Name: Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e lanalisi multivariata dei dati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Impara a rilevare e quantificare Plasmodium falciparum in globuli rossi usando spettroscopia ATR-FTIR e analisi multivariata. Questo metodo rapido e a basso costo migliora la diagnostica point-of-care della malaria.

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Finanziamenti agli autori è stato fornito dall'Australian Research Council (futuro Fellowship FT120100926 a BRW), National Health and Medical Research Council of Australia (programma grant e Senior Research Fellowship di JGB; Inizio carriera Fellowships JSR; Infrastruttura per la ricerca istituti Grant Scheme supporto all'Istituto Burnet), e supporta l'infrastruttura operativa del governo di Victorian State Grant all'Istituto di Burnet. Riconosciamo il signor Finlay Shanks per sostegno strumentale.

Consultare appropriato Material Safety Data Sheets (MSDS) e cercare la formazione adeguata di livello 2 di biosicurezza (BSL-2). Tutti i passaggi di coltura devono essere fatto in un cabinet di BSL-2 usando una tecnica asettica, il che significa che c'è un rischio di esposizione a radiazioni UV nocive da operazioni di decontaminazione, punture accidentali ed esposizione potenziale biologico e infezione se la cultura di parassita entra tutte le lesioni. Inoltre, è un potenziale rischio sangue stock da banche del sangue è solo proiettato per alcune malattie e il potenziale per la diffusione di malattie a carico del sangue. Cercare aiuto medico immediato nell'avvenimento della lesione.
1. preparazione e misurazione dei 3 7 serie di diluizioni del parassita Plasmodium falciparum
Nota: Plasmodium SP. cultura è altamente sensibile. Usare i reagenti freschi/scaduto e nutrire i parassiti regolarmente modificando il supporto. Nutrire le colture sotto 5% parassitemia ogni secondo giorno; nutrire le colture tra 6-10% parassitemia una o due volte al giorno; e nutrire le colture tra 11 – 20% fino a 4 volte al giorno. Parassiti che stanno cominciando a morire di fame si perdono la loro forma e inizia a contrarsi. In tal caso, mangimi e diluire immediatamente cambiando i media e aggiungendo brodo di RBCs. raccogliere il sangue del donatore in provette contenenti eparina come anticoagulante e misura entro le prime 6 ore.
<ol><li>Cultura un totale di 30 mL di 3 7 ceppo parassiti Plasmodium falciparum secondo il protocollo standard fino a quando la parassitemia raggiunge 10% anelli.</li>
	<li>
Sincronizzazione dei parassiti
	<ol>
<li>11 h dopo shizogeny nel ciclo di vita del parassita, Risospendere la cultura e il trasferimento in una provetta conica 50 mL utilizzando una pipetta automatica.</li>
		<li>Centrifugare la coltura a 300-400 x g e a condizioni di laboratorio standard (25° C e 100 kPa) per 5 min.</li>
		<li>Eliminare il surnatante tramite elaborazione dello stesso con una pipetta o usando una pipetta di Pasteur attaccata ad un vuoto senza disturbare il pellet. Gettare il terreno dei rifiuti in una soluzione di candeggina al 10%.</li>
		<li>Lentamente aggiungere 12 – 15 mL di soluzione al 4% sorbitolo al pellet utilizzando una pipetta automatica e mescolare la cultura tappatura ed invertendo il tubo fino a quando la cultura è omogenea.</li>
		<li>Incubare la coltura a 37 ° C per 15 min.</li>
		<li>Centrifugare la coltura a 300-400 x g e le condizioni standard di laboratorio per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante come descritto al punto 1.2.3.</li>
		<li>Aggiungere 10 – 15 mL di soluzione fisiologica 0,9% al pellet e miscelare la soluzione di tappatura e invertendo il tubo fino a quando la cultura è omogenea.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.2.6–1.2.8 altre due volte per lavare tutti i resti di sorbitolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della parassitemia diluizione serie
	<ol>
<li>Lavare Stock in RBCs come in passaggi 1.2.6–1.2.9.</li>
		<li>Centrifugare la coltura in condizioni standard di laboratorio, Stock in RBCs a 300-400 x g per 5 min ed eliminare il surnatante come descritto al punto 1.2.3.</li>
		<li>Etichetta per microcentrifuga come 0%, 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0.250%, 0.750% e 1.000% e aggiungere 0 µ l, 1 µ l, 2,5 µ l, 7,5 µ l, 10 µ l, 25 µ l, 75 µ l e 100 µ l di cultura rispettivamente usando una pipetta di 0,2-20 µ l.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l, µ l 99, 97,5 µ l, µ l 92,5, 80 µ l, 75 µ l, 0 e 25 µ l di Stock in RBCs al tubi etichettati 0%, 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0.250%, 0.750% e 1.000%, rispettivamente.</li>
		<li>Centrifugare il sangue del donatore freschi raccolto in provette dell'anticoagulante a 1.200 x g e condizioni standard di laboratorio per 10 min.</li>
		<li>Rimuovere il plasma di elaborazione dello stesso con una pipetta e scartando come descritto al punto 1.2.3.</li>
		<li>Aggiungere 900 µ l di RBCs isolato in ciascuna provetta per microcentrifuga e miscelare accuratamente capovolgendo 10x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisizione spettrale
	<ol>
<li>Utilizzando il programma di acquisizione spettrale accompagnamento, fare clic su "Strumento set-up" e impostare i parametri di raccolta di dati seguenti: 128 scansioni per sfondo; 32 scansioni per il campione; e risoluzione a 8/cm sopra la gamma di frequenza di campionamento massima dello strumento.</li>
		<li>Impostare la temperatura dello spettrometro FTIR-ATR per la raccomandazione del produttore o durante la notte.</li>
		<li>Pulire il cristallo di strofinare delicatamente con un movimento circolare utilizzando lanugine gratis salviette inumidito con acqua ultrapura. Quindi asciugare con un altro panno libero wipe.</li>
		<li>Prendere una misura di sfondo dell'aria facendo clic su "Sfondo misura". Ogni 20 min, pulire il cristallo come descritto al punto 1.4.3 e ripetere la misurazione.</li>
		<li>Aprire la visualizzazione live facendo clic su "Anteprima". Osservare una linea di base piana, orizzontale che indica che il cristallo sia pulito.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l di acqua deionizzata direttamente sul mezzo del cristallo e fare clic su "Esempio di misura". Ripetere questa misurazione di acqua dopo ogni campione quinto.</li>
		<li>Asciugare il cristallo usando un panno libero wipe e un delicato movimento circolare.</li>
		<li>Pipettare 10 µ l di campione e fare clic su "Esempio di misura".</li>
		<li>Pulire il cristallo tra i campioni come descritto al punto 1.4.3.</li>
		<li>Ripetere fino a 3 replicati vengono acquisiti, assicurandosi di randomizzare l'ordine di entrambi i campioni e le repliche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. multivariata analisi (MVDA)
Nota: Trattamento dei dati deve essere fatto sopra l'intero set di dati al fine di evitare il rumore e l'aggiunta di cime di origine non biologica. Al contrario, analizzare sopra le regioni biologicamente rilevanti: 2980-2800/cm e 1750-850/cm.
<ol><li>
Trattamento dei dati Nota: Due software, ad esempio, Matlab (d'ora in poi denominati software 1) e il riordinatore X (d'ora in poi denominati software 2) sono utilizzati come esempi per MVDA. Software 1 ha la capacità di eseguire MVDA senza l'aggiunta di un'interfaccia utente grafica (GUI). Tuttavia, è consigliabile acquistare una GUI (Tabella materiali). Le seguenti istruzioni quando riferendosi al software 1 presupporrà che è in congiunzione con il toolbox di GUI disponibile in commercio, e lo script di trattamento di dati di esempio è stato allegato.<ol>
<li>Aprire il software di analisi di dati multivariati appropriato, fare clic su "Importa dati" e selezionare il tipo di file per l'analisi.<ol>
<li>Nel software 1, ingresso "Analisi" nella finestra di comando per aprire l'interfaccia grafica. Fare clic destro la X box per trovare "Importa dati".</li>
			<li>Nel software 2, fare clic sulla scheda "File" per trovare "Importazione".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Importare gli spettri del campione, acqua e linea di base come insiemi di dati nello spazio di lavoro selezionando tutti gli spettri in ogni set separatamente e facendo clic su "Apri" e dare ogni set un nome breve, ad esempio, 'wat' per set di dati di spettri di acqua.</li>
		<li>Selezionare nuova tabella o matrice facendo clic su "nuovo Matrix/Vector" e generare un vettore di n × 1, dove n è il numero di campioni. La parassitemia di ogni campione di input e dare il vettore il nome 'Parassitemia'.<ol>
<li>Nel software 1, fare clic su "Nuova variabile" nella finestra di comando.</li>
			<li>Nel software 2, fare clic sull'icona "Nuova matrice".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tracciare i dati facendo clic su "Stampa dati icona". Ispezionare gli spettri per gli effetti del vapore acqueo facendo clic su "Zoom" e zoomando su 1800-1400/cm; più chiaramente osservato come breve, tagliente, stretti picchi lungo le pendici del ammide io e ammide Band II.</li>
		<li>In casi di estrema vapor d'acqua, aprire la scheda Modifica/pre-process dati e selezionare "Smoothing". Ridurre il rumore e/o contributi di forte vapore acqueo lisciando gli spettri del campione e acqua utilizzando fino a 25 punti di lisciatura o utilizzare un metodo di correzione di vapore acqueo.</li>
		<li>Corretta rispetto al basale non orizzontali utilizzando l'algoritmo di correzione della linea di base, se del caso, la stessa scheda di dati di modifica/pre-process nel passaggio 2.1.4.</li>
		<li>Media acqua spettri e copiare le righe in una matrice di n × m equivalente al set di dati campione e ridurlo al 70% intensità moltiplicandolo per 0,7.<ol>
<li>Nel software 1, farlo nella finestra di comando inserendo il seguente script "AverageWater=mean(WaterDataset)". Quindi copiare e incollare le righe per corrispondere al set di dati di esempio. Per ridurre l'intensità, di input "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sottrarre acqua medio spettri da ogni spettro campione.<ol>
<li>Nel software 1, farlo nella finestra di comando inserendo il seguente script "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aprire la scheda Modifica/pre-process dati per applicare una seconda funzione derivative e quindi normalizzare i dati selezionando la funzione di singola variabile normale (SNV) e significa centro dati.<ol>
<li>Nel software 1, è possibile farlo in una sola volta. In primo luogo selezionare "Derivato" e ingresso 25 punti di lisciatura, ordine polinomiale di 3 e derivati ordine sul campione impostato utilizzando una funzione Savitzky Golay e 25 punti di lisciatura. Quindi selezionare "SNV" e "Media Center". Fare clic su "OK/applicare".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aprire la scheda di dati di modifica/pre-process e nella colonna "variabili", selezionare 2.980 – 2.800/cm e 1.750 – 850/cm assicurandosi che siano selezionate solo le caselle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati
	<ol>
<li>Analisi delle componenti principali (PCA)<ol>
<li>Fare clic su "analisi | Decomposizione"e seleziona PCA.<ol>
<li>Nel software 1, cliccare su "Build Model".</li>
				<li>Nel software 2, il PCA metodi di input. Immettere il numero ottimo di componenti principali (PC) - in questo lavoro, 7 - e un massimo di 100 iterazioni e seleziona Convalida incrociata per il metodo di convalida. Fare clic su "Esegui".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Osservare il limite di confidenza del 95%, l'anello tratteggiata, la trama di punteggi tra PC1 e PC2.</li>
			<li>Contrassegnare gli spettri del campione con i punteggi che si verificano di fuori del limite come potenziali outlier utilizzando lo "strumento di spettri seleziona".</li>
			<li>Se gli spettri contrassegnati hanno alti valori di2 Hotellings T e alta Q residui escludono da ulteriori analisi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Regressione di minimi quadrati parziali (PLS-R)<ol>
<li>Fare clic su "analisi | Regressione"e selezionare"PLS-R".<ol>
<li>Nel software 1, fare clic destro Y blocco e selezionare il vettore "parassitemia | Costruire il modello".</li>
				<li>Nel software 2, i PLS-R metodi di input. Selezionare il vettore "Parassitemia" come il "riferimento Y" e il set di dati del campione come "insieme di dati X" e seleziona Convalida incrociata come il metodo di convalida. Fare clic su "Esegui".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Analizzare il modello di regressione. R2 valori sopra 0,80 ed errore quadratico medio dei valori di cross-validazione (RMSECV) che sono meno di 0.1% parassitemia sono modelli accettabili.</li>
			<li>Il vettore di regressione di analizzare e individuare le bande biologiche.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2016/report/en/">World Malaria Report 2016</a>. , (2016).</li>
<li>Rogers, W. Chapter 105. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRogers%2C+W+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).</li>
<li>White, N. J. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+NJ+%22Manson%27s+Tropical+Infectious+Diseases%22">Manson's Tropical Infectious Diseases</a>. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).</li>
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<li>Hanscheid, T., Grobusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+useful+is+PCR+in+the+diagnosis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">How useful is PCR in the diagnosis of malaria.</a> Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).</li>
<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
<li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Malaria+Rapid+Diagnostic+Test+Performance%3A+results+of+WHO+product+testing+of+malaria+RDTs%3A+round+6+%282014-2015%29%22">Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015)</a>. , (2014).</li>
<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Modello: PLS-R è un metodo multivariato supervisione che trova una relazione lineare, Y = bX + E, tra le variabili predittive X (qui, l'assorbanza a ciascun numero d'onda) e un continuo variabile Y (qui, il livello di parassitemia). In breve, il modello combina le variabili in X per creare un nuovo insieme di variabili latenti (LVs) che catturano la varianza su X correlato con Y e calcola un vettore di regressione (b) che moltiplicato per un nuovo risultati di spettro nella stima del valore y. La forza del modello può es...

La malaria è tra le più devastanti malattie del nostro tempo; oltre la metà della popolazione vive a rischio nelle regioni endemiche ed esso sproporzionatamente opprime il povero1,2,3,4. Gran parte del problema è i portatori asintomatici e primi pazienti di stadio che fungono da serbatoi per zanzare vettori5, causando picchi di infezione durante stagioni umide e permettendogli di persistere nelle comunità. La malaria è causata da parassiti Plasmodium cinque, il più mortale di cui è p. falciparum che causa la forma più grave della malattia2.
Attualmente, le tecniche per la diagnosi di malaria sono meno che perfetto. Microscopia ottica, il gold standard attuale, è in grado di rilevare solo 62-88 parassiti / µ l a seconda del metodo utilizzato6. Inoltre, a causa della intensità e alta abilità richiesto, in molte regioni microscopia mal diagnostica > 50% dei casi, soprattutto quelli con bassa parassitemia livelli2, che possono essere direttamente attribuiti alla mancanza di risorse nella zona e risultati in l'uso improprio di farmaci anti-malarici. Gli altri 2 metodi diagnostici principali sono test diagnostici rapidi (RDT), che utilizzano gli anticorpi per la rilevazione e l'analisi di reazione a catena della polimerasi (PCR), che discriminano e quantificare i parassiti dal DNA. Attualmente, RDTs sono solo in grado di rilevare p. falciparum e p. vivax di almeno 100 parassiti / µ l di sangue con conseguente forme più rare della malattia non viene trattata. 7 , 8 al contrario, analisi di PCR discriminare e quantificare le diverse specie di Plasmodium ad una sensibilità di 0,0004-5 parassiti / µ l di sangue. Tuttavia, esso richiede costosi reagenti, equipaggiamento e abilità tecnica e pertanto non è adatto per l'applicazione del campo.
Una tecnica altamente sensibile, affidabile e conveniente è essenziale per migliorare i tempi di diagnosi e così migliorando i risultati pazienti e rendendo possibile l'eliminazione della malattia. Attenuato totale riflessione spettroscopia trasformata di Fourier (ATR-FTIR) offre una possibile soluzione a questo problema. Il lavoro precedente ha indicato che era possibile rilevare e quantificare da p. falciparum in metanolo fissata pellicole di anima raggiungendo i limiti di rilevazione di < 1 parassita / µ l di sangue (< 0,0002% parassitemia)9, che è paragonabile ai metodi PCR. Studi recenti hanno dimostrato che è possibile rilevare e quantificare i parassiti in campioni acquosi e quindi eliminare il punto di fissazione. Tuttavia, fattori come il vapore acqueo, rumore spettrale e trattamento dei dati devono essere presi in considerazione per un risultato ottimale10.
Questo protocollo si propone di mostrare nuovi utenti come acquisire spettri ATR-FTIR e preparare un modello di regressione per il rilevamento di p. falciparum da acquose di campioni di globuli rossi (RBC)10.

<table><tbody><tr><td>Sangue del donatore</td><td>-</td><td>-</td><td>Deve essere raccolto da un medico qualificato</td></tr><tr><td>Sangue di riserva</td><td>Croce Rossa Australiana'</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>The Burnet</td> <td>Institute-Laboratory</td> <td>ceppo selvaggio equivalente</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media con L-hepes senza bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>Aliquotare in provette da 50 mL e conservare in congelatore</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Deve essere filtrato prima dell'uso in coltura</td></tr><tr><td>Provette per la raccolta del sangue (Vacutainers)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura da 50 mL</td><td>Puntali per pipette Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25mL</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette da 10mL</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore automatizzato</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R Centrifuga</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 Incubatori a CO2 a calore diretto</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 Microscopio binoculare</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>Al momento dell'acquisto assicurarsi che la lente 100x sia un olio lente a immersione</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td><td>Assicurati di richiedere l'attacco "Eco-ATR" al momento dell'acquisto</td></tr> del <tr><td>software di analisi dati multivariato</td><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td></tr><tr><td>The Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>Software di analisi dati multivariato</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>GUI per Matlab</td></tr></tbody></table>

rilevazione e quantificazione del plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Dimostriamo un metodo di quantificazione e individuazione di parassiti in acquosa di globuli rossi (RBCs) utilizzando un semplice benchtop attenuato totale riflessione Fourier Transform spettrometro a infrarossi (ATR-FTIR) in combinazione con l'analisi multivariata dei dati ( MVDA). 3 7 p. falciparum sono stati coltivati a parassiti fase 10% parassitemia anello e utilizzato a picco i globuli rossi del donatore fresco isolato per creare una diluizione serie tra 0 – 1%. 10 µ l di ciascun campione sono stati collocati al centro della finestra di diamante ATR per acquisire lo spettro. I dati di esempio è stati trattati per migliorare il rapporto segnale-rumore e rimuovere il contributo di acqua, e quindi la derivata seconda è stata applicata per risolvere caratteristiche spettrali. I dati sono stati quindi analizzati utilizzando due tipi di MVDA: primo Principal Component Analysis (PCA) per determinare eventuali valori anomali e quindi regressione di minimi quadrati parziali (PLS-R) per compilare il modello di quantificazione.

Trama di minimi quadrati parziali (PLS-R) e un vettore di regressione associato, Figura 1a e 1b rispettivamente, mostrano che il segnale da parassiti sono abbastanza distinta da globuli rossi che servono per formare una regressione lineare modello da utilizzare per la previsione dei parassiti in insiemi di dati futuri.
Un robusto modello lineare PLS-R è stato generato con un valore ...

Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione del Plasmodium falciparum in acquosi globuli rossi infetti utilizzando un spettrometro a infrarossi riflessione totale attenuata e analisi multivariata dei dati.

Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un modello di regressione per la previsione della parasitemia della malaria utilizzando la spettroscopia ATR-FTIR con analisi dei dati multivariata. Questo metodo può aiutare ad accelerare la diagnostica del punto di cura che può aiutare a migliorare i risultati dei pazienti in futuro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che mentre il modello può richiedere del tempo per essere costruito, è altamente portatile, intuitivo, altamente sensibile e a basso costo.Sebbene questo metodo consenta la quantificazione dei parassiti della malaria, può anche essere utilizzato per osservare la risposta fenotipico ai cambiamenti ambientali come i cambiamenti nella composizione dei parassiti dovuti ad agenti antimicrobici. L'idea è nata dal lavoro che abbiamo fatto al sincrotrone australiano sulle cellule infettate dalla malaria. Questo era a livello di cella singola.Da lì, abbiamo deciso di utilizzare la spettroscopia ATR-FTIR per sviluppare effettivamente il test diagnostico. Prima di iniziare la procedura di sincronizzazione, coltura 30 millilitri di 3D7 ceppo Plasmodium falciparum parassiti come descritto nel protocollo di testo. Utilizzando una pipetta automatizzata, resuspend la coltura e trasferirla in un tubo conico da 50 millilitri.Centrifugare la coltura da 300 a 400 volte g in condizioni di laboratorio standard per cinque minuti. Rimuovere il supernatante disegnarlo con una pipetta automatizzata senza disturbare il pellet. Scartare i supporti di scarto in una soluzione di candeggina al 10%.Aggiungere lentamente 12-15 millilitri di una soluzione di sorbitolo al 4% al pellet e mescolare la coltura tappando e invertendo il tubo fino a quando la coltura non è omogenea. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, centrifuga la coltura per cinque minuti.Utilizzare una pipetta automatizzata per rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Aggiungere da 10 a 15 millilitri dello 0,9% di soluzione salina al pellet e mescolare la soluzione tappando e invertendo il tubo fino a quando la coltura non è omogenea. Ripetere la centrifugazione e la soluzione salina lavare altre due volte per rimuovere tutti i resti di sorbitolo.Per iniziare questa procedura, centrifugare i globuli rossi stock o RBC. Rimuovere il supernatante e lavare con lo 0,9% di soluzione salina per un totale di tre volte. Centrifugare gli RBC di serie e la coltura da 300 a 400 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante da ogni tubo.Etichettare otto tubi a microcentrifugo come indicato. Quindi utilizzare una pipetta da 0,2 a 20 microliter per aggiungere la quantità appropriata di coltura a ciascun tubo. Successivamente, aggiungere la quantità appropriata di RBC stock a ciascun tubo per ottenere la diluizione della parasitemia desiderata.Centrifugare il sangue fresco del donatore raccolto in tubi anticoagulanti a 1, 200 volte g e condizioni di laboratorio standard per 10 minuti. Rimuovere il plasma disegnarlo con una pipetta e scartarlo in una soluzione di candeggina al 10%. Aggiungere 900 microlitri di RBC donatori isolati in ogni tubo di microcentrifugo e mescolare accuratamente invertendo 10 volte.Per acquisire lo spettro verrà utilizzato un semplice spettrometro a riflessione totale attenuata a riflessione fourier a infrarossi o spettrometro ATR-FTIR. Preparare e pulire il cristallo utilizzando salviette senza pelucchi inumidite con acqua ultra pura per strofinare delicatamente il cristallo con un movimento circolare. Quindi, utilizzare un'altra salvietta priva di pelucchi per asciugare accuratamente il cristallo.Per misurare lo sfondo dell'aria, fare clic su Misurazione sfondo. Ogni 20 minuti, pulire il cristallo e ripetere questa misurazione. Aprire la visualizzazione dal vivo facendo clic su Anteprima.Osservare una linea di base piatta e orizzontale che indica che il cristallo è pulito. Pipettare 10 microlitri di acqua deionizzata direttamente al centro del cristallo e fare clic su Misura campione. Asciugare il cristallo con una salvietta priva di pelucchi e un delicato movimento circolare.Pipettare 10 microlitri di campione al centro del cristallo e fare clic su Misura campione. Pulire il cristallo tra i campioni. In questa dimostrazione, l'analisi dei dati multivariata verrà eseguita utilizzando MATLAB.Per iniziare il trattamento dei dati, inserire l'analisi nella finestra di comando per aprire l'interfaccia utente grafica. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella X per trovare Importa dati. Selezionare il tipo di file per l'analisi.Importare spettri di esempio, acqua e baseline come set di dati nell'ambiente di lavoro selezionando tutti gli spettri in ogni set separatamente, facendo clic su Apri e dando a ciascun set un nome breve. Fate clic su Nuova variabile (New Variable) nella finestra di comando e date al vettore il nome Parasitemia. Inserire la Parasitemia di ogni campione.Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella X per trovare Plot Data. Fate clic sull'icona Traccia dati (Plot Data) per tracciare i dati. Ispezionare gli spettri per gli effetti del vapore acqueo facendo clic su Zoom e ingrandindo su 1.800 a 1.400 per centimetro, più chiaramente osservati come picchi brevi, affilati e stretti lungo le pendici delle bande Amide I e Amide II.In caso di vapore acqueo estremo, aprite la scheda Modifica dati pre-elaborazione e selezionate Smussatura (Smoothing). Ridurre il rumore e/o forti contributi di vapore acqueo levigando il campione e gli spettri d'acqua. Dopo un ulteriore trattamento dei dati come descritto nel protocollo di testo, aprire la scheda Modifica dati e, nelle variabili di colonna, selezionare da 2980 a 2800 per centimetro e da 1750 a 850 per centimetro assicurandosi che solo le relative caselle siano spuntate.I dati sono ora pronti per l'analisi. Per eseguire l'analisi dei componenti principali o PCA, fate clic su Scomposizione analisi (Analysis Decomposition) e selezionate PCA. Fate clic su Modello di compilazione (Build Model).Osservare il limite di confidenza del 95%, l'anello tratteggiato, nel grafico dei punteggi tra PC 1 e PC 2. Utilizzate lo strumento Seleziona spettri (Select Spectra) per contrassegnare gli spettri campione con punteggi che si verificano al di fuori del limite come potenziali valori anomali. Per eseguire la regressione parziale dei quadrati almeno, o PLSR, fate clic su Regressione analisi (Analysis Regression) e selezionate PLSR.Fate clic con il pulsante destro del mouse sul blocco Y e selezionate il modello di costruzione del vettore Parasitemia. Analizzare il modello di regressione e il vettore di regressione e identificare le bande biologiche. Un grafico di regressione parziale dei meno quadrati di RBC è piaciuto tra lo zero e l'uno per cento La Parasitemia ha generato un valore al quadrato R di 0,87 e un errore di convalida incrociata quadratica media radice dello 0,13%Parasitemia.Ciò dimostra la capacità del modello di prevedere la Parasitemia in ogni campione con la Parasitemia nota sull'asse x e la Parasitemia prevista sull'asse y. Il coefficiente di regressione associato descrive il contributo di ogni banda alla capacità predittiva del modello. Più intensa è la banda, più contribuisce al modello e, quindi, come il parassita altera la composizione chimica del sangue.I risultati mostrano che il segnale dei parassiti è abbastanza distinto dagli RBC che possono essere utilizzati per formare un modello di regressione lineare per la previsione dei parassiti nei futuri set di dati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere meno di tre minuti per campione se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di pulire i cristalli ATR da tutti i residui.A seguito di questa procedura, altre specie di malaria come P vivax e P malariae possono essere modellate per rispondere a domande come, La spettroscopia ATR-FTIR è abbastanza sensibile da distinguere tra le specie? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biospectroscopia per esplorare il rilevamento e la quantificazione di altri agenti patogeni trasmessi dal sangue e persino analizzare nel sangue come glucosio e urea. Dopo aver guardato questo video, è necessario avere una buona conoscenza della spettroscopia ATR-FTIR e dell'analisi NVDA per creare un modello di regressione.Non dimenticare che lavorare con campioni di sangue e malaria dei pazienti può essere pericoloso e un adeguato allenamento e contenimento del livello di biosicurezza dovrebbe sempre essere fatto quando si tenta questa procedura.

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Impara a rilevare e quantificare Plasmodium falciparum in globuli rossi usando spettroscopia ATR-FTIR e analisi multivariata. Questo metodo rapido e a basso costo migliora la diagnostica point-of-care della malaria.

Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e lanalisi multivariata dei dati (Video) | JoVE Journal

Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati

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