Mesure quantitative de la protéine précurseur de l’amyloïde véhiculée par γ-sécrétase et Notch clivage dans Cell-based Luciferase Reporter Assay plates-formes

L’objectif global de ce test quantitatif de gènes rapporteurs cellulaires pour la gamma-sécrétase est d’examiner l’effet différentiel des modulateurs présumés de la gamma-sécrétase sur le clivage médié par la gamma-sécrétase. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la maladie d’Alzheimer, telles que l’identification de nouveaux modulateurs de la gamma-sécrétase pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. L’avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un système de dosage très efficace et qu’elle permet d’identifier facilement les modulateurs de la gamma-sécrétase.

L’implication de cette technique s’étend au traitement de la maladie d’Alzheimer grâce à la découverte potentielle de médicaments anti-MA avec des effets secondaires minimes. Cette méthode peut donner un aperçu de la sélectivité du substrat de la gamma-sécrétase. Il peut également être appliqué à l’étude d’autres maladies, telles que le neuroblastome.

Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir du mal à retirer et à ajouter soigneusement des milieux de culture cellulaire à 96 microplaques, car trop de perturbations peuvent compliquer les résultats finaux. Commencez cette procédure par la préparation des cellules NG et CG, comme indiqué dans le protocole texte. Comptez les cellules NG ou CG à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, ensemencez les cellules à raison de 20 000 cellules par puits sur des microplaques de 96 puits à un volume final de 200 microlitres par puits dans un milieu de croissance. Transférez les microplaques dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après une nuit d’incubation, retirer 100 microlitres de milieu de croissance de chaque puits.

Ajouter 100 microlitres par puits de milieu de croissance contenant deux microgrammes par millilitre de tétracycline avec 0,2 % de diméthylsulfoxyde de sodium, deux micromolaires CL-387, 785, deux micromolaires DAPT ou d’autres inhibiteurs d’ErbB1/ErbB2 apparentés. Incuber les cellules et les microplaques traitées à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, prélever 150 microlitres par puits de milieu de croissance des microplaques.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres par puits de réactif de dosage de la luciférase. Ensuite, transférez les microplaques dans un lecteur de microplaques à luminescence et maintenez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Déterminez la luminescence émise par la luciférase à l’aide d’un programme prédéfini stocké dans le lecteur de microplaques de luminescence.

Tout d’abord, ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument. Ensuite, dans le menu Outil, sélectionnez Luminométrie. Sous le paramètre Paramètres, choisissez Aucun filtre pour le filtre d’émission, cochez Normal pour l’ouverture d’émission, entrez-en un pour compter le temps et cliquez sur OK pour configurer la lecture de luminescence.

Sous l’onglet Contrôle de l’instrument, faites défiler la liste des protocoles actifs et sélectionnez le protocole préenregistré pour la lecture de la luminescence. Sous l’onglet Affichage en direct, définissez l’échelle dans le menu déroulant et sélectionnez Logarithme ou Linéaire pour le type. Sous l’onglet Température, sélectionnez Désactivé pour le chauffage des plaques.

Enfin, cliquez sur le bouton Démarrer pour effectuer la lecture de la luminescence. Exportez les résultats dans un format de feuille de calcul à l’aide de l’explorateur intégré au logiciel de contrôle. Estimer la luminescence de fond des cellules CG ou NG traitées avec un milieu de croissance qui ne contient pas de tétracycline.

Définir un signal de luminescence émis par des cellules CG ou NG traitées avec 0,1 % de DMSO dans un milieu de croissance contenant un microgramme par millilitre de tétracycline seule comme activité gamma-sécrétase relative de 100 %. Enfin, normalisez les signaux de luciférase des cellules CG ou NG cultivées avec un milieu de croissance contenant de la tétracycline et du CL-387, 785 ou DAPT au signal de luciférase émis par les cellules CG ou NG traitées au DMSO. On voit ici des résultats représentatifs démontrant les mesures quantitatives du clivage de la gamma-sécrétase d’APP-C99 dans les cellules CG.

Les cellules ont été traitées avec une micromolaire de CL-387, 785 ou DAPT en présence d’un microgramme par millilitre de tétracycline à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. La luminescence dérivée de la protéolyse médiée par la gamma-sécrétase de C99-GV a été quantifiée après l’ajout de 100 microlitres par puits de réactif de dosage de la luciférase. Le signal de luciférase émis par les cellules traitées avec le véhicule seul a été fixé à 100 % de luminescence relative.

Des résultats représentatifs démontrant les mesures quantitatives du clivage de la gamma-sécrétase de N-delta-E dans les cellules NG sont présentés ici. De même, les cellules ont été traitées avec une micromolaire de CL-387, 785 ou DAPT en présence d’un microgramme par millilitre de tétracycline à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. La luminescence dérivée de la protéolyse médiée par la gamma-sécrétase de N-delta-E-GV a été quantifiée après l’ajout de 100 microlitres par puits de réactif de dosage de la luciférase.

Le signal de luciférase émis par les cellules traitées avec le véhicule seul a été fixé à 100 % de luminescence relative. Une fois maîtrisée, cette technique ne nécessite qu’un temps de manipulation d’une à deux heures, en fonction du nombre de composés à examiner. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie au chercheur dans le domaine de la maladie d’Alzheimer pour explorer les modificateurs génétiques et chimiques de la gamma-sécrétase à la recherche de nouvelles thérapies pour la maladie d’Alzheimer.