Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

L’objectif global de cette procédure est de disséquer et de colorer les ovaires nymphaux de la drosophile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement de la biologie, telles que celles relatives à la différenciation des cellules souches et au développement tissulaire chez l’organisme modèle drosophile. Le principal avantage de cette technique est que des outils personnalisables sont utilisés pour s’adapter à la petite taille et à la nature translucide des ovaires nymphaux, qui sont autrement difficiles à isoler.

Nous avons eu l’idée d’utiliser sa méthode lorsque nous avons mené des expériences sur le cours du temps, pour suivre la division des cellules souches dans l’ovaire pendant le développement de la drosophile nymphale. Pour commencer le protocole, combinez 10 mouches drosophiles adultes mâles et 15 femelles, dans un flacon de nourriture pour mouches riche normale complétée par de la levure. Laissez les œufs se développer en larves à température ambiante pendant trois à quatre jours.

Après trois à quatre jours, utilisez une brosse fine humide à poils doux pour faire un mouvement de roulement avec la brosse le long de la paroi du flacon, pour transférer les larves errantes du troisième stade, de la fiole à un puits en verre, rempli à ras bord de solution saline tamponnée au phosphate 1X ou PBS. Lavez les débris alimentaires des larves en les transférant dans un autre puits rempli de 1X PBS. Séparez les larves mâles et femelles à l’aide d’une pince.

Identifiez les larves mâles à l’aide d’une paire de gros testicules ronds et translucides intégrés dans le corps adipeux sur le côté latéral, aux deux tiers de son extrémité antérieure. Ensuite, récupérez au moins 10 femelles du puits et placez les larves femelles dans un puits séparé, rempli de 1X PBS. À l’aide d’une pince, transférez doucement les larves femelles dans un nouveau flacon de nourriture fraîche pour mouches complétée par de la levure.

Placez le flacon avec les larves femelles dans un endroit sombre pour faciliter la pupariation. Tout au long de la journée, surveillez les larves pour détecter la pupariation. Au fur et à mesure que chaque larve se lobalise et se développe en pré-nymphe, entourez la pré-nymphe contre la fiole et notez le moment approximatif où elle se forme pour la première fois en pré-nymphe.

Faites fondre l’extrémité en verre d’une pipette pester sur un bec Bunsen. Au fur et à mesure que le verre fond, utilisez une pince pour éloigner l’embout horizontalement du reste de la pipette afin de former un embout plus fin. Après refroidissement, cassez une petite partie de la pointe de la pipette pour former une ouverture circulaire nette.

Fixez une poire à l’autre extrémité de la pipette et chargez la pipette avec 1X PBS. Pour récolter les pupes collées à la paroi du flacon, appliquez une petite goutte d’eau le long de la zone de contact entre la chrysalide et le flacon. Après avoir laissé la colle protéinée se dissoudre pendant une à deux minutes, soulevez doucement la chrysalide du mur avec une brosse fine humide.

Transférer une seule nymphe par puits rempli de 1X PBS. Tout en saisissant l’extrémité postérieure de la chrysalide à l’aide d’une paire de pinces, déchirez soigneusement la partie antérieure de la nymphe avec une autre paire jusqu’à ce que la tête de la chrysalide soit visible. Saisissez l’extrémité la plus antérieure de la tête de la nymphe avec une pince et tirez doucement la chrysalide hors de sa boîte nymphale.

Ensuite, séparez et jetez la moitié antérieure de la chrysalide de la moitié postérieure jusqu’à ce qu’il ne reste que le sac abdominal. Saisissez le sac abdominal contre le fond du puits avec une pince dans une main, tout en tenant la fine pipette en verre remplie de 1X PBS dans une autre main. Dirigez la pointe fine de la pipette vers l’ouverture du sac et pipetez lentement 1X PBS dans l’abdomen pour éliminer les cellules graisseuses entourant les ovaires nymphaux.

Lavez les cellules du corps adipeux jusqu’à ce qu’au moins les deux tiers du corps adipeux aient disparu, ou jusqu’à ce que les ovaires soient visibles près de l’ouverture du sac abdominal. Si les ovaires ne sont pas visibles à l’intérieur du puits, ils auraient dû rester dans l’abdomen. Si les ovaires sont sortis, placez une nouvelle nymphe dans le puits et répétez cette étape.

Transférez l’abdomen dans une chambre en verre transparent remplie d’un tampon de fixation et placez le couvercle sur le dessus. Disséquez plus d’ovaires que nécessaire pour vous assurer qu’un nombre suffisant d’ovaires résisteraient au processus de coloration et de montage. Tout au long du processus de coloration, utilisez une pince pour enfoncer doucement les ovaires flottants au fond du puits en verre couvert afin de vous assurer que les ovaires sont complètement immergés dans la solution d’anticorps.

Placez des bandes de ruban adhésif double face sur la surface plane du nouveau titre, puis placez le verre de couverture chambré contenant les ovaires et le tampon de fixation sur la surface adhésive. Incuber les ovaires dans un tampon de fixation pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, rincez les ovaires trois fois avec 1X PBS avec 1 % de Triton X-100 ou 1 % de PBST pendant cinq, 10 et 45 minutes respectivement, pour permettre une perméabilisation complète.

Verrouillez les ovaires dans 10 % de sérum de chèvre normal dans 0,5 % de PBST pendant 30 minutes. Ensuite, incubez les ovaires pendant la nuit dans 600 microlitres d’anticorps primaires dans 0,5 % de PBST à 4 % Celsius. Le lendemain, rincez les ovaires trois fois pendant cinq minutes chacune avec 0,5 % de PBST.

Incuber les ovaires pendant deux heures dans 600 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans 0,5 % de PBST à température ambiante. Après l’incubation, rincez les ovaires deux fois pendant cinq minutes avec 0,5 % de PBST et une fois pendant cinq minutes avec 1 fois de PBS. Placez une petite goutte de 1X PBS sur une lame de microscope.

Utilisez une pince pour transférer le sac abdominal du verre de couverture chambré vers un verre bien rempli de 1x PBS. Déchirez le sac abdominal et tout corps adipeux restant avec une pince. Transférez les ovaires du puits dans une goutte de 1x PBS sur la lame de microscope en saisissant le centre des ovaires entre les pointes de la pince.

Ajoutez quelques gouttes de 1X PBS sur la lame lorsque la solution sèche. Une fois que tous les ovaires ont été disséqués et transférés sur la lame de microscope, pipetez 40 microlitres de milieu de montage sur une lamelle de 22 x 22 millimètres et placez doucement la lamelle sur les ovaires. Enfin, laissez la lame sécher pendant la nuit avant l’imagerie.

L’immunohistochimie spécifique à la prolifération cellulaire, telle que la coloration phospho-histone H3, peut être utilisée pour étudier les modèles de division cellulaire des cellules souches et d’autres types de cellules mitotiquement actives. Les cellules de tige de nymphe dérivées de cellules d’essaim peuvent être délimitées par coloration Fasciclin III. Lors de la tentative de cette procédure, il est préférable de récolter et de disséquer plus de PB que nécessaire pour l’expérience, étant donné que quelques ovaires peuvent être perdus pendant l’extraction du corps adipeux ou le processus d’immunohistochimie.

Merci d’avoir regardé et bonne chance pour l’expérience.