Name: Imagerie de Mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste Enzyme Fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Découvrez l'imagerie par fluorescence de journaliste enzymatique pour détecter Mycobacterium tuberculosis chez la souris. Cette méthode permet le suivi longitudinal de l'infection et améliore la puissance statistique des études précliniques sur la tuberculose.

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Les études animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices et règlements énoncés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Texas A & M University. Examen et approbation d’un Comité dans votre établissement ou l’agent de sécurité biologique peuvent être exigées.
ATTENTION : Toutes les procédures exigent de confinement BSL3. Le personnel est tenu de porter un équipement de protection individuelle en permanence. Toutes les manipulations sont effectuées à l’intérieur de l’armoire biosécurité (BSC) et tous les objets pointus ou tranchants sont déposés dans les conteneurs pour objets tranchants. Surfaces de travail et BSC sont nettoyés avec de l’éthanol dans la mémoire tampon de phénol et de 70 % avant d’entamer les travaux et après travaux. Procédures se ferait normalement au niveau de biosécurité 3 Mycobacteriumtuberculosis, mais pour l’illustration et de tournage, les auteurs montrent ces procédures au niveau de biosécurité 2 avec des bactéries moins virulentes.
1. des souches et des conditions de culture
Remarque : La souche CDC1551 de M. tuberculosis est utilisée dans cette étude, mais toute souche de M. tuberculosis peut être utilisé de la même manière.
<ol><li>Cultiver les bactéries en M-OADC-TW (7H 9 bouillon additionné de 0,5 % de glycérol, dextrose 10 % d’acide oléique complexe sans la catalase et de 0,05 % de Tween-80) moyen standing à 37 ° C à une OD600 de 0,5 (~ 0,2 x 107 UFC).</li>
	<li>Diluer la culture en M-OADC-TW (série de 01:10 dilutions des bactéries). Les dilutions des bactéries de la plaque (105, 106, 107, 108) en trois exemplaires sur 11 géloses sélectives de 7 H pour permettre la détermination de l’UFC.</li>
	<li>Incuber les boîtes pendant quatre semaines à 37 ° C ou jusqu'à ce que les colonies peuvent être comptées avec précision.</li>
	<li>Centrifuger l’inoculum bactérien à 8 534 x g pendant 5 min obtenir une boulette. Laver le culot avec 10 mL de sérum physiologique (0,9 % NaCl) et Resuspendre le culot dans 15 mL de sérum physiologique (0,9 % NaCl).</li>
</ol>2. infection aérosol de souris à l’aide d’une chambre de Madison
<ol><li>Autoriser les souris s’acclimater à l’environnement nouveau pour une semaine.</li>
	<li>Peser les souris avant leur chargement dans la chambre.</li>
	<li>Branchez les trois cordons sur la multiprise : le pouvoir de la chambre principale, la pompe à vide et le compresseur d’air, dans cet ordre.</li>
	<li>Dévissez soigneusement le bocal en verre. Amener le bocal en verre à la biosécurité du cabinet et ajouter l’inoculum de défi suspendu dans 15 mL de sérum physiologique (0,9 % NaCl) pour atteindre ~ 104 - 106 UFC de bactéries dans les poumons.</li>
	<li>Fermer le couvercle de la Jarre de verre dans l’armoire de biosécurité. Fixez le contenant à l’unité du nébuliseur et ajuster le tube vertical en acier inoxydable pour que la partie inférieure (l’apport) soit environ un quart de pouce au-dessous du niveau du liquide dans le bocal.</li>
	<li>Charger tous les animaux nécessaires à l’expérimentation (la chambre pouvant accueillir jusqu'à 90 souris) dans la chambre et fermer tous les verrous sur la porte.</li>
	<li>Vérifier les principales (chambre) débitmètre d’air. Assurez vous que le centre du flotteur (boule) coule environ 50 L/min, mesurée sur l’échelle sur la gauche.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Start sur le panneau de contrôle de la chambre. Sur l’échelle de la valeur du débit d’air à travers le débitmètre d’air compresseur (le plus petit compteur à gauche) que 4 L/min. Vérifier visuellement que l’inoculum de défi est en nébulisation.</li>
	<li>Après 15 min, quand la lumière rouge sur le devant du panneau de commande s’affiche et un signal sonore indique la fin de la course, appuyez sur la touche Reset, sur le coin inférieur droit du panneau de commande pour réinitialiser les compteurs.</li>
	<li>Maintenez le petit bouton rouge sur la porte de la chambre pour libérer le vide.</li>
	<li>Ouvrez la porte de la chambre et enlever les animaux. Replacez les souris dans leur cage.</li>
	<li>Retirer le récipient du nébuliseur verre et placez-le dans un contenant scellé et étanche de transport. Placer le récipient à l’intérieur de l’enceinte de bio-sécurité et jeter la suspension de défi dans un conteneur de déchets désigné.</li>
	<li>Placer le bocal de nébuliseur utilisés à l’intérieur d’un sac de biohazard et sceller le sac pour le transport à l’autoclave.</li>
	<li>À la fin de la procédure de l’infection, l’intérieur de la chambre de pulvérisation avec de l’éthanol dans la mémoire tampon de phénol et de 70 % et permettre à la chambre de s’asseoir pendant 10 min.</li>
	<li>Ensuite, essuyez toutes les surfaces intérieures accessibles très soigneusement. Eliminez tous les essuie-tout contaminé, etc.. dans la corbeille de biohazard. Stériliser la poubelle, conteneur à déchets et utilisé des bocaux de nébuliseur.</li>
	<li>Remettre les animaux dans la salle de confinement jusqu’au temps d’imagerie-point.</li>
	<li>Le jour de l’imagerie, transférer les animaux dans un conteneur secondaire à la salle d’imagerie.</li>
</ol>3. animaux anesthésie
<ol><li>Anesthésier les souris à l’isoflurane en utilisant un système d’anesthésie gaz sur mesure.</li>
	<li>Peser chacun de la cuve du filtre à charbon deux situé sur le dessus de l’appareil d’anesthésie.</li>
	<li>Remplacer par une nouvelle cartouche si le poids est de 50 g au-delà de la masse initiale.</li>
	<li>Vérifier l’unité vaporisateur afin d’assurer l’isoflurane suffisant pour la procédure.</li>
	<li>Placez le support de cône de nez à l’intérieur de la chambre d’imagerie. Placer le nombre de cônes de nez requis pour la procédure et sceller les ouvertures restantes avec les bloqueurs de coiffe.</li>
	<li>Allumez l’alimentation en oxygène du cylindre à haute pression et définissez-la à 55 lb/po2.</li>
	<li>Mettre en marche la pompe d’évacuation située en face de l’unité d’anesthésie et définissez-la à 8 L/min.</li>
	<li>Activer la bascule de l’oxygène située en face de l’appareil d’anesthésie.</li>
	<li>Activer le flux de gaz vers la chambre d’induction de l’anesthésie pour régler le débit du gaz à 1,5 L/min. tour le débit de gaz au large.</li>
	<li>Activer le flux de gaz vers la chambre d’imagerie pour régler le débit du gaz à 0,25 L/min. tour le débit de gaz au large.</li>
	<li>Allumez le vaporisateur isoflurane et définissez-la à 2 à 2,5 %. Réglez le niveau d’isoflurane selon le nombre et le poids des animaux utilisés pour l’expérience en tournant le cadran sur le vaporisateur isoflurane (2 à 2,5 % pour une souris pesant environ 20 g ; 4 % pour un cobaye, pesant 300 g).</li>
	<li>Placez les souris dans la chambre de l’anesthésie et refermer le couvercle. Activer le flux de gaz vers la chambre d’induction de l’anesthésie.</li>
	<li>Laissez les souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie pendant 5-10 min jusqu'à ce que complètement anesthésiés.</li>
	<li>Une fois que les souris sont anesthésiés, appliquer un onguent optique aux yeux pour les protéger tout en imagerie.</li>
	<li>Placer les souris en décubitus ventral ou sternal telle que leur nez est placé dans la coiffe pour faciliter l’anesthésie des souris au cours de la procédure d’imagerie.</li>
</ol>4. imagerie de fluorescence (REF) enzyme reporter
<ol><li>Injecter le substrat (20 µM, 2,5 µL/g de poids) par injection intrapéritonéale à des patients infectés ainsi que les souris témoins. Les souris sont sous anesthésie à l’intérieur de la chambre d’imagerie pour moins de 1 min.</li>
	<li>Démarrer le système d’imagerie.</li>
	<li>Initialiser le système en cliquant sur Initialize. Attendez que la barre de température passe au vert. Remarque : La chambre d’imagerie consistant en une plate-forme chauffée pour maintenir la température corporelle de l’animal tout en imagerie.</li>
	<li>Pour le réglage de l’acquisition de l’imagerie, sélectionnez fluorescentes | TRANS-éclairage pour l’animal entier ou épi-illumination pour les tissus pulmonaires, Structure et Overlay dans le panneau Acquisition.</li>
	<li>B la valeur de champ pour la souris et le niveau de la lampe à haute.</li>
	<li>La valeur temps d’exposition automatique, binning moyennes, 2-3 pour la f/arrêt et filtre d’excitation à 745 filtres nm et d’émission de 780 nm à 840 nm.</li>
	<li>Pour la configuration de la séquence, cliquez sur Configuration de la séquence, sélectionnez 9-12 Trans-illumination points dans la zone du poumon.</li>
	<li>Cliquez sur acquérir pour l’acquisition d’images.</li>
	<li>Replacez la souris dans l’imagerie de la cage.</li>
	<li>Contrôler les souris jusqu'à ce que complètement guéri ou sacrifier pour quantifier l’UFC si à un moment de l’expérience d’imagerie. Réaliser un score de Karnofsky modifié pour surveiller le bien-être des souris après l’imagerie.</li>
</ol>5. analyse de l’imagerie de REF
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’imagerie.</li>
	<li>Charger des fichiers de l’image en cliquant l’icône parcourir.</li>
	<li>Pour la déconvolution spectrale, cliquez sur la déconvolution spectrale dans la palette d’outils et cliquez sur les spectres pour unmix. Cliquez sur Démarrer déconvolution.</li>
	<li>Pour la reconstruction de surfaces optique, cliquez sur la topographie de Surface.</li>
	<li>Sélectionnez orientation à dorsale, sous réserve de souris fourrure et, cliquez sur Generate aire.</li>
	<li>Dessiner de rogner l’image et définir l’image de seuil pour une région d’intérêt. Cliquez sur terminé.</li>
	<li>Pour l’enregistrement de l’orgue, allez dans l’onglet enregistrement dans le menu de liste déroulante des instruments optiques 3D.</li>
	<li>Registre des organes d’intérêt dans un atlas de l’orgue.</li>
	<li>Ajuster la taille de l’organe ou l’emplacement à la topographie de surface générée à l’aide d’outil de transformation marche/arrêt situé sur les panneau-enregistrement des outils.</li>
	<li>Accédez à la tomographie fluorescente (FLIT) reconstruction 3D et sélectionnez analyse tab. sélectionner les images pour être inclus dans l’analyse, l’image type de rendement de Fluorescence de Transmission normalisée (NTF), cliquez sur Démarrer.</li>
	<li>Vérifiez sur Sélectionner tout et reconstruire dans l’onglet Aperçu des données.</li>
	<li>Pour la quantification de la fluorescence, accédez aux outils de la région d’intérêt (ROI), ajouter le cube ROI à l’organe d’intérêt et d’ajuster la taille du cube pour couvrir l’organe d’intérêt. Cliquez sur mesurer 3D ROIs.</li>
	<li>Dans la fenêtre de mesure de ROI, aller à des mesures de ROI 3D, sélectionnez le type de données à la source voxels et Mensurations à pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Sauvegarder ou exporter les résultats des analyses de reconstruction 3D FLIT dans un fichier de données ou de la figure.</li>
</ol>6. quantification des bactéries par UFC
<ol><li>Euthanasier les souris par injection intrapéritonéale de 0,1 mL pentobarbital sodique (390 mg/mL).</li>
	<li>Recherchez les pédale réflexe en serrant les coussinets des pieds des souris pour assurer qu'il n’y a aucune réaction réflexe.</li>
	<li>Explantation le tissu pulmonaire des souris à l’aide de ciseaux et une pince stérile. Homogénéiser le tissu pulmonaire dans 1 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Faire 10 fois des dilutions de l’homogénat de poumon dans du PBS stérile 1 x.</li>
	<li>Pour le placage, repérer trois aliquotes de 20 µL de chaque de la dilution respectif sur la gélose.</li>
	<li>Incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C et moniteur pour la croissance bactérienne.</li>
	<li>Comte les colonies dans chaque spot après la période d’incubation et expriment en UFC / mL de correction de volume et de la dilution à l’aide de l’équation suivante : UFC / mL = (C/V) x M Où C = nombre de colonies par endroit, V = volume de l’échantillon inoculé dans chaque assiette (mL) et M = facteur de multiplication (inverse de la dilution utilisée). Remarque : Si les 11 colonies sont comptés en un seul endroit pour un volume d’échantillon de 0,002 mL à une dilution de l’échantillon de 10-4, à l’aide de l’équation, le comptage des colonies sera calculée comme (11/0.02) x 104 = 5,5 x 106 UFC / mL</li>
</ol>

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Lors de l’utilisation des techniques d’imagerie, comme REF, il y a des stratégies clés qui permettent de générer des données solides et cohérentes. Imagerie optique produit une lumière diffusée dans les tissus qui peut influer sur la profondeur de pénétration, car il est difficile de capter la lumière émise dans toutes les directions. Utilisation d’un fluorophore d’infra-rouge proche (NIR) substrat Ref imagerie ayant une longueur d’onde d’excitation et d’émission dans la Querange de 700 à 900 nm facilite l’absorption minimale du signal fluorescent de tissus de mammifères. Le substrat conçu personnalisé a été construit en reliant un fluorophore NIR, IRDye 800Cw à un extincteur, IRDye QC-1, par un lactame permettant de fluorescence par résonance énergétique axée sur le transfert trempe. IRDye a pénétration tissulaire excellente et caractéristiques de diffusion de la lumière et n’a pas de tout effet nocif évident sur mammifères36, dépolluées par 24 h. Fluorescence du sang et organes signal significativement augmentations débuté 4 h après administration de substrat, atteignant maximale niveaux 6 h après l’administration.
La dose infectieuse bactérienne, le mode d’administration de la dose infectieuse et le substrat ainsi que des moments d’imagerie après l’infection en effectuant des études pilotes devraient être normalisés avant d’entreprendre des expériences importantes et complexes. Études pilotes peuvent réduire considérablement les délais et les coûts lorsqu’un grand nombre d’animaux d’imagerie parce qu’une procédure standard peut être optimisée avant de faire l’expérience clé. Charge bactérienne doit être déterminée dans les organes/tissus d’intérêt suite à l’imagerie corps entier à l’aide de trans-illumination et ex vivo l’imagerie pulmonaire utilisant des épi-illumination pour valider la source du signal et de déterminer la qualité de la corrélation avec le nombre de bactéries présentes8. Études pilotes permettra de mieux comprendre dans le seuil de détection, de la plage dynamique de la technique ou de déterminer les conditions expérimentales optimales pour l’imagerie.
Les principaux avantages de l’utilisation de REF imagerie comme par rapport à d’autres stratégies fluorescents et bioluminescents sont sa haute sensibilité et sa capacité de représenter naturel M. tuberculosis souches. Réf d’imagerie utilise l’enzyme catalytiquement robuste BlaC qui est conservée dans tous les isolats cliniques de M. tuberculosis et des souches du complexe tuberculosis. La grande sensibilité de REF imagerie est due au taux rapid catalytique de BlaC en combinaison avec la rétention du produit fluorescent clivé par la cellule hôte. Signal en continu augmente aussi longtemps que le substrat est disponible, ce qui entraîne une accumulation presque illimitée de niveau du signal dans les cellules infectées et les tissus. Cette sensibilité accrue de REF imagerie par rapport aux autres approches d’imagerie permet de détection spécifique de M. tuberculosis les deux in vitro et in vivo,8,23,24, 29.
Réf d’imagerie peut être utilisé pour la détection bactérienne sans modifications génétiques permettant son application directe sur n’importe quel modèle d’infection, ou l’autre laboratoire animaux8,37 ou le matériel clinique humain29,38 . REF peut être utilisé pour détecter et un large éventail d’agents pathogènes39,40, l’image étant donné que les substrats fluorogéniques peuvent élaborer de nombreuses cibles enzymatiques autres que BlaC comme les protéases, kinases, ureases et β-galactosidases. Mais attention il faudrait réfléchir à la cible afin de s’assurer il affiche des caractéristiques optimales pour l’imagerie. BlaC représente une enzyme bon modèle pour les caractéristiques qui assurera l’application réussie de cette stratégie. Réf d’imagerie fournit une lecture immédiate sur la charge bactérienne présente dans les poumons lors d’infections, qui accélère grandement des progrès dans l’étude de la pathogenèse de la tuberculose, étant donné que la détermination du nombre de bactéries exige normalement de trois à six semaines, mais même dans les plus les organismes en croissance rapide, cette approche permettra d’économiser beaucoup de temps. REF pourrait également servir à discriminer des carcinomes de la tuberculose, un problème majeur dans le diagnostic des lésions nodulaires dans les patients41,,42. REF est un nouvel outil pour accélérer l’imagerie de la tuberculose translationnelle et peut même être appliqué aux humains, permettant potentiellement prédiction rapide des résultats thérapeutiques.

Le faible taux de croissance de M. tuberculosis est un obstacle majeur dans le diagnostic rapide de la tuberculose1,2,3. Alors que la culture basée diagnostic prend des semaines pour produire des résultats, frottis pour bactéries acido-résistantes a limites diagnostiques4 enfants5 et patients co-infectés par le virus de l’immunodéficience humaine6,7. Technologies d’imagerie optique ont été récemment reconnus comme une alternative aux méthodes traditionnelles de diagnostics de la tuberculose8,9. La fluorescence et la bioluminescence peuvent être utilisés pour l’image optiquement M. tuberculosis dans les animaux vivants en temps réel10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imagerie optique a l’avantage d’une évaluation rapide et précise d’une infection par M. tuberculosis20,21,22.
Nous exposons les détails pour l’imagerie optique de M. tuberculosis dans des souris vivantes à l’aide de REF. Cette méthode est très spécifique et sensible23,24 et semblable aux autres méthodes optiques, est moins cher que d’autres méthodes de la tuberculose (TB), imagerie25, y compris la tomodensitométrie (TDM)26, magnétique résonance d’imagerie (IRM)27et F-fluorodésoxyglucose TEP/CT (F-FDG TEP/CT)28. Réf utilise des substrats fluorescents ou bioluminescentes personnalisés qui, par clivage par une enzyme bactérienne, produire un produit fluorescent8,29. Par conséquent, il a l’avantage de ne pas nécessiter un journaliste mycobactérienne recombinant strain30,31. Le substrat de la frette décrit se compose d’un fluorochrome et un extincteur relié par une β-lactame qui est hydrolysé par BlaC (β-lactamase), naturellement exprimée constitutivement par la tuberculose-complexe Mycobacterium8, 32. les bactéries générer directement des signaux en raison de l’activité catalytique REF qui permet l’amplification par plusieurs ordres de grandeur et de sensibilité de détection de M. tuberculosis.
Le substrat REF utilisé dans cette étude a pénétration tissulaire excellente dans les animaux vivants et réduit à fond en raison de sa longueur d’onde. Avec ce substrat de longueur d’onde, il est possible d’atteindre un seuil de détection de M. tuberculosis de près de 100 colonies formant des unités (UFC) in vitro et < 1000 UFC dans les poumons de souris in vivo (animaux)8, 33. Réf peut servir comme outil de diagnostic pour crachat, matériaux cliniques et même directement chez les patients avec micro systèmes endoscopiques16,32,33,34 due à sa grande sensibilité et spécificité. REF peut être appliqué à n’importe quelle contrainte clinique de la tuberculose, car il utilise une enzyme bactérienne produite naturellement, BlaC, pour détection présente chez toutes les souches. Ces caractéristiques font de REF pour faciliter la thérapeutique d’imagerie en général un outil précieux dans la recherche préclinique de la tuberculose et vaccin évaluation ainsi que l’analyse de la pathogenèse, mais également en fin de compte peuvent être appliquées au diagnostic de la tuberculose patients.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>Solution synthétisée</td><td></td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>Fatal Plus</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Middlebrook broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Middlebrook enrichment</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas Anesthesia System</td><td>Perkin Elmer</td> Living Imaging software Perkin Elmer <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cônes de nez transparents</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis souche CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris femelles BALB/C, 5-7 semaines</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie de mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste enzyme fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Fluorescence de journaliste enzyme (REF) utilise des substrats spécifiques d’enzymes présents dans les organismes cibles d’intérêt pour l’imagerie ou détection par fluorescence ou bioluminescence. Nous utilisons un BlaC, une enzyme exprimée constitutivement par toutes les souches de M. tuberculosis . Réf permet la quantification rapide de bactéries dans les poumons des souris infectées. Le même groupe de souris peut être photographié à plusieurs points dans le temps, considérablement réduire les coûts, énumérant les bactéries plus rapidement, permettant de nouvelles observations dans les interactions hôte-pathogène et augmentant la puissance statistique, depuis plus d’animaux par groupe sont facilement maintenus . REF est extrêmement sensible en raison de la nature catalytique du reporter enzymatique BlaC et spécifique en raison du transfert d’énergie de fluorescence personnalisé résonance (FRET) ou substrats fluorogéniques utilisés. REF ne nécessite pas de souches recombinantes, assurer des interactions hôte-pathogène normal. Nous décrivons l’imagerie de M. tuberculosis infection en utilisant un substrat frette avec émission maximale à 800 nm. La longueur d’onde du substrat permet l’imagerie des tissus profonds sensibles chez les mammifères. Nous énoncerons infection aérosol de souris par M. tuberculosis, anesthésie des souris, l’administration du substrat REF et imagerie optique. Cette méthode a été appliquée avec succès à l’évaluation des interactions hôte-pathogène et l’efficacité des antibiotiques ciblant M. tuberculosis.

Réf imagerie de souris infectés par M. tuberculosis avec souris de contrôle non infectées sont indiquées dans la Figure 1A. Les souris infectées produit un significativement (P = 0,0057) signal de fluorescence plus élevée dans les poumons à l’infection après 6 semaines, par rapport au contrôle sur l’administration de substrat. Un cours typique de temps pour étudier l’efficacité thérapeutique contre M. tuberculosis utilisant REF pourrait être d’imagerie à la semaine 1, 2, 4, 6, 15, 24 après l’infection. Intensité de fluorescence est quantifiée à l’aide d’épi-illumination pour les tissus pulmonaires (Figure 1B). Le signal sans cesse croissant de la semaine 2 semaine 6 dans les poumons des souris infectées suggère que la REF est avec succès capable de détecter de M. tuberculosis in vivo. Une goutte dans le signal de fond des souris témoins à un moment plus tard (Figure 1B) pouvait être attribuée à l’augmentation des corps masse et volume de la souris sur une période de 6 semaines, ce qui réduit la pénétration de longueur d’onde d’excitation. Reconstruction 3D de FLIT de sources de fluorescence chez des souris infectées par M. tuberculosis est représentée dans la Figure 2A. Les séquences d’images sont acquises avec plusieurs points de trans-illumination dans la souris à l’aide de la même excitation et série de filtres d’émission. Ces séquences d’images sont ensuite utilisés pour la reconstruction 3D de FLIT pour distribution source fluorescente au sein de la matière animale. Figure 2 A-D montre les différentes directions (coronal, sagittal et transversale) de la tomographie de souris avec inscription organe poumon. Efficacité NTF correspond au contrôle de la qualité de la reconstruction sont représentées dans la Figure 2E. NTF permet de soustraire les fuites de lumière de fond des images trans-illumination à travers une image supplémentaire capturé avec filtre de densité neutre. L’image prise avec le filtre d’excitation spécifique (Figure 2E-mesuré) est normalisé à l’image de transmission mesuré avec la même émission et le filtre ouvert d’excitation (Figure 2E simulés) de donner le signal produit par le seul substrat. Le similaire mesuré et simulé profil efficacité NTF en tant l’horizontale (Figure 2F) et des profils verticaux (Figure 2G) avec presque 0 % pourcentage d’erreur (Figure 2E-% d’erreur) fournit des preuves d’une reconstruction 3D de bonne qualité avec sensibilité et localisation du signal amélioré et artefacts réduits.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figure 1 . Imagerie de M. tuberculosis avec la Réf. (A) imagerie in vivo de souris non infectés et infectés par M. tuberculosis à 2, 4 et l’infection après 6 semaines. La barre de couleur représente l’intensité du signal fluorescent en photons par seconde par cm2 de bas (jaune) à élevé (rouge). (B) la quantification de l’intensité de la fluorescence de souris infectés par M. tuberculosis. Fluorescence des valeurs pour les deux contrôle (noir) et infectée (rouge) est représenté ainsi que l’écart-type pour chaque point dans le temps. La signification des résultats a été déterminée par les élèves de t-test, les valeurs de p &lt; 0,05 étaient considérés comme significatifs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figure 2 . Reconstruction 3D de FLIT de sources de fluorescence chez des souris infectées par M. tuberculosis. Tomographie de souris représentée dans des directions différentes ; A) coronal, B) sagittale et C) transversale avec inscription organe poumon D). La région 3D d’intérêt (ROI) est représentée par un cube rouge dans le poumon pour les mesures de la source. (E) efficacité NTF cartes des mesurée et simulé pour vérifier la qualité de la reconstruction. Le profil d’efficacité NTF mesuré et simulé a été comparé, providing de bonne qualité de reconstruction 3D (efficacité similaire mesurée et simulée NTF). Signal vertical Horizontal F) et G) profils représentant mesurée (en bleu) et simulé la courbe d’efficacité NTF (rouge). Les barres horizontales et verticales rouges indiquent la position de la source. La barre de couleur représente l’intensité du signal fluorescent en photons par seconde par cm2 de basse (bleu) à élevé (rouge). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous décrivons l’imagerie optique des souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) utilisant journaliste enzyme fluorescence (REF). Ce protocole facilite la détection sensible et spécifique de M. tuberculosis dans des modèles animaux précliniques pour recherche de vaccin, la thérapeutique et la pathogenèse.

Imagerie de Mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

L’objectif global de cette procédure d’imagerie par fluorescence enzymatique rapporteure est de faciliter la détection sensible et spécifique de mycobacterium tuberculosis dans des modèles animaux précliniques pour la recherche sur la pathogenèse, les traitements et les vaccins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la tuberculose, notamment les mécanismes de virulence des espèces bactériennes, ainsi que la création de traitements et la compréhension des vaccins. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’imager le même groupe d’animaux à plusieurs moments.Cela réduit considérablement le coût, nous permet d’étudier les interactions hôte-pathogène et augmente également la puissance statistique car un plus grand nombre d’animaux peut être maintenu facilement en même temps. Pour commencer, faites croître n’importe quelle bactérie M. tuberculosis dans le milieu MOADCTW à 37 degrés Celsius jusqu’à une densité optique de 0,5 mesurée à 600 nanomètres. Toutes les procédures impliquant la manipulation de matières infectieuses doivent être effectuées dans des enceintes de sécurité biologique ou d’autres dispositifs de confinement physiques approuvés.Une fois prêt, faites une série de une à 10 dilutions de la culture dans le même milieu. Ensuite, plaquez les dilutions en trois exemplaires sur des plaques sélectives 7H11 pour faire une détermination précise de l’UFC. Incuber les plaques pendant quatre semaines à 37 degrés Celsius ou jusqu’à ce que les colonies puissent être comptées avec précision pour déterminer l’UFC.Avant de mettre en place une inoculation, assurez-vous toujours que la cagoule de biosécurité fait circuler de l’air à 50 litres par minute. Pour préparer un inoculum qui peut infecter jusqu’à 90 souris, mesurez l’UFC souhaitée dans un tube de faucon de 15 millilitres. Entre 10 000 et 1 million d’UFC sont généralement utilisés.Ensuite, granulez les bactéries. Ensuite, lavez les bactéries une fois avec 10 millilitres de solution saline. Ensuite, suspendez-les dans 15 millilitres de solution saline.Ensuite, dans une enceinte de biosécurité, chargez l’inoculum dans un bocal en verre qui peut être fixé à un nébuliseur. Ensuite, connectez l’unité de nébulisation et ajustez le tube vertical en acier inoxydable de sorte que l’extrémité inférieure soit à environ un quart de pouce sous le ménisque de la suspension. Transférez maintenant l’ensemble dans la chambre d’inoculation dans un récipient de transport étanche.Pour continuer, chargez les animaux de poids connu dans la chambre d’inoculation sous tension. La chambre peut accueillir jusqu’à 90 souris. Fermez ensuite tous les loquets de la porte.Ensuite, connectez le nébuliseur à l’aide d’une pince en acier. Appuyez ensuite sur le bouton de démarrage de la chambre. Et réglez le débit d’air entre trois et cinq litres par minute.L’air comprimé s’écoulera à environ 22 à 26 livres par pouce carré et, surtout, il devrait être possible de voir le brouillard d’inoculum dans la chambre. Après 15 minutes, une lumière rouge à l’avant du panneau de commande apparaîtra et un signal sonore indiquera la fin de la course. Appuyez ensuite sur le bouton de réinitialisation pour réinitialiser les minuteries.Pour libérer le vide, appuyez sur le petit bouton rouge situé sur la porte de la chambre. Ouvrez ensuite la porte de la chambre et renvoyez les souris dans leurs cages domestiques. À l’avenir, gardez les animaux dans la salle de confinement.Ensuite, retournez le bocal et le récipient de transport dans l’enceinte de biosécurité. Là, jetez la suspension bactérienne restante dans un conteneur à déchets désigné. Placez ensuite le bocal de nébulisation usagé dans un sac à risque biologique et scellez le sac pour le transport vers l’autoclave.Pour nettoyer la chambre, vaporisez les surfaces intérieures avec du phénol tamponné et de l’éthanol à 70 %. Laissez ces solutions réagir sur ces surfaces pendant 10 minutes. Ensuite, essuyez-les soigneusement.Jetez toutes les lingettes à la poubelle des matières biologiques. Ensuite, autoclavez les ordures, le conteneur à déchets et les bocaux de nébulisation usagés. Transférez les animaux dans la salle d’imagerie.Là, anesthésie un animal selon le protocole textuel et injecte-lui un substrat de contraste par injection intrapéritonéale. Dans le logiciel du système d’imagerie, initialisez le système et procédez lorsque la barre de température devient verte. Après avoir initialisé le système, placez la souris dans la chambre d’imagerie.Assurez-vous que ses narines sont à l’intérieur du cône nasal afin qu’il reçoive une anesthésie pendant l’imagerie. Revenez maintenant à l’ordinateur. Dans le panneau de commande d’acquisition, sélectionnez soit la fluorescence, la transillumination, pour la visualisation de l’animal entier, soit l’épi-illumination pour visualiser les tissus pulmonaires.Pour une seule souris, réglez le champ de vision sur B et le niveau de la lampe sur élevé. Pour l’exposition, utilisez le temps automatique, le binning moyen et deux ou trois pour le F/Stop. Réglez ensuite le filtre d’excitation sur 745 nanomètres et les filtres d’émission de 780 à 840 nanomètres.Ensuite, allez à la configuration de la séquence et sélectionnez neuf à 12 points de transillumination dans la zone d’intérêt. Appuyez maintenant sur le bouton d’acquisition pour collecter des images. L’analyse des images est couverte par le protocole texte.Pour analyser l’étendue de l’infection, euthanasiez la souris à l’aide de pentobarbital sodique. Assurez-vous de vérifier s’il y a un réflexe de pédale pour vous assurer que l’animal est euthanasié. Et puis explantez les poumons à l’aide d’une dissection standard.Ensuite, homogénéisez le tissu pulmonaire dans un millilitre de PBS. Effectuez ensuite une dilution en série de dix fois de l’homogenyn à l’aide de PBS. Plaquez l’homogénéité diluée en trois exemplaires et incubez la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies puissent être comptées.Utilisez ensuite le score CFU pour mesurer la gravité de l’infection. Les souris ont été traitées comme décrit. Un substrat REF a été utilisé pour observer la progression de M. tuberculosis.La fluorescence a été quantifiée à l’aide de la transillumination. Et il a augmenté de la deuxième à la sixième semaine chez les souris infectées. La légère baisse du signal chez les souris témoins pourrait être attribuée à l’augmentation de la masse corporelle et du volume au cours de la période de six semaines.La reconstruction FLIT 3D des sources de fluorescence a été réalisée à partir de plusieurs points de transillumination en utilisant la même excitation et la même série de filtres d’émission. Des cartes d’efficacité NTF ont été réalisées pour vérifier la qualité de la reconstruction. L’image prise à partir du filtre d’excitation spécifique a été normalisée à l’image de transmission réalisée avec le même filtre d’émission et un filtre d’excitation ouvert.Cela fournit un signal produit par le substrat seul. Il n’y a eu presque aucune erreur dans la reconstruction. L’examen de l’efficacité NTF des données dans les vues horizontales et verticales a montré une corrélation étroite.Ainsi, la reconstruction 3D comportait peu d’artefacts, une meilleure localisation du signal et une sensibilité améliorée par rapport aux autres méthodes. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la tuberculose pour explorer l’efficacité thérapeutique des médicaments contre mycobacterium tuberculosis. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter des souris par aérosol avec mycobacterium tuberculosis avec une imagerie optique de suivi à l’aide du substrat REF.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Source : de Vries, C. R., et al., Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie par Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo présente une technique d’imagerie bioluminescente pour surveiller la progression de l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. Des bactéries pathogènes conçues avec le système rapporteur luxABCDE émettent de la lumière au site d’infection, permettant la visualisation des bactéries métaboliquement actives. En imageant la...

Imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez la souris

Source : Valentine, M. E., et al., Génération de mutants de délétion génique dans le cadre chez Pseudomonas aeruginosa et test de l’atténuation de la virulence dans un modèle simple d’infection chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre l’utilisation d’une approche d’imagerie basée sur la bioluminescence pour surveiller l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. L’imagerie séquentielle bioluminescente et par rayons X permet la visualisation en temps réel et la...

Imagerie en temps réel de l’infection bactérienne dans un modèle murin utilisant la bioluminescence

Source : Behera, R. K., et al. Une méthode basée sur la fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre une méthode de préparation du tissu rénal infecté de souris, de coloration de l’ADN et de détection de l’expression génique bactérienne à l’aide de doubles rapporteurs fluorescents. Le rouge marque toutes les bactéries, et le vert met en avant les cellules sensibles à l’infection.

Imagerie par fluorescence de la colonisation bactérienne dans le tissu rénal de la souris

Cette vidéo présente l’imagerie par fluorescence enzymatique rapporteure (REF) pour la détection in vivo de l’infection à Mycobacterium tuberculosis. Les souris infectées sont injectées par voie intrapéritonéale avec un substrat pour l’imagerie REF. Lorsqu’il est hydrolysé par l’enzyme bactérienne β-lactamase, le substrat émet une fluorescence dont la détection facilite l’évaluation de l’infection.

Imagerie par fluorescence enzymatique rapporteure pour le suivi in vivo d’une infection bactérienne

Cette vidéo présente une méthode de suivi des infections virales dans des modèles murins à l’aide d’un virus de la grippe A bi-rapporteur exprimant la luciférase recombinante et la protéine de fluorescence. Cette méthode permet des études in vivo et ex vivo, ce qui permet aux chercheurs de mieux comprendre la dynamique virale et les effets des interventions.

Un virus de la grippe rapporteur fluorescent à la luciférase pour suivre les infections virales

Imagerie multi-modalité est une approche intéressante pour l'étude de la colonisation bactérienne dans les petits modèles animaux. Ce protocole décrit l'infection de souris avec...

4D imagerie multimodalité des<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infections chez les souris

Ensemble d'imagerie optique et μCT dans un modèle murin de l'infection de l'implant orthopédique, en utilisant un bioluminescente souche génétiquement de Staphylococcus aureus, à condition que la capacité de surveiller de manière non invasive et longitudinalement la dynamique de l'infection bactérienne, ainsi que de la réponse inflammatoire correspondant et modifications anatomiques dans l' os.

Combiné<em&gt; In vivo</em&gt; Optique et μCT imagerie pour surveiller l&#39;infection, l&#39;inflammation, et Bone Anatomy dans une infection orthopédique Implant souris

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Les virus de la grippe A (IvIV) sont des agents pathogènes respiratoires contagieux qui causent des épidémies annuelles et des pandémies occasionnelles. Ici, nous décrivons un protocole pour suivre des infections virales in vivo utilisant une luciferase recombinante nouvelle et fluorescence-exprimant bi-reporter IAV (BIRFLU). Cette approche fournit aux chercheurs un excellent outil pour étudier l'IAV in vivo.

Un virus de la grippe Luciferase-fluorescent Reporter pour l'imagerie en direct et la quantification de l'infection virale

Ici, nous présentons un protocole pour l’imagerie intravitale d’un Mycobacterium tuberculosis atténué approuvé par BSL-2. Souche dans le poumon murin utilisant une fenêtre pulmonaire permanente. Cette approche permet une analyse longitudinale à résolution unicellulaire des interactions précoces hôte-pathogène, y compris la localisation bacillaire, la dynamique vasculaire et l’absorption des macrophages dans le même microenvironnement pulmonaire.

Imagerie intravitale de Mycobacterium tuberculosis auxotrophe atténué dans le poumon murin lors d’une infection intravasculaire précoce

Découvrez l'imagerie par fluorescence de journaliste enzymatique pour détecter Mycobacterium tuberculosis chez la souris. Cette méthode permet le suivi longitudinal de l'infection et améliore la puissance statistique des études précliniques sur la tuberculose.

Imagerie de Mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste Enzyme Fluorescence

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