Une méthode améliorée pour la collecte du liquide céphalo-rachidien de souris anesthésiés

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer la collecte de liquide céphalo-rachidien chez les souris sans contamination par le sang. Cette méthode offre un moyen simple et fiable de collecter du LCR pour surveiller les biomarqueurs des maladies neuronales. Le principal avantage de cette technique est que l’ajout avec le micromanipulateur pour aider à la collecte du LCR chez les souris diminue la contamination du sang pendant la collecte.

Commencez par placer un capillaire en verre tiré dans un support capillaire solidement monté sur un micromanipulateur. Ensuite, lors de l’observation à travers un microscope à dissection, utilisez une pince droite pour casser l’extrémité du capillaire aiguisé de sorte que le diamètre intérieur de la pointe cassée soit d’environ 10 à 20 microns. Fixez ensuite un tube mince et une seringue à l’autre extrémité du support capillaire, connectez le tube mince et la seringue avec une valve à trois voies et déplacez la valve à trois voies pour l’ouvrir.

Plongez ensuite la seringue pour expulser tous les contaminants et créer une pression positive dans le tube capillaire. Répétez cette opération plusieurs fois en déconnectant et en reconnectant la seringue à la valve à trois voies. Puisez ensuite de l’air à 100 à 200 microlitres avant la reconnexion définitive de la seringue avec la valve à trois voies.

Déplacez le micromanipulateur avec le capillaire en verre sur le côté pour éviter de l’endommager pendant l’intervention chirurgicale. Avant de commencer l’opération, assurez-vous que la souris a été complètement anesthésiée en pinçant les quatre membres et en observant l’absence de réaction. Ensuite, utilisez des ciseaux à disséquer pour couper et couper les cheveux à l’arrière de la tête de la souris, du dessus des yeux entre les oreilles jusqu’au bas du cou.

Fixez la tête de la souris à l’aide d’un adaptateur de souris à cadre stéréotaxique. Assurez-vous que la tête ne peut pas bouger et qu’elle est bien fixée dans l’adaptateur en appuyant doucement sur la tête de la souris. À l’aide de ciseaux et de pinces incurvées, coupez la peau de la souris à l’arrière du cou, puis au milieu du crâne, entre les oreilles et les yeux de la souris.

Séparez la peau et les tissus et sortez-les de la zone au-dessus de la citerne magna. Pendant que vous regardez à travers le microscope de dissection, disséquez soigneusement les dernières couches minces de muscle sur la base du crâne à l’aide d’une pince et déplacez ces couches de muscle sur le côté et hors de la zone d’intérêt. Une fois que la dure-mère sur la citerne magna est exposée, utilisez un coton-tige humide pour essuyer la membrane, puis utilisez un coton-tige sec pour sécher la zone.

La citerne magna apparaît triangulaire avec un à deux gros vaisseaux sanguins qui traversent la zone. L’un ou l’autre côté ou entre les vaisseaux sanguins est optimal pour l’insertion capillaire et la collecte du LCR. Une fois que la citerne magna est exposée, utilisez le micromanipulateur pour aligner le capillaire en verre à l’arrière de la tête de la souris de sorte que la pointe aiguisée soit juste derrière la membrane à un angle de 30 à 45 degrés.

Ensuite, plongez la seringue une ou plusieurs fois, puis reculez le piston de 100 à 200 microlitres pour vous assurer qu’il n’y a pas de contaminants et qu’il y a une pression négative dans le capillaire en verre. Rapprochez ensuite l’embout capillaire de la membrane jusqu’à ce qu’une résistance soit visible, mais sans perforer la membrane. Frappez sur les commandes du micromanipulateur pour tapoter doucement le tube capillaire à travers la membrane.

Le LCR doit être automatiquement aspiré dans le tube capillaire une fois que l’ouverture a été percée. Laissez le capillaire en place pour recueillir lentement le LCR. Si le LCR a cessé de couler, tirez lentement la seringue vers le haut d’environ 50 microlitres pour créer plus de pression négative dans le capillaire.

Dix à 15 microlitres de LCR sont collectés en 10 à 30 minutes. Une fois que le volume désiré de LCR a été prélevé, fermez la tubulure en déplaçant la valve à trois voies pour fermer et retirer la seringue reliée à la tubulure. Ouvrez puis fermez la tubulure pour créer une pression égale dans le capillaire, la tubulure et la zone à l’extérieur du capillaire.

Rebranchez ensuite la seringue avant de retirer délicatement le capillaire en verre de la souris à l’aide d’un micromanipulateur. Ensuite, placez le tube de prélèvement contenant un microlitre d’inhibiteur de protéase 20X sous la pointe aiguisée du capillaire en verre. Ouvrez la tubulure et plongez doucement la seringue.

Le LCR doit s’écouler hors du capillaire et dans le tube de collecte. Après le prélèvement, centrifuger le LCR par impulsions pour mélanger l’échantillon avec l’inhibiteur de protéase au fond du tube de prélèvement. Les échantillons de LCR peuvent être aliquotes, puis stockés pour une analyse plus approfondie à moins 80 degrés Celsius.

Le LCR prélevé sur des souris APP/PS1 a montré une augmentation significative des niveaux de A bêta 42 humain à l’âge de 12 mois. Chez les souris de type sauvage, aucun A bêta 42 humain n’a été détecté. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en une heure si elle est effectuée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter les vaisseaux sanguins lors de l’insertion du capillaire et de ne faire que des ajustements mineurs avec le micromanipulateur lors de la collecte du LCR pour éviter la contamination par le sang.