Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

L’objectif global de cette expérience est d’étudier les élévations calciques dans les dendrites neuronales en réponse à différents paradigmes de stimulation en utilisant des enregistrements patch-clamp de cellules entières dans le soma neuronal en parallèle avec l’imagerie calcique à deux photons dans les dendrites. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller la signalisation calcique dans de petits compartiments dendritiques, permettant une observation étroite des processus qui se produisent dans les branches dendritiques lors de l’intégration des entrées synaptiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’observer les modèles de signalisation calcique avec une résolution et une spécificité spatio-temporelles élevées.

Placez le cerveau de la souris sur une boîte de Pétri contenant du saccharose ACSF froid et oxygéné en continu. Pour préparer des tranches d’hippocampe à partir du cerveau extrait, laissez le cerveau refroidir pendant environ deux minutes. Ensuite, placez un morceau de papier filtre sur une boîte de Pétri remplie de glace et transférez le cerveau sur le papier filtre.

Ensuite, disséquez le cerveau en deux hémisphères. Collez les hémisphères disséqués sur une plate-forme de sectionnement de vibratome et immergez-les dans le plateau de sectionnement rempli de saccharose ACSF oxygéné glacé. Par la suite, sectionnez des tranches de 300 micromètres d’épaisseur à un degré Celsius à l’aide d’un refroidisseur de vibratome ou en plaçant la glace autour du plateau de vibratome.

À l’aide d’un pinceau, transférez les tranches contenant l’hippocampe dans un bain de récupération ACSF oxygénée chauffé à 37 degrés Celsius. Dans cette étape, transférez une tranche d’hippocampe dans un bain sous l’objectif d’un microscope à deux photons à balayage laser. Perfuser continuellement le bain avec de l’ACSF-normal oxygéné.

Ensuite, utilisez la microscopie à contraste interférentiel différentiel infrarouge pour localiser une cellule d’intérêt en utilisant sa taille, sa forme et sa position. Après cela, remplissez une pipette stimulante avec une solution ACSF-normale contenant le fluorophore rouge. Abaissez-le sur le dessus de la tranche de manière à ce que la pointe se trouve dans la même région que la cellule d’intérêt.

Ensuite, remplissez la pipette patch avec la solution patch et fixez-la à l’étage de tête. Placez-le sur la tranche de manière à ce que sa pointe soit directement au-dessus de la cellule d’intérêt. Ensuite, insérez une seringue dans le robinet d’arrêt à trois voies et connectez-la à la pipette patch à travers un tube en plastique.

Injectez une pression positive constante dans la pipette patch et maintenez le robinet d’arrêt en position fermée. Ensuite, ouvrez le module logiciel de contrôle de l’amplificateur MultiClamp et passez en mode Voltage Clamp en cliquant sur le bouton VC. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données d’électrophysiologie Clampex pour l’enregistrement des signaux électrophysiologiques, puis cliquez sur l’icône de test de membrane pour envoyer une impulsion de tension carrée constante afin de surveiller les changements de résistance de la pipette.

Maintenant, abaissez la pipette patch jusqu’à ce qu’elle se trouve juste au-dessus de la cellule ciblée. En entrant en contact avec la membrane cellulaire, retirez la pression en tournant le robinet d’arrêt en position ouverte. Ensuite, appliquez une légère pression négative sur la pipette patch à l’aide d’une seringue vide insérée dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que la résistance de la pipette atteigne un gigaohm.

Dans la fenêtre Test de membrane du logiciel d’acquisition de données, fixez la cellule à moins 60 millivolts. Continuez à appliquer une pression négative jusqu’à ce que la résistance de la pipette diminue et que la configuration de l’ensemble de la cellule soit obtenue. Dans le module logiciel de contrôle de l’amplificateur MultiClamp, réglez la configuration du patch sur la pince de courant en cliquant sur le bouton IC, et enregistrez les propriétés de la membrane en réponse aux injections somatiques de courants hyperpolarisants et dépolarisants.

Attendez au moins 30 minutes que la cellule soit remplie avec les indicateurs présents dans la solution de patch. Pour acquérir des images, localisez une dendrite d’intérêt à l’aide du signal de fluorescence rouge. Assurez-vous d’une réponse visible en choisissant une dendrite proximale inférieure à 50 micromètres, car l’efficacité de la rétropropagation AP peut diminuer considérablement avec la distance dans les interneurones GABAergiques, et passez en mode xt.

Avec les contrôleurs d’intensité laser, réglez le laser à deux photons à un niveau de puissance minimal où la fluorescence verte de base est à peine visible, pour éviter la phototoxicité. Ensuite, dans le logiciel d’acquisition de données d’électrophysiologie Clampex, créez un essai d’enregistrement de la durée souhaitée contenant une injection de courant somatique de l’amplitude souhaitée. Après cela, cliquez sur le bouton Démarrer l’enregistrement et acquérez la fluorescence en continu pendant une à deux secondes.

Répétez l’acquisition d’images trois à 10 fois. Attendez au moins 30 secondes entre les balayages simples pour éviter les photodommages. Pour enregistrer les transitoires calciques dendritiques induits par la stimulation électrique, localisez une dendrite d’intérêt à l’aide du signal de fluorescence rouge.

Placez la pipette stimulante sur la surface de la tranche au-dessus de la dendrite d’intérêt. Abaissez lentement la pipette de stimulation à 10 à 15 micromètres de la dendrite, en minimisant les mouvements pour ne pas perturber la configuration de l’ensemble de la cellule. Pour visualiser l’emplacement des microdomaines synaptiques dans les neurones aspiny, dans le logiciel d’acquisition d’images, passez en mode xt et positionnez la ligne le long de la branche dendritique d’intérêt.

Dans la fenêtre Protocole, créez un essai d’enregistrement qui déclenche la stimulation. À l’aide du logiciel d’acquisition, balayez la dendrite en continu pendant une à deux secondes. Répétez l’acquisition trois à cinq fois, en attendant 30 secondes entre les numérisations pour éviter les photodommages.

Pour obtenir des informations préliminaires sur la morphologie de la cellule et garder une trace de l’emplacement de la pipette de stimulation, acquérez une pile Z de la cellule dans le canal rouge. À l’aide du logiciel d’acquisition en mode xyz, définissez les limites supérieure et inférieure de la pile pour imager l’ensemble de la cellule avec tous les processus inclus. Ensuite, réglez la taille du pas à un micromètre et lancez l’acquisition de la pile à l’aide du bouton Démarrer l’enregistrement.

Une fois l’acquisition de la pile Z terminée, utilisez l’option Projection maximale du logiciel pour superposer tous les plans focaux de la pile et vérifier la qualité de l’acquisition. Ensuite, rétractez lentement la pipette patch hors de la tranche. Pour fixer la tranche en vue d’une identification morphologique post-hoc, retirez rapidement la tranche du bain à l’aide d’un pinceau et placez-la entre deux papiers filtres dans une boîte de Pétri remplie d’ACSF.

Remplacez l’ACSF par une solution de paraformaldéhyde à 4 % et laissez l’antenne à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Dans cette figure, la projection maximale d’une pile Z à deux photons montre un interneurone patché rempli d’Alexa-594. Des pointes de flèches blanches indiquent l’emplacement des terminaisons axonales dans la couche pyramidale, suggérant que l’interneurone est une cellule panier.

Cette figure montre la branche dendritique près de laquelle l’électrode de stimulation était positionnée. La ligne pointillée indique l’emplacement du balayage linéaire. Les images ci-dessous illustrent le résultat d’un balayage linéaire dans les canaux rouge et vert.

L’augmentation de la fluorescence verte au moment de la stimulation indique une augmentation de la concentration de calcium dans cette zone. Les images peuvent être regroupées en segments plus petits, ce qui permet d’analyser la propagation de la réponse. Les traces observées ici montrent les transitoires calciques induits dans différents segments en réponse à la stimulation électrique enregistrée au niveau somatique pendant l’essai d’imagerie.

L’amplitude des transitoires calciques diminue avec la distance par rapport au point chaud central, ce qui indique que la réponse est localisée dans l’espace. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie à colorant sensible à la tension ou l’optogénétique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que des changements locaux dans le potentiel de mémoire au sein des branches dendritiques ou l’intégration d’entrées spécifiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller les fluctuations calciques dépendantes de l’activité dans les dendrites neuronales à l’aide d’une combinaison de techniques optophysiologiques, ce qui vous sera utile pour explorer les subtilités de l’intégration et de la plasticité des entrées dendritiques.