Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

Cette méthode permet de déterminer à la fois les titres de vacance AV purifiés et non purifiés et d’évaluer la capacité de l’AAP AAV à favoriser l’assemblage de sérotype-capse AV apparenté et hétérologue. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple et peu coûteuse qui évite les inconvénients des autres méthodes de titrage AAV. Bien que cette méthode ait été couramment utilisée pour la quantification des vecteurs AAV, elle peut également être appliquée pour répondre à diverses questions fondamentales sur la biologie des AAV, comme le montre ce protocole.

Le jour zéro, après avoir cultivé 293 cellules HEK à 90 % de confluence, préparez le réactif de transfection en mélangeant les plasmides dans 96 microlitres de PBS sans calcium ni magnésium dans des tubes à centrifuger stériles de 1,5 millilitre. Comme l’indique ce tableau, la quantité totale d’ADN est de deux microgrammes par puits. Ajouter quatre microlitres de solution PEI au mélange d’ADN plasmidique PBS.

Le volume final est d’environ 100 microlitres ou 5 % du volume du milieu de culture. Agitez brièvement les tubes et incubez le mélange d’ADN PEI à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, faites tourner brièvement les tubes dans une microcentrifugeuse pour recueillir le liquide jusqu’au fond.

Et ajoutez le mélange d’ADN PEI goutte à goutte dans le milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture HEK 293. Ensuite, agitez doucement les plaques et remettez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. La transfection de la cellule HEK 293 est un composant essentiel de ce protocole pour la production de virus à titre élevé.

Des cellules saines à faible nombre de passages doivent être utilisées et des précautions doivent être prises pour ne pas perturber la monocouche des cellules. Les premier et deuxième jours, sous un microscope à fluorescence inversée, observez les cellules transfectées avec le plasmide PCMVGFP pour évaluer l’efficacité de la transfection. Le cinquième jour, pipetez les cellules et le milieu contenant le virus de haut en bas ou utilisez un grattoir cellulaire pour gratter toutes les cellules.

Ensuite, transférez la suspension dans des tubes coniques en polypropylène de 15 millilitres. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour récupérer les particules virales, décongelez rapidement les tubes congelés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Ensuite, faites tourbillonner vigoureusement les tubes pendant une minute pour maximiser la récupération de l’AAV des cellules. Granulez les débris cellulaires par centrifugation à 3 700 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez ensuite 200 microlitres de surnageant de chaque tube dans des tubes de micro-centrifugeuse étiquetés avec des bouchons à vis pour le test par transfert de points.

Pour traiter les échantillons avec l’endonucléase de Serratia marcescens, préparez les réactifs du mélange A et du mélange B. Ajoutez 10 microlitres de chaque réactif dans chaque tube d’échantillon. Faites vortex les échantillons pendant cinq secondes et faites-les tourner brièvement pour recueillir le liquide au fond des tubes.

Ensuite, incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après avoir brièvement essoré les échantillons, effectuez le traitement à la protéinase K en préparant le réactif de mélange C et en ajoutant 180 microlitres dans chaque tube. Ensuite, après avoir vortex et brièvement fait tourner à nouveau les tubes, incubez-les à 55 degrés Celsius pendant une heure.

Une fois que les échantillons sont revenus à température ambiante, ajoutez 200 microlitres de phénol-chloroforme et faites tourbillonner les tubes pendant une minute. Ensuite, faites tourner les échantillons dans une micro-centrifugeuse à 16, 100 fois G et à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Transférez 320 microlitres de la couche aqueuse ou 80 % du volume de fluide aqueux dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse standard.

Cette étape de transfert est d’une importance cruciale, car le même volume doit être prélevé sur l’échantillon pour maintenir la précision de la quantification de l’AAV. Il faut veiller à éviter la phase organique lors de l’élimination de la couche aqueuse. Préparez le réactif du mélange D et ajoutez 833 microlitres dans chaque tube d’échantillon.

Après avoir vortex les tubes, incubez-les à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Après la centrifugation, videz le surnageant et épongez les tubes une fois sur une serviette en papier propre. Pipetez environ 500 microlitres d’éthanol à 70 % dans chaque tube et faites tourbillonner les tubes pendant cinq secondes.

Après avoir fait tourner à nouveau les échantillons, versez le surnageant et épongez les tubes une fois sur une serviette en papier propre. Ensuite, séchez les granulés à 65 degrés Celsius avant de les remettre en suspension dans un tampon TE. Pour effectuer le test de transfert de point, préparez des étalons d’ADN plasmidique en diluant l’ADN plasmidique du génome vectorisé AAV à 10 nanogrammes par microlitre dans de l’eau ou un tampon Tris-HCL.

Transférez une aliquote de 25 microlitres de l’ADN plasmidique dilué dans un tube frais et linéarisez-le avec une enzyme de restriction appropriée dans un volume de réaction de 50 microlitres pendant une heure. Ajoutez 450 microlitres d’eau ou de TE dans le tube contenant l’étalon d’ADN plasmidique digéré et mélangez soigneusement. Transférez ensuite 70 microlitres de ce mélange dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre avec 1 330 microlitres d’eau ou de TE pour faire un étalon plasmidique dilué.

Pour mettre en place l’appareil de transfert de points, à l’aide de ciseaux, coupez la membrane de transfert à une taille appropriée pour le nombre d’échantillons et d’étalons. Trempez la membrane dans de l’eau pendant 10 minutes avant de la placer sur l’appareil de transfert de points. Ensuite, couvrez les puits inutilisés.

Ajouter de l’eau aux puits dans lesquels les échantillons seront chargés. Appliquez un aspirateur, tirez l’eau à travers les puits, vérifiez s’il y a des erreurs, puis resserrez les vis. Refaites le test si nécessaire.

Appliquez 400 microlitres de chaque étalon d’ADN plasmidique dilué dans chaque puits et effectuez quatre voies de dilutions standard. Utilisez deux aliquotes distinctes de la synthèse standard et chargez-les chacune en double. Appliquez ensuite 200 microlitres par puits de chaque échantillon d’ADN viral.

Appliquez un léger vide pour tirer les solutions d’ADN à travers les puits. Ensuite, une fois tous les puits vidés, libérez le vide en ajustant la vanne à trois voies. Ajouter 400 microlitres d’une solution alcaline X dans chaque puits.

Attendez ensuite cinq minutes avant de réappliquer l’aspirateur pour vider les puits. Réappliquez l’aspirateur et démontez l’appareil de transfert de points. Retirez ensuite la membrane et rincez-la avec deux X SSC.

Placez la membrane sur une serviette en papier propre avec le côté lié à l’ADN vers le haut pour éliminer l’excès de tampon. Utilisez un réticulant UV approprié pour réticuler l’ADN tamponné à la membrane. La membrane est maintenant prête pour l’hybridation.

Placez la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté lié à l’ADN vers le haut. Rincez la membrane avec cinq à 10 millilitres de tampon d’hybridation préchauffé et jetez le tampon. Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon d’hybridation préchauffé et placez la bouteille dans un four d’hybridation rotatif réglé à 65 degrés Celsius.

Faites pivoter la bouteille pendant au moins cinq minutes. Ajoutez rapidement l’ADN du spermatozoïde dénaturé et la sonde radioactive au tampon d’hybridation dans la bouteille et secouez-le pendant 10 secondes pour mélanger. Remettez la bouteille dans le four à 65 degrés Celsius et incubez-la en rotation à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures.

Une fois l’hybridation terminée, arrêtez la rotation. Retirez le flacon d’hybridation, puis versez la solution de sonde radioactive dans un tube conique de 50 millilitres avec un bouchon étanche. Pour laver la membrane, ajoutez 20 à 30 microlitres de tampon de lavage préchauffé dans la bouteille d’hybridation et tournez-la pendant cinq minutes.

Répétez ce lavage deux fois de plus. Après le troisième lavage, retirez la membrane de la bouteille d’hybridation et, à l’aide d’essuie-tout, retirez l’excédent de tampon de la membrane. Placez ensuite la membrane dans un porte-papier en plastique transparent.

À l’aide d’un compteur Geiger, vérifiez les signaux radioactifs sur la membrane. Après avoir exposé l’écran d’imagerie au phosphore effacé à la membrane, balayez l’écran à l’aide d’un système de balayage d’image au phosphore et obtenez les données sur l’intensité du signal de chaque point. Effectuer l’analyse des données selon le protocole texte.

Ce transfert de points quantitatif pour le titrage vectoriel AAV 2G9 comporte deux ensembles d’étalons et trois quantités différentes d’une préparation de vecteur AAV, y compris 0,3, 0,1 et 0,03 microlitres en double. Les quantités à doser sur le transfert sont déterminées empiriquement ou sur la base d’un dosage préliminaire. Il a été déterminé par interpolation que les aliquotes de 0,3, 0,1 et 0,03 microlitre du vecteur AAV 2G9 avaient en moyenne un titre de 5,16, 0,27 nanogramme d’équivalent microlitres.

Toutes les combinaisons possibles de sérotypes apparentés et hétérologues des protéines VP3 cas-pid et AAP des AAV5, AAV9 et AAV de serpent ont été évaluées pour l’assemblage de la capside par un test quantitatif par transfert de points. Les résultats de ce graphique montrent que l’AAV5 VP3 s’assemble indépendamment du fait que l’AAP ait été fourni en trans. De plus, AAP5 et AAP9 peuvent favoriser l’assemblage de la capside AAV9 VP3, bien que AAP5 fonctionne moins efficacement que AAP9.

Ni AAP5 ni AAP9 ne présentent d’activité favorisant l’assemblage sur le serpent AAV VP3, et le serpent AAP ne favorise que l’assemblage du serpent AAV VP3. Une analyse par transfert de points a été appliquée pour évaluer l’activité des nucléases de trois nucléases disponibles dans le commerce dans des conditions non optimisées contenant des impuretés dérivées de cellules et de milieux de culture. L’enzyme A s’est avérée moins active que les deux autres enzymes, ce qui montre que le choix de la nucléase pourrait affecter de manière significative la lecture du test de transfert de points.

Cette technique est simple pour la quantification des vecteurs AAV et essentielle pour évaluer le rôle de l’AAP dans la promotion de l’assemblage de capsides AAV dérivées de sérotypes apparentés et hétérologues. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée si elle fonctionne correctement une fois que les échantillons de test sont obtenus dans des expériences de culture cellulaire. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de pipeter soigneusement le volume de liquide correct pour garantir une précision quantitative.

Après son développement, l’application du test quantitatif dot blot à l’étude de l’AAP a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’AAV pour mieux comprendre le mécanisme d’assemblage de la capside de l’AAV. N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines, des agents viraux, du phénol-chloroforme et des matières radioactives peut être extrêmement dangereux. Et l’utilisation de blouses de laboratoire, de gants et de lunettes de protection est nécessaire pour limiter l’exposition.

Ces matériaux ne doivent être manipulés que dans des zones approuvées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons de transfert de points pour la quantification de l’AAV, de configurer l’appareil de transfert de points, de déterminer le titre de l’AAV et d’appliquer la procédure à l’étude de la biologie de l’AAV. À la suite de cette procédure, d’autres tests tels que les tests de transduction de vecteurs AAV dans des cellules de culture peuvent être effectués pour répondre à des questions supplémentaires, telles que le titre fonctionnel de vectorisé par rapport au titre de particules physique déterminé par le test de transfert de points.