous le nom de Serratia marcescen endonucléase dans le texte principal.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>appelée DNase I Enzyme A dans le texte principal.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>appelée DNase I Enzyme B dans le texte principal.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>Appelée DNase I Enzyme C dans le texte principal.</td></tr><tr><td>1,5 mL Joint torique Bouchon à vis Tubes à microcentrifuger</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger 1,5 mL Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube conique en polypropylène</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 m Acétate de sodium</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique en polypropylène</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Cellules AAV-293 Agilent</td><td></td><td>240073</td><td>lignée cellulaire HEK-293 optimisée pour l’emballage des virions AAV.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0,5 M Solution EDTA</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10 % SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Buffer</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ADN</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>Ceci est utilisé pour les taches quantitatives sur le virus purifié. Nous n’utilisons qu’un demi-volume de tous les réactifs à chaque étape recommandés pour le schéma de protocole 2 dans le manuel fourni par le fabricant.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)-glycémie élevée (4,5 g/L)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>Appelé Polysaccharose 400.</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Hareng Sperme ADN</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’hybridation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini colonnes d’ADN à spin rapide</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vector</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Cassette d’exposition à l’imagerie phosphorescente</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Écran d’imagerie phosphorescente</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx ADN polymérase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polyéthylénie</td><td>Polysciences</td><td>Inc 23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Kit d’étiquetage d’amorce aléatoire</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>Amorce AAP Forward (N25 nucléotides du 4ème nucléotide de l’ORF AAP, RE1 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer Primer</td><td></td></tr><tr><td>AAP Reverse (N25 est les 25 derniers nucléotides de l’ORF AAP, RE2 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Amorce VP3 Forward (N25 les 25 premiers nucléotides de l’ORF VP3, RE1 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Reverse (N25 est les 25 derniers nucléotides de l’ORF AAP, RE2 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma,</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Restriction</td><td>Enzymes New England Biolabs</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Saumon Sperme ADN</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium tribasique dihydraté</td><td>MilliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr>Plaque traitée à<td>6 puits</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>Réticulant UV</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Le mode de réticulation optimal est utilisé, fournissant une dose d’énergie UV de 120 mJ/cm2.</td></tr><tr><td>Membrane Zeta-Probe</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

un essai de tache de dot quantitative pour aav titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’adeno-associated virus activation assemblée protéines

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Bien qu’adeno-associated virus (AAV) est largement reconnue comme un vecteur attractif pour la thérapie génique, il sert aussi comme virus modèle pour comprendre la biologie du virus. Dans le respect de ce dernier, la récente découverte d’une protéine AAV non structurelles, appelée protéines activatrices Assemblée (PAA), a jeté une lumière nouvelle sur les processus impliqués dans l’assemblage des protéines de capside virale VP dans une capside. Bien que de nombreux sérotypes d’AAV exigent PAA pour l’assemblage, nous avons récemment rapporté que AAV4, 5, et 11 y a des exceptions à cette règle. En outre, nous avons démontré que AAPs et assemblés capsides des sérotypes différents localiser aux différents compartiments subcellulaires. Cette hétérogénéité inattendue dans les propriétés biologiques et de rôles fonctionnels de l’AAPs parmi différent AAV sérotypes souligne que l’importance des études sur AAPs provenant de divers sérotypes. Ce manuscrit détaille un simple dot blot de dosage pour dosage AAV et son application afin d’évaluer la spécificité de la dépendance et sérotype PAA dans l’assemblage de la capside. Pour démontrer l’utilité de ce test de la tache de dot, nous partîmes pour caractériser l’assemblage de la capside et dépendance PAA de serpent AAV, un reptile non définie auparavant AAV, ainsi que AAV5 et AAV9, qui ont déjà démontré qu’être PAA-indépendants et dépendants du PAA sérotypes, respectivement. L’analyse a révélé que Snake AAV capside Assemblée exige PAA de serpent et qu’il ne peut être promue par AAPs de AAV5 et AAV9. L’analyse a également montré que, contrairement à beaucoup du sérotype souvent AAPs qui favorisent l’assemblage de la capside hétérologue par Croix-complémentation, serpent PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9. En outre, nous montrons que le choix de la nucléase affecte de manière significative la lecture de l’essai de tache de dot, et ainsi, choisir une enzyme optimale est essentielle pour une évaluation réussie de titres d’AAV.

Un résultat représentatif des taches point quantitatif pour le dosage des stocks de vecteur AAV purifiées produites à grande échelle est illustré à la Figure 1. Avec cet essai de tache de dot, le titre d’un stock de vecteur bicaténaire AAV2G9-CMV-GFP a été déterminé. Le vecteur a été purifié par deux séries de chlorure de césium (CsCl), gradient de densité ultracentrifugation suivie de dialyse comme décrit précédemment20. En général, p...

Ce manuscrit détaille un essai par transfert de point simple pour le dosage des titres adeno-associated virus (AAV) et son application pour étudier le rôle de l’Assemblée-activation protéines (AAPs), une nouvelle classe de protéines virales non structurales dans tous les AAV sérotypes, dans la promotion de l’Assemblée des capsides dérivé de sérotypes d’AAV apparentés et hétérologues.

Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Cette méthode permet de déterminer à la fois les titres de vacance AV purifiés et non purifiés et d’évaluer la capacité de l’AAP AAV à favoriser l’assemblage de sérotype-capse AV apparenté et hétérologue. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple et peu coûteuse qui évite les inconvénients des autres méthodes de titrage AAV. Bien que cette méthode ait été couramment utilisée pour la quantification des vecteurs AAV, elle peut également être appliquée pour répondre à diverses questions fondamentales sur la biologie des AAV, comme le montre ce protocole.Le jour zéro, après avoir cultivé 293 cellules HEK à 90 % de confluence, préparez le réactif de transfection en mélangeant les plasmides dans 96 microlitres de PBS sans calcium ni magnésium dans des tubes à centrifuger stériles de 1,5 millilitre. Comme l’indique ce tableau, la quantité totale d’ADN est de deux microgrammes par puits. Ajouter quatre microlitres de solution PEI au mélange d’ADN plasmidique PBS.Le volume final est d’environ 100 microlitres ou 5 % du volume du milieu de culture. Agitez brièvement les tubes et incubez le mélange d’ADN PEI à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, faites tourner brièvement les tubes dans une microcentrifugeuse pour recueillir le liquide jusqu’au fond.Et ajoutez le mélange d’ADN PEI goutte à goutte dans le milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture HEK 293. Ensuite, agitez doucement les plaques et remettez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. La transfection de la cellule HEK 293 est un composant essentiel de ce protocole pour la production de virus à titre élevé.Des cellules saines à faible nombre de passages doivent être utilisées et des précautions doivent être prises pour ne pas perturber la monocouche des cellules. Les premier et deuxième jours, sous un microscope à fluorescence inversée, observez les cellules transfectées avec le plasmide PCMVGFP pour évaluer l’efficacité de la transfection. Le cinquième jour, pipetez les cellules et le milieu contenant le virus de haut en bas ou utilisez un grattoir cellulaire pour gratter toutes les cellules.Ensuite, transférez la suspension dans des tubes coniques en polypropylène de 15 millilitres. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour récupérer les particules virales, décongelez rapidement les tubes congelés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Ensuite, faites tourbillonner vigoureusement les tubes pendant une minute pour maximiser la récupération de l’AAV des cellules. Granulez les débris cellulaires par centrifugation à 3 700 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez ensuite 200 microlitres de surnageant de chaque tube dans des tubes de micro-centrifugeuse étiquetés avec des bouchons à vis pour le test par transfert de points.Pour traiter les échantillons avec l’endonucléase de Serratia marcescens, préparez les réactifs du mélange A et du mélange B. Ajoutez 10 microlitres de chaque réactif dans chaque tube d’échantillon. Faites vortex les échantillons pendant cinq secondes et faites-les tourner brièvement pour recueillir le liquide au fond des tubes.Ensuite, incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après avoir brièvement essoré les échantillons, effectuez le traitement à la protéinase K en préparant le réactif de mélange C et en ajoutant 180 microlitres dans chaque tube. Ensuite, après avoir vortex et brièvement fait tourner à nouveau les tubes, incubez-les à 55 degrés Celsius pendant une heure.Une fois que les échantillons sont revenus à température ambiante, ajoutez 200 microlitres de phénol-chloroforme et faites tourbillonner les tubes pendant une minute. Ensuite, faites tourner les échantillons dans une micro-centrifugeuse à 16, 100 fois G et à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Transférez 320 microlitres de la couche aqueuse ou 80 % du volume de fluide aqueux dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse standard.Cette étape de transfert est d’une importance cruciale, car le même volume doit être prélevé sur l’échantillon pour maintenir la précision de la quantification de l’AAV. Il faut veiller à éviter la phase organique lors de l’élimination de la couche aqueuse. Préparez le réactif du mélange D et ajoutez 833 microlitres dans chaque tube d’échantillon.Après avoir vortex les tubes, incubez-les à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Après la centrifugation, videz le surnageant et épongez les tubes une fois sur une serviette en papier propre. Pipetez environ 500 microlitres d’éthanol à 70 % dans chaque tube et faites tourbillonner les tubes pendant cinq secondes.Après avoir fait tourner à nouveau les échantillons, versez le surnageant et épongez les tubes une fois sur une serviette en papier propre. Ensuite, séchez les granulés à 65 degrés Celsius avant de les remettre en suspension dans un tampon TE. Pour effectuer le test de transfert de point, préparez des étalons d’ADN plasmidique en diluant l’ADN plasmidique du génome vectorisé AAV à 10 nanogrammes par microlitre dans de l’eau ou un tampon Tris-HCL.Transférez une aliquote de 25 microlitres de l’ADN plasmidique dilué dans un tube frais et linéarisez-le avec une enzyme de restriction appropriée dans un volume de réaction de 50 microlitres pendant une heure. Ajoutez 450 microlitres d’eau ou de TE dans le tube contenant l’étalon d’ADN plasmidique digéré et mélangez soigneusement. Transférez ensuite 70 microlitres de ce mélange dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre avec 1 330 microlitres d’eau ou de TE pour faire un étalon plasmidique dilué.Pour mettre en place l’appareil de transfert de points, à l’aide de ciseaux, coupez la membrane de transfert à une taille appropriée pour le nombre d’échantillons et d’étalons. Trempez la membrane dans de l’eau pendant 10 minutes avant de la placer sur l’appareil de transfert de points. Ensuite, couvrez les puits inutilisés.Ajouter de l’eau aux puits dans lesquels les échantillons seront chargés. Appliquez un aspirateur, tirez l’eau à travers les puits, vérifiez s’il y a des erreurs, puis resserrez les vis. Refaites le test si nécessaire.Appliquez 400 microlitres de chaque étalon d’ADN plasmidique dilué dans chaque puits et effectuez quatre voies de dilutions standard. Utilisez deux aliquotes distinctes de la synthèse standard et chargez-les chacune en double. Appliquez ensuite 200 microlitres par puits de chaque échantillon d’ADN viral.Appliquez un léger vide pour tirer les solutions d’ADN à travers les puits. Ensuite, une fois tous les puits vidés, libérez le vide en ajustant la vanne à trois voies. Ajouter 400 microlitres d’une solution alcaline X dans chaque puits.Attendez ensuite cinq minutes avant de réappliquer l’aspirateur pour vider les puits. Réappliquez l’aspirateur et démontez l’appareil de transfert de points. Retirez ensuite la membrane et rincez-la avec deux X SSC.Placez la membrane sur une serviette en papier propre avec le côté lié à l’ADN vers le haut pour éliminer l’excès de tampon. Utilisez un réticulant UV approprié pour réticuler l’ADN tamponné à la membrane. La membrane est maintenant prête pour l’hybridation.Placez la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté lié à l’ADN vers le haut. Rincez la membrane avec cinq à 10 millilitres de tampon d’hybridation préchauffé et jetez le tampon. Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon d’hybridation préchauffé et placez la bouteille dans un four d’hybridation rotatif réglé à 65 degrés Celsius.Faites pivoter la bouteille pendant au moins cinq minutes. Ajoutez rapidement l’ADN du spermatozoïde dénaturé et la sonde radioactive au tampon d’hybridation dans la bouteille et secouez-le pendant 10 secondes pour mélanger. Remettez la bouteille dans le four à 65 degrés Celsius et incubez-la en rotation à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures.Une fois l’hybridation terminée, arrêtez la rotation. Retirez le flacon d’hybridation, puis versez la solution de sonde radioactive dans un tube conique de 50 millilitres avec un bouchon étanche. Pour laver la membrane, ajoutez 20 à 30 microlitres de tampon de lavage préchauffé dans la bouteille d’hybridation et tournez-la pendant cinq minutes.Répétez ce lavage deux fois de plus. Après le troisième lavage, retirez la membrane de la bouteille d’hybridation et, à l’aide d’essuie-tout, retirez l’excédent de tampon de la membrane. Placez ensuite la membrane dans un porte-papier en plastique transparent.À l’aide d’un compteur Geiger, vérifiez les signaux radioactifs sur la membrane. Après avoir exposé l’écran d’imagerie au phosphore effacé à la membrane, balayez l’écran à l’aide d’un système de balayage d’image au phosphore et obtenez les données sur l’intensité du signal de chaque point. Effectuer l’analyse des données selon le protocole texte.Ce transfert de points quantitatif pour le titrage vectoriel AAV 2G9 comporte deux ensembles d’étalons et trois quantités différentes d’une préparation de vecteur AAV, y compris 0,3, 0,1 et 0,03 microlitres en double. Les quantités à doser sur le transfert sont déterminées empiriquement ou sur la base d’un dosage préliminaire. Il a été déterminé par interpolation que les aliquotes de 0,3, 0,1 et 0,03 microlitre du vecteur AAV 2G9 avaient en moyenne un titre de 5,16, 0,27 nanogramme d’équivalent microlitres.Toutes les combinaisons possibles de sérotypes apparentés et hétérologues des protéines VP3 cas-pid et AAP des AAV5, AAV9 et AAV de serpent ont été évaluées pour l’assemblage de la capside par un test quantitatif par transfert de points. Les résultats de ce graphique montrent que l’AAV5 VP3 s’assemble indépendamment du fait que l’AAP ait été fourni en trans. De plus, AAP5 et AAP9 peuvent favoriser l’assemblage de la capside AAV9 VP3, bien que AAP5 fonctionne moins efficacement que AAP9.Ni AAP5 ni AAP9 ne présentent d’activité favorisant l’assemblage sur le serpent AAV VP3, et le serpent AAP ne favorise que l’assemblage du serpent AAV VP3. Une analyse par transfert de points a été appliquée pour évaluer l’activité des nucléases de trois nucléases disponibles dans le commerce dans des conditions non optimisées contenant des impuretés dérivées de cellules et de milieux de culture. L’enzyme A s’est avérée moins active que les deux autres enzymes, ce qui montre que le choix de la nucléase pourrait affecter de manière significative la lecture du test de transfert de points.Cette technique est simple pour la quantification des vecteurs AAV et essentielle pour évaluer le rôle de l’AAP dans la promotion de l’assemblage de capsides AAV dérivées de sérotypes apparentés et hétérologues. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée si elle fonctionne correctement une fois que les échantillons de test sont obtenus dans des expériences de culture cellulaire. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de pipeter soigneusement le volume de liquide correct pour garantir une précision quantitative.Après son développement, l’application du test quantitatif dot blot à l’étude de l’AAP a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’AAV pour mieux comprendre le mécanisme d’assemblage de la capside de l’AAV. N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines, des agents viraux, du phénol-chloroforme et des matières radioactives peut être extrêmement dangereux. Et l’utilisation de blouses de laboratoire, de gants et de lunettes de protection est nécessaire pour limiter l’exposition.Ces matériaux ne doivent être manipulés que dans des zones approuvées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons de transfert de points pour la quantification de l’AAV, de configurer l’appareil de transfert de points, de déterminer le titre de l’AAV et d’appliquer la procédure à l’étude de la biologie de l’AAV. À la suite de cette procédure, d’autres tests tels que les tests de transduction de vecteurs AAV dans des cellules de culture peuvent être effectués pour répondre à des questions supplémentaires, telles que le titre fonctionnel de vectorisé par rapport au titre de particules physique déterminé par le test de transfert de points.

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Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test colorimétrique in vitro pour détecter la présence d’anticorps neutralisants contre les vecteurs du virus adéno-associé recombinant de sérotype 6 exprimant la phosphatase alcaline (rAAV6) dans des échantillons de sérum de mouton. Le test utilise la réaction entre l’AAV codant pour un gène de phosphatase alcaline placentaire humaine et son substrat pour générer un produit violet insoluble.

Dosage cellulaire des anticorps neutralisants AAV : une technique colorimétrique pour détecter les anticorps neutralisants contre des virus adéno-associés spécifiques dans le sérum

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Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Ce protocole montre comment quantifier l’efficacité de la transduction de l’AAV dans la rétine de souris en utilisant la PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) ainsi que la production d’AAV à petite échelle, l’injection intravitréenne, l’imagerie rétinienne et l’isolement de l’ADN génomique rétinien.

Méthode de PCR par gouttelettes numériques pour la quantification de l’efficacité de la transduction de l’AAV dans la rétine murine

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Essai validable de réaction en chaîne de polymérase numérique par gouttelettes pour la détection de vecteurs viraux adéno-associés dans des études de bioexcrétion de larmes

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Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

Alors que le domaine de la thérapie génique continue d’évoluer, il existe un besoin croissant de méthodes innovantes capables de relever ces défis. Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine de cellules, répondant aux normes de qualité des études in vivo .

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La quantification précise des copies du génome du vecteur du virus adéno-associé (AAV) est essentielle, mais un protocole standardisé n’a pas encore été établi. Ce protocole décrit une méthode validée pour la préparation d’échantillons d’AAV purifiés et la réalisation d’une réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) numérique en gouttelettes afin de quantifier de manière fiable le titre du génome viral.

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Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines (Vidéo) | JoVE Journal

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