Détection très sensible et Quantitative des protéines et leurs isoformes par isoélectrofocalisation capillaire méthode

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche biomédicale, telles que la découverte de biomarqueurs, la découverte de médicaments, le diagnostic et le dépistage de médicaments ou d’anticorps. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est à haut débit et peut détecter les isoformes protéiques d’une manière hautement reproductible. Les implications de cette technique s’étendent vers le diagnostic de nombreuses maladies car elle peut mesurer les protéines affectées ou leurs isoformes.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des voies de signalisation cellulaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes où des protéines spécifiques doivent être analysées. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car les étapes d’essai sont difficiles à apprendre en raison des tours, tels que l’enlèvement des bulles, le chargement de la plaque, et cetera. Tout d’abord, préparer un mélange diluant échantillon en ajoutant un microlitre de mélange inhibiteur DMSO et deux microlitres d’inhibiteurs de la protéase à 47 microlitres de diluant échantillon, de sorte que la concentration finale de DMSO et inhibiteurs de la protéase est un X.Dilute protéines précédemment isolées lysates en utilisant le mélange diluant échantillon pour obtenir les concentrations désirées.

Ensuite, ajoutez 3.325 microlitres de l’échelle standard, six microlitres de l’inhibiteur de protéase, et trois microlitres de l’inhibiteur de DMSO à 137.675 microlitres du prémix d’antholite. Vortex l’échantillon au moins 15 secondes et garder sur la glace. Mélanger les deux solutions préparées dans un rapport un à trois de sorte que les concentrations finales d’inhibiteurs de la protéase DMSO et l’échelle standard de point isoélectrique sont un X et les protéines dans le capillaire atteignent les concentrations finales souhaitées.

Une fois que les protéines sont ajoutées au mélange de l’échantillon, toutes les étapes seront effectuées sur la glace ou à quatre degrés Celsius. Déposer une plaque de 384 puits sur la glace. Chargez dix microlitres du mélange d’échantillon dans le puits approprié de la plaque, selon la disposition de modèle d’essai conçue avec le logiciel automatisé de système occidental de ballonnement.

Par la suite, diluer les anticorps primaires et secondaires avec du diluant anticorps. Ensuite, pipette dix microlitres d’anticorps primaires et 15 microlitres d’anticorps secondaires dans chaque puits. Ensuite, mélanger le luminol et le peroxyde XDR dans un rapport un à un.

Pipette 15 microlitres du peroxyde de luminol se mélangent dans chaque puits. Une fois que les échantillons et les reagants ont été ajoutés à la plaque, centrifugeuse pendant dix minutes à 2500 fois G et quatre degrés Celsius pour faire tourner le liquide et enlever les bulles. Si des bulles existent encore, retirez-les manuellement à l’aide d’une fine pointe de pipette.

Ouvrez le logiciel automatisé du système de ballonnement occidental et cliquez sur new’from the file menu. Allez à la vitre de mise en page et assignez des emplacements pour les reagants et les échantillons dans la plaque de 384 puits. Faites une mission reaganiste en cliquant sur un puits n’importe où dans le bloc.

Sélectionnez un bloc de ligne de 12 puits chacun. Ensuite, rendez-vous à la barre d’outils de mise en page et insérez un bloc de ligne d’échantillon, primaire, secondaire ou luminol. Allez à la vitre du protocole et sélectionnez un emplacement reaganien dans la plaque.

Ensuite, cliquez sur la cellule dans la colonne de l’échantillon et sélectionnez le reagant dans le menu drop-down. De la même manière, sélectionnez les emplacements reagant pour le primaire, secondaire et luminol pour chaque cycle. Cliquez sur les cellules une à la fois dans la colonne d’anticorps primaire ou secondaire et modifiez les temps d’incubation si nécessaire.

Ensuite, ajoutez des cycles en cliquant sur l’Add’button dans la section protocole. Dans le volet modèle, entrez des informations relatives à l’échantillon, telles que l’identité des anticorps primaires et secondaires, leurs numéros de catalogue et leurs dilutions. Enregistrez le nouveau fichier d’analyse.

Avant de cliquer sur le bouton de démarrage, vérifiez rapidement la mise en page pour vous assurer que tout est correct. Maintenant, cliquez sur start’to commencer la course. Le logiciel incitera l’utilisateur à enlever les déchets, à remplir l’eau et la boîte capillaire, à ajouter de l’anolite et de la catholite au plateau de ressources, à ajouter un tampon de lavage et à charger la plaque dans le plateau d’échantillons refroidi.

Une barre d’état de l’instrument sera affichée sur l’écran de l’ordinateur quelques minutes après le début de la course. Cliquez sur l’écran summary’screen d’exécution pour voir l’état et les volets de séparation. Pour observer la séparation de l’électrophorèse dans un capillaire, jouez le film de séparation pour ce capillaire en cliquant sur le cycle désiré, puis en cliquant sur le bouton de lecture dans le panneau de commande.

Ouvrez le fichier d’exécuter et sélectionnez l’onglet écran d’analyse. Cliquez sur edit’puis analysis’to change the isoelectric point range. Appliquez la norme de point isoélectrique appropriée.

Ajoutez un ajustement de pointe, et ajoutez un nom de crête. Enfin, sélectionnez les données à utiliser dans l’onglet pics et exportez les données pour une analyse plus approfondie. L’électrophéogramme des kinases extracellulaires phosphorylatées de signal-réglé des lysates stimulés par facteur de croissance endothélial vasculaire est montré ici.

Il y a une induction très élevée des protéines phosphorylatées observées avec le facteur de croissance endothélial vasculaire. L’encart montre le contrôle de chargement endogène, HSP 70, indiquant une charge similaire d’échantillons pour les échantillons non traités et traités. Dans un immunoblot conventionnel, seulement deux bandes ont été détectées, même si les protéines extracellulaires phosphorylatées de kinase signal-réglées ont été résolues dans quatre crêtes par l’analyse isoélectrique capillaire de focalisation.

L’électrophéogramme des kinases filiculaires régulées par le signal des lysates stimulés par facteur de croissance endothélial vasculaire est montré ici. L’encart affiche le même contrôle de chargement utilisé en parallèle. Un immunoblot conventionnel ne montre que deux bandes correspondant à la kinase extracellulaire régulée par le signal une et à la kinase deux régulée par le signal extracellulaire.

Alors qu’avec la focalisation isoélectrique capillaire, les protéines de kinase régulées par le signal extracellulaire ont été résolues en six pics, correspondant aux quatre pics phosphorylatés différents et à deux pics non phosphorylatés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures, selon le nombre de cycles, si elle est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’employer des concentrations plus élevées d’anticorps par rapport aux immunoblots conventionnels.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’analyse sont difficiles à apprendre en raison de trucs, tels que l’élimination des bulles, le chargement de la plaque, et cetera. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir un test, préparer des échantillons, exécuter l’analyse, et d’analyser les données pour observer différents isoformes de votre protéine.