Name: Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez l'imagerie biphotonique du calcium dans les dendrites neuronales en combinant patch-clamp et microscopie à deux photons sur des tranches de cerveau de souris. Cette méthode offre une résolution spatiotemporelle élevée pour observer l'intégration synaptique.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil des instituts de recherche en santé, Sciences naturelles et en génie (subvention à la découverte du CRSNG) et la Fondation Savoy. OC a été soutenu par une bourse de doctorat du CRSNG.

Toutes les expériences ont été réalisées selon les orientations de bien-être de l’Animal Protection Comité de Université Laval et le Conseil canadien de protection des animaux.
1. préliminaire préparation (facultatif : préparer 1 jour à l’avance)
<ol><li>Préparer trois types de solution liquide céphalorachidien artificiel (FSCA) (Normal, saccharose et Solutions de récupération, 1 L ; voir tableau 1). Ajuster l’osmolalité des solutions à 300 ± 10 mOsm25 et refroidir le FSCA-Sucrose jusqu'à un point près du point de congélation (0-4 ° C). Remarque : L’utilisation d’une solution de découpe de faible teneur en sodium (ACSF-saccharose) permet de préserver la viabilité des neurones dans les couches superficielles des tranches aiguë26.</li>
	<li>Préparation de 0,75 mL de patch-solution contenant un fluorophore rouge (p. ex., Alexa-594) et un indicateur de calcium synthétique vert (p. ex., Oregon vert BAPTA-1 ; voir tableau 1). Inclure la biocytine (voir tableau 1) dans la solution de patch si post hoc d’identification morphologique des cellules enregistrés est nécessaire.</li>
	<li>Ajuster l’osmolarité de la solution à 280 ± 5 mOsm et pH à 7,35 ± 0,5. Conserver la solution dans le réfrigérateur ou sur la glace en permanence. Nota : Choix de l’indicateur de calcium doit être fondée sur sa gamme dynamique et sur la nature de l’enquêtés événements2 + Ca.</li>
	<li>À l’aide d’un extracteur de micropipette, préparer des pipettes de patch de capillaires en verre borosilicate (voir Table des matières) avec une pointe de 2 µm ≈ (résistance de pipette de MΩ 3-5) et de pipettes de stimulation de capillaires en thêta-verre borosilicaté (voir Table de Matériaux) avec une pointe de 2 à 5 µm. Remarque : Les paramètres extracteur pour faire des pipettes d’une forme et un diamètre donné seront déterminés par le type de filament extracteur et les résultats de test de rampe pour un type donné de verre.</li>
</ol>2. préparation de la tranche hippocampe
<ol><li>Anesthésier la souris (P13-20 ; la souche et le sexe de la souris est déterminé par la question expérimentale étant adressée) avec 1 mL d’isoflurane, placé sur une serviette en papier dans une chambre de narcose par inhalation. Lorsque l’animal est profondément anesthésié, comme en témoigne d’un manque de mouvement et la respiration lente, retirez-la de la chambre de narcose et décapiter à l’aide d’une guillotine.</li>
	<li>Exposer le crâne en coupant la peau avec une petite paire de ciseaux à l’arrière du crâne vers le nez. Une petite paire de pinces-gouges mini OS permet de faire un trou au niveau du bregma. Puis utilisez les ciseaux pour faire une coupe caudal-à-rostral le long de la suture sagittale. Avec les pinces-gouges saisir l’arrière de chaque lambeau de crâne et ascenseur vers le haut et vers l’extérieur pour enlever le crâne couvrant chaque hémisphère.</li>
	<li>Après que le cerveau est complètement exposé, sapent les nerfs optiques avec une petite spatule. Enlever le cerveau du crâne et la mettre dans une boîte de Pétri contenant continuellement oxygéné, froid ACSF-saccharose (voir le tableau 1 pour la concentration de saccharose).<ol>
<li>Si les tissus des souris âgées est nécessaire, effectuer une perfusion intracardiaque avec une seringue (25G) contenant 20 mL de glacee ACSF-Sucrose avant l’extraction du cerveau pour obtenir des tranches de bonne qualité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer des tranches d’hippocampe du cerveau animal extrait.<ol>
<li>Laissez le froid de cerveau pendant environ 2 min. Placez un morceau de papier filtre sur un plat de Pétri sous glace, transférer le cerveau sur le papier filtre. Disséquer les deux hémisphères.</li>
		<li>Coller les hémisphères disséqués (l’orientation est déterminée par l’objectif expérimental pour obtenir des tranches de coronal, transversale, ou horizontale) sur une table vibratome et plongez-le dans le bac de vibratome rempli glacé oxygéné ACSF-saccharose. Faire des tranches épaisses à une température d’environ 1 ° C 300 µm en utilisant un refroidisseur vibratome ou en plaçant la glace autour de la barre d’État vibratome.</li>
		<li>À l’aide d’un pinceau plat, s’accumulent les tranches contenant l’hippocampe (jusqu'à 6 tranches par hémisphère) dans un bain contenant oxygéné ACSF-récupération chauffée à 37 ° C.</li>
		<li>Laissez les tranches dans le bain de l’ACSF-récupération pendant au moins 45 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. enregistrements de Patch-clamp de la cellule entière
<ol><li>Mise en place dans un bain positionné sous l’objectif d’une tranche de hippocampe (grossissement : 40 x, ouverture numérique : 0,8) d’un microscope biphotonique à balayage laser. Continuellement perfuse le bain oxygéné ACSF-normale chauffé à 30-32 ° C à raison de 2,5 à 3 mL/min.</li>
	<li>Utiliser le contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) ou microscopie Dodt-SGC pour localiser une cellule d’intérêt à l’aide de sa taille, la forme et la position. Remarque : Selon la population de neurones ciblés, un modèle de souris transgénique permet de localiser facilement les cellules d’intérêt. Dans ce cas, cette étape peut être substituée avec utilisation d’une source lumineuse fluorescente.</li>
	<li>Remplir une pipette de stimulation avec une solution de FSCA normale contenant le fluorophore rouge (p. ex., Alexa-594).</li>
	<li>La valeur de la pipette de stimulation (connectée à un appareil de stimulation électrique) sur le dessus de la tranche pour que l’astuce est dans la même région que la cellule d’intérêt.</li>
	<li>Après avoir remplir la pipette solution de patch et en l’attachant à un stade de tête, réglez-le sur la tranche afin que son extrémité soit directement au-dessus de la cellule d’intérêt.</li>
	<li>Insérer une seringue dans un robinet à trois voies et connectez-le à la pipette-à travers le tube en plastique. Injecter une pression positive constante dans la pipette (≈ 0,1 mL) à l’aide de la seringue. Garder le robinet d’arrêt en position « close ».</li>
	<li>Activer le module amplificateur contrôle et passer en mode voltage clamp en cliquant sur le bouton « VC ». Ouvrez le logiciel d’acquisition de données électrophysiologie (p. ex., clampex) pour l’acquisition de signaux électrophysiologiques et cliquez sur l’icône « Membrane Test » de l’avoir continuellement envoient une impulsion de tension carrée (5 mV, 10 ms), qui est nécessaire pour surveiller changements dans la résistance de la pipette.</li>
	<li>Abaissez la pipette jusqu'à ce qu’il est juste au-dessus de la cellule cible. Lors de prise de contact avec la membrane cellulaire, enlever la pression en tournant le robinet d’arrêt en position « ouverte ». Remarque : Contact avec la membrane cellulaire est détecté lorsqu’une légère augmentation de la résistance de la pipette (≈ 0,2 MΩ) est considéré et une petite échancrure sur la cellule est causée par une pression positive.</li>
	<li>Appliquer une légère pression négative à la pipette en utilisant une seringue vide insérée dans le robinet jusqu'à ce que la résistance de la pipette fournie par le logiciel atteigne 1 GΩ. Dans la fenêtre « Membrane Test » du logiciel d’acquisition de données, serrer la cellule à -60 mV.</li>
	<li>Continuent jusqu'à ce que la cellule est ouverte et la configuration de la cellule entière est obtenue en appliquant une pression négative. Détection de cet état de la cellule est basée sur le changement soudain de la résistance de la pipette (à partir de 1 GΩ à MΩ de 70 à 500 selon le type d’interneurones) et l’apparition de forts transitoires capacitifs dans la fenêtre « Membrane ».</li>
</ol>4. deux photons Ca2 + imagerie
<ol><li>Si vous êtes intéressé dans les réponses postsynaptiques excitateurs, ajouter le gabazine de bloqueur du récepteur GABAA (10 µM) et le bloqueur des récepteurs GABAB CGP55845 (2 µM) dans le bain du fsca.</li>
	<li>Dans le module amplificateur contrôle logiciel, définir la configuration de patch à courant-clamp en cliquant sur le bouton « CC » et enregistrer le modèle de mise à feu de la cellule en réponse aux injections somatiques de courant de dépolarisation (0,8 à 1,0 nA, 1 s). Attendez au moins 30 min pour la cellule à remplir avec les indicateurs présents dans la solution de patch. Remarque : Modèle de mise à feu et les propriétés actives de la cellule peuvent être utilisées pour identifier le sous-type de la cellule ; par exemple, cellules rapide-dopage. Il est important pour la concentration de l’indicateur à stabiliser par l’intermédiaire de diffusion avant de commencer pour enregistrer les chats (voir le tableau 2 pour le dépannage).</li>
	<li>Chats évoquée par AP<ol>
<li>En utilisant le logiciel d’acquisition image, commencent à acquérir des images. Localiser une dendrite d’intérêt en utilisant le signal de fluorescence rouge. Afin d’assurer une réponse visible, tout d’abord, choisissez une dendrite proximale (≤ 50 µm) car l’efficacité de rétro-propagation AP peut décliner significativement avec la distance d’interneurones GABAergiques22.</li>
		<li>À l’aide de le « outil de sélection rectangulaire » dans le logiciel d’acquisition image, zoomer sur la région ciblée et passer à la "xt » (IRLS) mode. L’analyse du poste dans l’ensemble de la branche dendritique d’intérêt. Avec les contrôleurs d’intensité laser dans le logiciel d’acquisition, fixer le deux photons laser à un niveau de puissance minimale où fluorescence vert de base est à peine visible, afin d’éviter la phototoxicité.</li>
		<li>Dans le logiciel électrophysiologie d’acquisition données logiciel d’acquisition de fenêtre et de l’image « Protocole », créez un essai d’enregistrement de la durée désirée contenant une injection de courant somatique de l’amplitude souhaitée.<ol>
<li>À l’aide de logiciels d’acquisition de l’image, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » et acquérir la fluorescence en continu pendant 1-2 répéter s. l’acquisition de l’image 3 - 10 fois. Attendez au moins 30 s entre les balayages simples pour éviter le photovieillissement. Si l’acquisition de linescans en plusieurs points le long d’une dendrite, emmenez-les dans un ordre aléatoire pour éviter les effets d’ordre.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synapses évoquée par les chats<ol>
<li>Localiser une dendrite d’intérêt en utilisant le signal de fluorescence rouge.</li>
		<li>Définissez la pipette de stimulation sur la surface de la tranche au-dessus de la dendrite d’intérêt. Abaissez lentement la pipette de stimulation en place, réduisant au minimum de mouvement pour ne pas perturber la configuration cellule entière. Placez la pipette à 10 à 15 µm de la dendrite.</li>
		<li>Pour visualiser l’emplacement des microdomaines synaptiques en dendrites d’aspiny, dans le logiciel d’acquisition image, basculez vers le 'xt' mode (IRLS) et positionner la ligne le long de la branche dendritique d’intérêt.</li>
		<li>Dans la fenêtre de « Protocole » (des logiciels d’acquisition de données électrophysiologie) et logiciel d’acquisition image, créer un essai d’enregistrement qui déclenche l’appareil de stimulation après le début du procès.</li>
		<li>En utilisant le logiciel d’acquisition, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » pour scanner le long de la dendrite en continu pendant 1-2 s. Repeat acquisition 3 - 5 fois, attendre 30 s entre les balayages pour prévenir le photovieillissement. Remarque : La durée de scan peut être ajustée selon la cinétique de la manifestation évoquée, mais devrait être réduite au minimum pour éviter le photovieillissement (voir le tableau 2 pour le dépannage).</li>
		<li>Répétez l’étape 4.5.5 dans des conditions différentes (par exemple, différente intensité/durée de la stimulation, l’introduction d’un bloqueur pharmacologique, etc.) selon la question traitée.</li>
		<li>L’acquisition s’arrête lorsque la cellule montre des signes de détérioration de la santé : dépolarisation au-dessous de -45 mV, augmentation du niveau de base niveau2 + Ca, détérioration morphologique des dendrites (p. ex., blebbing, fragmentation ; voir tableau 2 pour le dépannage).</li>
		<li>Pour obtenir des renseignements préliminaires sur la morphologie de la cellule et tenir un registre de l’emplacement de la pipette de stimulation, acquérir une Z -pile de la cellule dans le canal rouge. En utilisant le logiciel d’acquisition dans 'xyz' mode, défini les limites supérieures et inférieures de pile à toute la cellule d’image avec tous les processus inclus. Définir la « taille d’étape » à 1 µm et démarrer l’acquisition de la pile en utilisant le bouton « Démarrer l’enregistrement ».</li>
		<li>Lorsque le Z-acquisition de pile est terminée, utilisez l’option de « projection Maximum » dans le logiciel pour superposer tous les plans d’intervention de la pile et de vérifier la qualité de l’acquisition. Puis, rétracter lentement la pipette sur la tranche.</li>
		<li>Pour corriger la tranche pour identification morphologique post hoc , rapidement enlever la tranche de la baignoire à l’aide d’un pinceau plat et placez-le entre deux papiers filtres, dans un récipient Petri fsca. Remplacer le FSCA avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % et laisser le plat dans une pièce à 4 ° C ou le réfrigérateur une nuit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immunohistochimie pour Post Hoc Identification morphologique des cellules enregistrés
Remarque : Après 1 nuit de fixation en PFA, les tranches peuvent être stockés dans un tampon phosphate (PB) avec azide de sodium (0,5 %) pendant environ 1 mois.
<ol><li>Mettre les tranches dans une solution saline tampon Tris (TBS) avec Triton X-100 (0,3 %) et d’effectuer 4 lavages (5-10 min chacun).</li>
	<li>Mettre la tranche de SCT-Triton 0,3 % avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h.</li>
	<li>Mettre la tranche de SCT-Triton 0,3 % à 1 %, NGS et un fluorophore conjugué streptavidine (p. ex., Alexa Fluor 546 conjugué streptavidine, 1 : 200) pour la nuit d’incubation.</li>
	<li>Lavez 4 fois (5-10 min) dans les directives du SCT.</li>
	<li>Monter les tranches sur lames de microscope et image à l’aide d’un microscope confocal. Pour avoir une reconstitution de la cellule complète, acquérir un Z-pile (taille d’étape : 1 µm) à l’aide d’un objectif 20 x. Pour l’imagerie une étiquette Alexa-546-conjugués, utilisez qu'un laser à 543 nm et une détection de 515-560 nm filtre choisi.</li>
</ol>6. analyse des chats
<ol><li>Extraire les valeurs de la fluorescence des régions d’intérêt (ROIs) dans les images IRLS depuis les canaux rouge et verts et la moyenne des valeurs des multiples séquences répétées pour chaque condition réduire le bruit. Remarque : Lors de l’acquisition d’IRLS est effectuée le long de la dendrite, il est possible d’extraire des données de plusieurs ROIs, qui peuvent correspondre à des microdomaines dendritiques (2 à 5 µm), et permettant ainsi l’étude de la compartimentation Ca2 + signal.</li>
	<li>Pour chaque ROI, exprimer les changements Ca2 + amplitude comme : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> NOTE : Ici G est la valeur de la fluorescence de la couche verte ; G0 est la valeur de fluorescence de base de la couche verte pendant la période de stimulation préalable ; R est la valeur de la fluorescence de la couche rouge18. Comme excitation biphotonique est très localisée et ne génère pas d’une expérience significative, soustraction de fluorescence de fond n’est pas requise.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

La méthode présentée ici montre comment la combinaison de deux photons Ca2 + imagerie et électrophysiologie patch clamp peut être utilisée pour l’étude dendritiques Ca2 + la signalisation dans les dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë. Cette méthode permet le suivi des deux locaux Ca2 + élévations évoquées par AP électrique de stimulation ou backpropagating segments dendritiques et somatique réponse de la cellule. Ce qui rend un excellent outil pour étudier comment les d...

La contribution d’un neurone à l’activité du réseau est en grande partie déterminée par la nature dynamique des entrées synaptiques qu’il reçoit. Traditionnellement, la principale méthode de caractérisation de l’activité synaptique dans les neurones s’est fondé sur les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière somatique des courants postsynaptiques évoqués par stimulation électrique des axones de passage. Toutefois, la seule activité des synapses situées dans la partie proximale est véridiquement signalée dans ce cas1. En outre, afin d’évaluer les mécanismes spécifiques à synapse, enregistrements de paires de neurones et de dendrites à un endroit précis ont été utilisés pour cibler les synapses d’intérêt et les mécanismes d’intégration dendritique, respectivement. Une percée majeure dans le domaine de la physiologie synaptique a été atteint par un mariage des techniques optiques et électrophysiologiques. Excitation biphotonique microscopie à balayage laser (2PLSM) en combinaison avec les outils d’optogenetic et de Ca2 + imagerie peut révéler des détails extraordinaires de l’organisation dynamique de l’activité synaptique à connexions neuronales spécifiques dans des tranches de cerveau dans vitro et in vivo.
Plusieurs avantages principaux faits 2PLSM se démarquer de l’excitation classiques, un photon microscopy2: (1) en raison de la nature non linéaire d’excitation à deux photons, la fluorescence est générée uniquement dans le volume focal, et représentent tous les photons émis signaux utiles (pas besoin de trou d’épingle) ; (2) longueurs d’onde, utilisés en 2PLSM, pénètrent dans les tissus de diffusion plus efficacement ; en outre, les photons dispersés sont trop diluées pour produire l’excitation biphotonique et fluorescence de fond ; (3) le photovieillissement et phototoxicité sont également limités à plan focal. Par conséquent, malgré le coût élevé des systèmes 2 photons par rapport aux microscopes confocaux classiques, la 2PLSM reste une méthode de choix pour enquête à haute résolution de structure neuronale et la fonction dans les tissus vivants épais.
La première application de 2PLSM dans les tissus de diffusion a été à l’image de la structure et la fonction des épines dendritiques3. 2PLSM en combinaison avec Ca2 + imagerie a révélé cette fonction d’épines comme des compartiments isolés biochimiques. Puisque de nombreux types de neurones, il y a une correspondance biunivoque entre les épines et les synapses individuels4, deux photons Ca2 + imagerie bientôt est devenu un outil de reporting de l’activité des synapses individuelles en tissu intact5, 6,7,8. En outre, 2PLSM Ca2 + imagerie a été utilisée avec succès pour surveiller l’activité des canaux calciques unique et les interactions non linéaires entre les conductivités intrinsèques et synaptiques, ainsi que d’évaluer l’État et l’activité dépendante- régulation du Ca2 + signalisation neuronale dendrites5,6,7,8,9,10,11.
Le calcium est un omniprésent second messager intracellulaire, et son organisation spatio-temporelle subcellulaire détermine la direction de réactions physiologiques, de modifications de la force synaptique à la régulation des ions canaux, croissance dendritique et la colonne vertébrale, comme Bien que la mort cellulaire et la survie. Dendritiques Ca2 + élévations se produisent via l’activation de multiples voies. Potentiels d’action (PA), backpropagating pour les dendrites, ouvrir de canaux voltage-dépendants de calcium12 et produire des transitoires relativement globales Ca2 + (chats) dans les dendrites et les épines13. La transmission synaptique est associée à l’activation de postsynaptique Ca2 +-récepteurs perméables (NMDA, Ca2 +-perméable AMPA et kaïnate), déclenchement synaptique chats6,14,15. Enfin, SUPRALINÉAIRE Ca2 + événements peuvent être générés en dendrites sous certaines conditions11,12,13,16.
Deux photons Ca2 + imagerie en combinaison avec les enregistrements électrophysiologiques de patch clamp emploie synthétique Ca2 +-indicateurs fluorescents, qui sont généralement livrés par le biais de l’électrode de patch pendant les enregistrements de cellules entières . Une méthode standard pour la quantification de Ca2 + dynamique repose sur l’indicateur de double méthode17,18. Il utilise deux fluorophores avec des spectres d’émission bien séparées (par exemple, une combinaison d’un rouge Ca2 +-insensible colorant vert Ca2 + indicateurs, tels que l’Oregon vert BAPTA-1 ou Fluo-4) et présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de l’indicateur unique. Tout d’abord, un Ca2 +-colorant insensible est utilisé pour localiser les petites structures d’intérêt (ramifications dendritiques et épines) où l’imagerie2 + Ca sera effectuée. Deuxièmement, le rapport entre la variation de la fluorescence verte et rouge (ΔG/R) est calculé en guise de [Ca2 +], qui est pratiquement insensible aux variations de fluorescence de base en raison de fluctuations [Ca2 +]017 , 18. en outre, les changements de fluorescence peuvent être calibrés en termes absolus, Ca2 + concentration19.
Une préoccupation générale lors de l’exécution de deux photons Ca2 + imageries expériences en tranches aiguës est la cellule santé et la stabilité de l’acquisition d’image en raison de la puissance du laser haute généralement utilisée. En outre, dans les2 + expériences d’imagerie, de Ca on se préoccupe de la perturbation et l’importante surestimation de subcellulaire Ca2 + dynamique dû au fait que servent d’indicateurs de Ca2 + très mobiles exogène Ca2 + mémoires tampons. Ainsi, le choix de l’indicateur de Ca2 + et sa concentration dépend du type neuronal, l’amplitude attendue des chats et la question expérimentale.
Nous avons adapté la méthode biphotonique Ca2 + imagerie pour recherche de Ca2 + fluctuations de dendrites de GABAergique interneurones9,10,11,20,21 , 22. alors que la majeure partie des premiers Ca2 + études d’imagerie ont été effectuées dans les principaux neurones, interneurones inhibiteurs présenter une grande variété de mécanismes2 + Ca fonctionnels qui sont distincts de ceux des cellules pyramidales20 , 23 , 24. ces mécanismes interneurone spécifiques (par exemple, Ca2 + perméables récepteurs AMPA) pourraient jouer un rôle spécifique dans la régulation de l’activité des cellules. Dendritiques Ca2 + signalisation dans des interneurones est une cible tentante pour complément d’enquête, deux photons Ca2 + imagerie dans les dendrites des cellules présente des difficultés supplémentaires, d’un diamètre plus mince des dendrites et manque d’épines pour une particulièrement élevé Ca2 + liaison capacité endogène. Comme nos recherches portent sur l’étude des interneurones hippocampe, le protocole suivant, alors qu’il y a lieu à différentes populations de neurones, a été adapté pour faire face à ces défis.
Ce protocole a été exécuté avec un microscope confocal de deux photons commercial, qui était équipé de deux détecteurs externes, non-descanned (NDDS™), modulateur électro-optique (MOE) et un Dodt balayage dégradé contraste (CGT) et installé sur une table optique. Le microscope a été couplé avec un laser Ti : Sapphire de multiphoton mode bloqué à 800 nm (> 3 W, 140 impulsions fs, 80 Hz fréquence de répétition). Le système d’imagerie était équipé d’une plate-forme d’électrophysiologie standard, y compris une chambre de perfusion avec contrôle de température, une plateforme de traduction avec deux micromanipulateurs, un amplificateur de la microélectrode contrôlé par ordinateur, un numériseur, une stimulation appareil et logiciel d’acquisition de données.

<table><tbody><tr><td>Souche animale : Souris CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 chlorhydrate</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde en poudre, 95 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Gluconate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&nbsp ;</td><td>Chlorhydrate de trizma Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de sodium monobasique monohydraté&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> Adénosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> Guanosine (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> Phosphocréatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Alexa-546 conjugué à la streptavidine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> Patch Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> Theta Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 Extracteur de micropipettes flamboyantes/brunes</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 Microscope multiphotonique confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti :Laser multiphotonique saphir&nbsp ;</td><td>Logiciel d’acquisition</td> d’imagerie LAS AF cohérent <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Contrôleur de température TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp 700B</td><td>Amplifier Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A</td><td>Digitizer Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal Traducteur</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulateur</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp Logiciel d’acquisition de données</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 Isolateur de stimulus à courant constant</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibraplane Table</td><td>optique Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie biphotonique calcium en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagerie de calcium (Ca2 +) est un outil puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle de Ca2 + signaux intracellulaires dans les dendrites neuronales. Ca2 + fluctuations peuvent se produire à travers une variété de membrane et mécanismes intracellulaires et jouent un rôle crucial dans l’induction de la plasticité synaptique et la régulation de l’excitabilité dendritique. La capacité d’enregistrer différents types de signaux de Ca2 + en ramifications dendritiques est donc précieuse pour des groupes d’étudier comment dendrites intègrent l’information. L’avènement de la microscopie biphotonique a fait ces études beaucoup plus facile en résolvant les problèmes inhérents à l’imagerie dans les tissus vivants, tels que la diffusion de la lumière et le photovieillissement. En outre, grâce à la combinaison de techniques électrophysiologiques classiques avec deux photons Ca2 + imagerie, il est possible d’étudier Ca2 + fluctuations locales dans les dendrites neuronales en parallèle avec les enregistrements de l’activité synaptique Soma. Nous décrivons ici comment utiliser cette méthode pour étudier la dynamique des locaux Ca2 + transitoires (chats) dans les dendrites des interneurones inhibiteurs GABAergiques. La méthode peut être également appliquée à l’étude dendritiques Ca2 + signalisation dans différents types de neurones dans des tranches de cerveau aiguë.

En utilisant le protocole présenté ici, nous avons obtenu des chats évoquées par injection de courant somatique et par la stimulation électrique dans les dendrites des interneurones oriens/alveus dans la région CA1 de l’hippocampe. Après patcher un neurone, identifié selon sa forme et sa position, nous avons acquis linescans travers une dendrite proximale en plusieurs points au vu des distances depuis le soma (Figure 1 a). Nous avons observé une diminution de...

Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

L’objectif global de cette expérience est d’étudier les élévations calciques dans les dendrites neuronales en réponse à différents paradigmes de stimulation en utilisant des enregistrements patch-clamp de cellules entières dans le soma neuronal en parallèle avec l’imagerie calcique à deux photons dans les dendrites. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller la signalisation calcique dans de petits compartiments dendritiques, permettant une observation étroite des processus qui se produisent dans les branches dendritiques lors de l’intégration des entrées synaptiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’observer les modèles de signalisation calcique avec une résolution et une spécificité spatio-temporelles élevées.Placez le cerveau de la souris sur une boîte de Pétri contenant du saccharose ACSF froid et oxygéné en continu. Pour préparer des tranches d’hippocampe à partir du cerveau extrait, laissez le cerveau refroidir pendant environ deux minutes. Ensuite, placez un morceau de papier filtre sur une boîte de Pétri remplie de glace et transférez le cerveau sur le papier filtre.Ensuite, disséquez le cerveau en deux hémisphères. Collez les hémisphères disséqués sur une plate-forme de sectionnement de vibratome et immergez-les dans le plateau de sectionnement rempli de saccharose ACSF oxygéné glacé. Par la suite, sectionnez des tranches de 300 micromètres d’épaisseur à un degré Celsius à l’aide d’un refroidisseur de vibratome ou en plaçant la glace autour du plateau de vibratome.À l’aide d’un pinceau, transférez les tranches contenant l’hippocampe dans un bain de récupération ACSF oxygénée chauffé à 37 degrés Celsius. Dans cette étape, transférez une tranche d’hippocampe dans un bain sous l’objectif d’un microscope à deux photons à balayage laser. Perfuser continuellement le bain avec de l’ACSF-normal oxygéné.Ensuite, utilisez la microscopie à contraste interférentiel différentiel infrarouge pour localiser une cellule d’intérêt en utilisant sa taille, sa forme et sa position. Après cela, remplissez une pipette stimulante avec une solution ACSF-normale contenant le fluorophore rouge. Abaissez-le sur le dessus de la tranche de manière à ce que la pointe se trouve dans la même région que la cellule d’intérêt.Ensuite, remplissez la pipette patch avec la solution patch et fixez-la à l’étage de tête. Placez-le sur la tranche de manière à ce que sa pointe soit directement au-dessus de la cellule d’intérêt. Ensuite, insérez une seringue dans le robinet d’arrêt à trois voies et connectez-la à la pipette patch à travers un tube en plastique.Injectez une pression positive constante dans la pipette patch et maintenez le robinet d’arrêt en position fermée. Ensuite, ouvrez le module logiciel de contrôle de l’amplificateur MultiClamp et passez en mode Voltage Clamp en cliquant sur le bouton VC. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données d’électrophysiologie Clampex pour l’enregistrement des signaux électrophysiologiques, puis cliquez sur l’icône de test de membrane pour envoyer une impulsion de tension carrée constante afin de surveiller les changements de résistance de la pipette.Maintenant, abaissez la pipette patch jusqu’à ce qu’elle se trouve juste au-dessus de la cellule ciblée. En entrant en contact avec la membrane cellulaire, retirez la pression en tournant le robinet d’arrêt en position ouverte. Ensuite, appliquez une légère pression négative sur la pipette patch à l’aide d’une seringue vide insérée dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que la résistance de la pipette atteigne un gigaohm.Dans la fenêtre Test de membrane du logiciel d’acquisition de données, fixez la cellule à moins 60 millivolts. Continuez à appliquer une pression négative jusqu’à ce que la résistance de la pipette diminue et que la configuration de l’ensemble de la cellule soit obtenue. Dans le module logiciel de contrôle de l’amplificateur MultiClamp, réglez la configuration du patch sur la pince de courant en cliquant sur le bouton IC, et enregistrez les propriétés de la membrane en réponse aux injections somatiques de courants hyperpolarisants et dépolarisants.Attendez au moins 30 minutes que la cellule soit remplie avec les indicateurs présents dans la solution de patch. Pour acquérir des images, localisez une dendrite d’intérêt à l’aide du signal de fluorescence rouge. Assurez-vous d’une réponse visible en choisissant une dendrite proximale inférieure à 50 micromètres, car l’efficacité de la rétropropagation AP peut diminuer considérablement avec la distance dans les interneurones GABAergiques, et passez en mode xt.Avec les contrôleurs d’intensité laser, réglez le laser à deux photons à un niveau de puissance minimal où la fluorescence verte de base est à peine visible, pour éviter la phototoxicité. Ensuite, dans le logiciel d’acquisition de données d’électrophysiologie Clampex, créez un essai d’enregistrement de la durée souhaitée contenant une injection de courant somatique de l’amplitude souhaitée. Après cela, cliquez sur le bouton Démarrer l’enregistrement et acquérez la fluorescence en continu pendant une à deux secondes.Répétez l’acquisition d’images trois à 10 fois. Attendez au moins 30 secondes entre les balayages simples pour éviter les photodommages. Pour enregistrer les transitoires calciques dendritiques induits par la stimulation électrique, localisez une dendrite d’intérêt à l’aide du signal de fluorescence rouge.Placez la pipette stimulante sur la surface de la tranche au-dessus de la dendrite d’intérêt. Abaissez lentement la pipette de stimulation à 10 à 15 micromètres de la dendrite, en minimisant les mouvements pour ne pas perturber la configuration de l’ensemble de la cellule. Pour visualiser l’emplacement des microdomaines synaptiques dans les neurones aspiny, dans le logiciel d’acquisition d’images, passez en mode xt et positionnez la ligne le long de la branche dendritique d’intérêt.Dans la fenêtre Protocole, créez un essai d’enregistrement qui déclenche la stimulation. À l’aide du logiciel d’acquisition, balayez la dendrite en continu pendant une à deux secondes. Répétez l’acquisition trois à cinq fois, en attendant 30 secondes entre les numérisations pour éviter les photodommages.Pour obtenir des informations préliminaires sur la morphologie de la cellule et garder une trace de l’emplacement de la pipette de stimulation, acquérez une pile Z de la cellule dans le canal rouge. À l’aide du logiciel d’acquisition en mode xyz, définissez les limites supérieure et inférieure de la pile pour imager l’ensemble de la cellule avec tous les processus inclus. Ensuite, réglez la taille du pas à un micromètre et lancez l’acquisition de la pile à l’aide du bouton Démarrer l’enregistrement.Une fois l’acquisition de la pile Z terminée, utilisez l’option Projection maximale du logiciel pour superposer tous les plans focaux de la pile et vérifier la qualité de l’acquisition. Ensuite, rétractez lentement la pipette patch hors de la tranche. Pour fixer la tranche en vue d’une identification morphologique post-hoc, retirez rapidement la tranche du bain à l’aide d’un pinceau et placez-la entre deux papiers filtres dans une boîte de Pétri remplie d’ACSF.Remplacez l’ACSF par une solution de paraformaldéhyde à 4 % et laissez l’antenne à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Dans cette figure, la projection maximale d’une pile Z à deux photons montre un interneurone patché rempli d’Alexa-594. Des pointes de flèches blanches indiquent l’emplacement des terminaisons axonales dans la couche pyramidale, suggérant que l’interneurone est une cellule panier.Cette figure montre la branche dendritique près de laquelle l’électrode de stimulation était positionnée. La ligne pointillée indique l’emplacement du balayage linéaire. Les images ci-dessous illustrent le résultat d’un balayage linéaire dans les canaux rouge et vert.L’augmentation de la fluorescence verte au moment de la stimulation indique une augmentation de la concentration de calcium dans cette zone. Les images peuvent être regroupées en segments plus petits, ce qui permet d’analyser la propagation de la réponse. Les traces observées ici montrent les transitoires calciques induits dans différents segments en réponse à la stimulation électrique enregistrée au niveau somatique pendant l’essai d’imagerie.L’amplitude des transitoires calciques diminue avec la distance par rapport au point chaud central, ce qui indique que la réponse est localisée dans l’espace. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie à colorant sensible à la tension ou l’optogénétique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que des changements locaux dans le potentiel de mémoire au sein des branches dendritiques ou l’intégration d’entrées spécifiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller les fluctuations calciques dépendantes de l’activité dans les dendrites neuronales à l’aide d’une combinaison de techniques optophysiologiques, ce qui vous sera utile pour explorer les subtilités de l’intégration et de la plasticité des entrées dendritiques.

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Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution.

In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris

L'activité spontanée de développer des réseaux neuronaux peuvent être mesurées en utilisant AM-ester formes de colorants indicateurs sensibles au calcium. Modifications du calcium intracellulaire, indiquant l'activation neuronale, sont détectés comme des changements transitoires de la fluorescence indicateur avec un ou deux photons d'imagerie. Ce protocole peut être adapté pour une gamme de stade de développement qui dépendent des réseaux...

Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

Dans ce protocole, nous mettons à jour les progrès récents de l'imagerie...

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Une technique d'imagerie pour le suivi de l'évolution du potentiel de membrane avec une résolution spatiale sous-micrométrique et sub-milliseconde temporelle est décrit. La technique, basée sur une excitation laser de la tension de colorants sensibles, permet de mesurer des signaux dans les axones et les collatéraux axone, des branches dendritiques et terminaux individuels épines dendritiques.

Enregistrement colorant sensible à la tension d&#39;axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

Cette vidéo présente un protocole pour l’enregistrement par patch-clamp de cellules entières et l’imagerie calcique à deux photons dans des coupes d’hippocampe cérébral. Cette méthode permet d’étudier la dynamique des transitoires locaux Ca2+ (CaT) dans les dendrites de différents types neuronaux dans des coupes cérébrales aiguës.

Établissement d’une configuration de cellule entière pour l’imagerie calcique à deux photons de coupes de cerveau

Les procédures sont décrites pour effectuer des enregistrements simultanés du potentiel ou du courant de la membrane et des changements de concentration intracellulaire de calcium. Les neurones du noyau suprachiasmatique sont remplis de l’indicateur de calcium bis-fura-2 à l’aide d’une électrode de patch clamp dans la configuration de patch clamp de cellule entière.

Enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie calcique des neurones du noyau suprachiasmatique

L’imagerie en accéléré chez l’animal vivant fournit des informations précieuses sur la réorganisation structurelle du cerveau intact. Ici, nous introduisons une préparation de crâne aminci qui permet l’imagerie transcrânienne de structures synaptiques marquées par fluorescence dans le cortex de souris vivantes par microscopie à deux photons.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

Nous décrivons la combinaison de l'effet des UV focal photo-activation de composés neuro-actif avec la cellule entière de patch-clamp et de l'imagerie multi-photons de transitoires de sodium intracellulaire dans les dendrites et les épines de neurones de l'hippocampe dans les tranches de tissu aiguë du cerveau de la souris.

Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones

Ici, nous décrivons un protocole combinant l’injection de virus adéno-associés avec l’implantation de fenêtres crâniennes pour l’imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez la souris éveillée.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Découvrez l'imagerie biphotonique du calcium dans les dendrites neuronales en combinant patch-clamp et microscopie à deux photons sur des tranches de cerveau de souris. Cette méthode offre une résolution spatiotemporelle élevée pour observer l'intégration synaptique.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

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