Conséquences à long terme de comportements et reproduction d’exposition embryonnaire à faible dose des substances toxiques

L’objectif général de ces procédures est d’étudier les effets à long terme de l’exposition à de faibles doses de BPA au début de l’embryogenèse. Les embryons de C. elegans sont exposés au BPA pendant une période limitée et testés à l’âge adulte pour la fécondité et le comportement d’apprentissage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les effets à long terme sur le développement de l’exposition à des substances toxiques telles que les bisphénols et d’autres composés perturbateurs endocriniens.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de tester les effets à long terme et subtils des toxiques sur le développement grâce à des tests comportementaux quantitatifs sur un modèle de laboratoire d’invertébrés facile à utiliser. Les implications de cette technique s’étendent à la compréhension de la base développementale et neuronale des effets délétères sur la santé de l’exposition à des substances toxiques, même à de faibles doses. Nous avons d’abord eu l’idée de ces expériences lorsque nous avons réalisé qu’un certain nombre de troubles complexes ou multifactoriels semblaient avoir une composante développementale ou une autre.

Ce qui peut exercer son influence en partie par l’expression anormale de gènes critiques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’habituation au toucher intérieur peuvent être difficiles à apprendre uniquement à l’aide d’instructions textuelles. La veille de la synchronisation, transvaser les vers N2 sur des plaques de 100 millimètres contenant des milieux NGM, étalées avec E.coli OP50.

En découpant une dalle d’environ un centimètre carré. Laissez les vers pousser pendant trois jours à 20 degrés Celsius. Après trois jours, lorsque les plaques sont peuplées d’adultes matures bien nourris contenant des embryons visibles, commencez la synchronisation en lavant d’abord chaque plaque avec cinq millimètres de tampon M9 et en transférant le liquide dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 millilitres.

Centrifugeuse à 3 000 fois la gravité pendant quatre minutes à température ambiante. Après la certification, utilisez une pipette de dix millilitres pour retirer soigneusement le surnageant de chaque pastille libre de vers adultes. Ajoutez ensuite 5 millilitres de solution d’hypochlorite fraîchement préparée à chaque boulette de vers et mélangez délicatement.

Centrifuger à 3 000 fois la gravité à température ambiante pendant quatre minutes. Il est essentiel d’obtenir des populations synchronisées. La préparation d’une solution fraîche d’hypochlorite permet d’éviter la contamination et les animaux non synchronisés.

Ensuite, utilisez une pipette de dix millilitres pour retirer le surnageant et lavez les sept millilitres de tampon M9. Répétez cette étape deux fois. Après le dernier lavage, ajoutez environ 100 microlitres de tampon M9 aux œufs.

Transférez ensuite environ 50 microlitres d’œufs dans deux tubes de microfuge d’un millilitre contenant du BPA dilué dans un tampon S. Ajustez la quantité de tampon S pour assurer la concentration finale correcte de BPA par tube, comme indiqué dans le tableau. Placez les tubes sur un agitateur rotatif ou à bascule, en se déplaçant à 25 inclinaisons par minute, ou 25 tr/min pendant quatre heures à 20 degrés Celsius.

Après quatre heures, placez les tubes dans des porte-tubes et laissez les vers se déposer. Jetez le surnageant et transférez les vers dans des plaques NGM ensemencées avec OP50 E. coli. Laissez les vers pousser pendant 60 heures à 20 degrés Celsius.

Examinez les plaques tous les jours pour détecter toute contamination. Les plaques NGM contaminées sont généralement décolorées et accompagnées de colonies individuelles. Vérifiez les vers au microscope pour voir s’il n’y a pas de surpeuplement.

Tout d’abord, à l’aide d’un pic en fil de platine de calibre 30 stérilisé au feu, transférez une dizaine de jeunes vers adultes synchronisés dans de nouvelles plaques NGM non ensemencées. Laissez les vers tranquilles pendant cinq minutes pour leur donner le temps de s’acclimater à la nouvelle plaque. Ensuite, stérilisez un poil de sourcil attaché à l’extrémité d’une brochette en bois ou d’un cure-dent en le trempant dans de l’éthanol à 70 %.

Essuyez avec un mouchoir propre et non pelucheux et attendez une minute pour que l’éthanol s’évapore. Touchez doucement le ver sur la tête à l’aide des poils des sourcils. Répétez les touchers, en laissant dix secondes entre les contacts pour permettre au ver de récupérer.

Continuez à toucher, laissez des intervalles de dix secondes entre les stimuli jusqu’à ce que le ver ne recule plus. Notez le nombre de contacts nécessaires pour que cette accoutumance se produise. Il est important de laisser un intervalle de dix secondes entre les touchers, car cela permet à l’animal de récupérer son temps et d’obtenir des tests de comportement d’habituation cohérents.

Les animaux adultes qui ont été exposés embryonnairement à une concentration micromolaire ou supérieure de BPA ont pondu beaucoup moins d’œufs par rapport au témoin représenté par la ligne horizontale. Les animaux adultes issus d’embryons qui ont été exposés à des concentrations de BPA aussi faibles que 0,1 micromolaire présentent des déficits non associatifs basés sur le nombre accru de contacts antérieurs nécessaires pour qu’ils s’habituent. Lors de la préparation des embryons à l’exposition au BPA, il est important de choisir une plaque avec des adultes C. elegans bien nourris avec des œufs matures visibles au microscope de dissection afin d’avoir une taille d’échantillon suffisante.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie environnementale pour évaluer les effets des toxines et d’autres composés perturbateurs endocriniens sur le comportement et concevoir des expériences mécanistes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exposer les embryons de C. elegans à un stade précoce au BPA et comment tester le comportement d’habituation chez les adultes résultant des embryons exposés au BPA.