Détection et Quantification de Plasmodium falciparum dans aqueux globules rouges par atténuée totale réflexion spectroscopie infrarouge et analyse de données

L’objectif global de cette procédure est de construire un modèle de régression pour la prédiction de la parasitémie du paludisme à l’aide de la spectroscopie ATR-FTIR avec analyse multivariée des données. Cette méthode peut aider à accélérer les diagnostics au point de service qui peuvent aider à améliorer les résultats pour les patients à l’avenir. Le principal avantage de cette technique est que si le modèle peut prendre un certain temps à construire, il est très portable, convivial, très sensible et peu coûteux.

Bien que cette méthode permette la quantification des parasites du paludisme, elle peut également être utilisée pour observer la réponse phénotypique aux changements environnementaux tels que les changements dans la composition des parasites dus aux agents antimicrobiens. L’idée est né des travaux que nous avons fait au Synchrotron australien sur les cellules infectées par le paludisme. C’était au niveau d’une seule cellule.

À partir de là, nous avons décidé d’utiliser la spectroscopie ATR-FTIR pour développer le test diagnostique. Avant de commencer la procédure de synchronisation, la culture 30 millilitres de 3D7 souche Plasmodium falciparum parasites tels que décrits dans le protocole de texte. À l’aide d’une pipette automatisée, resuspendez la culture et transférez-la dans un tube conique de 50 millilitres.

Centrifuger la culture à 300 à 400 fois g dans des conditions de laboratoire standard pendant cinq minutes. Retirez le surnatant en le dessinant avec une pipette automatisée sans déranger la pastille. Jetez les déchets dans une solution de 10% d’eau de Javel.

Ajouter lentement 12 à 15 millilitres d’une solution sorbitol de 4% à la pastille et mélanger la culture en plafonnant et en inversant le tube jusqu’à ce que la culture soit homogène. Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, centrifuger la culture pendant cinq minutes.

Utilisez une pipette automatisée pour enlever le supernatant sans déranger la pastille. Ajouter 10 à 15 millilitres de 0,9% salin à la pastille et mélanger la solution en plafonnant et en inversant le tube jusqu’à ce que la culture soit homogène. Répétez la centrifugation et la solution saline laver deux fois de plus pour enlever tous les restes de sorbitol.

Pour commencer cette procédure, centrifugez les globules rouges de stock, ou RBCs. Retirez le supernatant et lavez avec 0,9% salin un total de trois fois. Centrifuger les RBCs stock et la culture à 300 à 400 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant de chaque tube.

Étiquetez huit tubes de microcentrifugeuse comme indiqué. Ensuite, utilisez une pipette de 0,2 à 20 microlitres pour ajouter la quantité appropriée de culture à chaque tube. Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de RBCs de stock à chaque tube pour obtenir la dilution souhaitée de parasitemia.

Centrifugeuse le sang frais du donneur recueilli dans des tubes anticoagulants à 1200 fois g et les conditions de laboratoire standard pendant 10 minutes. Retirez le plasma en le dessinant avec une pipette et en le jetant dans une solution de 10% d’eau de Javel. Ajouter 900 microlitres de rbcs donneurs isolés dans chaque tube de microcentrifugeuse et bien mélanger en inversant 10 fois.

Un simple spectromètre Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared, ou ATR-FTIR spectromètre sera utilisé pour acquérir le spectre. Préparer et nettoyer le cristal à l’aide de lingettes sans peluche amorties avec de l’eau ultra-pure pour frotter doucement le cristal dans un mouvement circulaire. Ensuite, utilisez un autre lingette sans peluche pour bien sécher le cristal.

Prenez une mesure d’arrière-plan de l’air en cliquant sur Mesure d’arrière-plan. Toutes les 20 minutes, nettoyez le cristal et répétez cette mesure. Ouvrez la vue en direct en cliquant sur Aperçu.

Observez une ligne de base horizontale plate qui indique que le cristal est propre. Pipette 10 microlitres d’eau déionisée directement sur le milieu du cristal et cliquez sur Mesurer l’échantillon. Séchez le cristal à l’aide d’un lingette sans peluche et d’un léger mouvement circulaire.

Pipette 10 microlitres d’échantillon sur le milieu du cristal et cliquez sur Mesurer l’échantillon. Nettoyez le cristal entre les échantillons. Dans cette démonstration, une analyse multivariable des données sera effectuée à l’aide de MATLAB.

Pour commencer le traitement des données, entrez l’analyse dans la fenêtre de commande pour ouvrir l’interface utilisateur graphique. Cliquez à droite sur la boîte X pour trouver des données d’importation. Sélectionnez le type de fichier à analyser.

Importez l’échantillon, l’eau et les spectres de base comme ensembles de données dans le lieu de travail en sélectionnant tous les spectres de chaque ensemble séparément, en cliquant sur Open et en donnant à chaque ensemble un nom court. Cliquez sur Nouvelle Variable dans la fenêtre de commande et donnez au vecteur le nom Parasitemia. Entrez la Parasitemia de chaque échantillon.

Cliquez à droite sur la boîte X pour trouver des données de parcelle. Cliquez sur l’icône Plot Data pour tracer les données. Inspectez les spectres pour les effets de vapeur d’eau en cliquant sur Zoom et en zoomant sur 1 800 à 1 400 par centimètre, les plus clairement observés comme des sommets courts, tranchants et étroits le long des pentes des bandes Amide I et Amide II.

En cas de vapeur d’eau extrême, ouvrez l’onglet Modifier les données de prétraitement et sélectionnez Lissage. Réduisez le bruit et/ou les fortes contributions de vapeur d’eau en lissant l’échantillon et les spectres d’eau. Après un traitement supplémentaire des données tel que décrit dans le protocole texte, ouvrez l’onglet Modifier les données et, dans les variables de colonne, sélectionnez 2980 à 2800 par centimètre et 1750 à 850 par centimètre en vous assurant que seules leurs cases sont cochées.

Les données sont maintenant prêtes à être analyses. Pour effectuer l’analyse des composants principaux, ou PCA, cliquez sur Décomposition de l’analyse et sélectionnez PCA. Cliquez sur Construire le modèle.

Observez la limite de confiance de 95%, l’anneau pointillé, sur l’intrigue des scores entre PC 1 et PC 2. Utilisez l’outil Sélectionnez Spectra pour marquer les spectres de l’échantillon avec des scores qui se produisent en dehors de la limite comme valeurs aberrantes potentielles. Pour effectuer la régression partielle des moins carrés, ou PLSR, cliquez sur Régression d’analyse et sélectionnez PLSR.

Cliquez à droite sur le bloc Y et sélectionnez le modèle de génération parasitemia vectoriel. Analyser le modèle de régression et le vecteur de régression et identifier les bandes biologiques. Une parcelle partielle de régression des moins carrés de RBCs a grimpé entre zéro et un pour cent Parasitemia généré une valeur R-carré de 0,87 et une racine moyenne carrée erreur de validation croisée de 0,13%Parasitemia.

Cela démontre la capacité du modèle à prédire la parasitémie dans chaque échantillon avec la parasitemia connue sur l’axe x et la parasitemia prévue sur l’axe Y. Le coefficient de régression associé décrit la contribution de chaque bande à la capacité prédictive du modèle. Plus la bande est intense, plus elle contribue au modèle et, par conséquent, à la façon dont le parasite modifie la composition chimique du sang.

Les résultats montrent que le signal des parasites est suffisamment distinct des RBC pour qu’ils puissent être utilisés pour former un modèle de régression linéaire pour la prédiction des parasites dans les ensembles de données futurs. Une fois maîtrisée, cette technique peut prendre moins de trois minutes par échantillon si elle est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de nettoyer les cristaux ATR de tous les résidus.

À la suite de cette procédure, d’autres espèces de paludisme telles que P vivax et P malariae peuvent être modélisées afin de répondre à de telles questions, comme la spectroscopie ATR-FTIR est-elle suffisamment sensible pour faire la distinction entre les espèces? Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biospectroscopie pour explorer la détection et la quantification d’autres agents pathogènes transmissibles par le sang et même analyser dans le sang comme le glucose et l’urée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la spectroscopie ATR-FTIR et l’analyse NVDA pour construire un modèle de régression.

N’oubliez pas que le travail avec le sang des patients et les échantillons de paludisme peut être dangereux, et une formation et un confinement appropriés au niveau de biosécurité doivent toujours être effectués lorsque vous essayez cette procédure.