Phthalic Acid Ester-liaison ADN aptamère sélection, caractérisation et Application d’un Aptasensor électrochimique

L’objectif global de cette procédure est de sélectionner des aptamères d’ADN spécifiques à un groupe de petites molécules hautement hydrophobes et d’utiliser l’aptamère sélectionné pour développer un biocapteur électrochimique sensible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la sélection des aptamères, sur la façon de sélectionner et de caractériser des aptamères spécifiques à un groupe lorsque les cibles sont des molécules hautement hydrophobes. Alors que la partie la plus utile de cette méthode est le développement de biocapteurs électrochimiques, pour la détection des titres.

Ces biocapteurs devraient également fonctionner pour nos mesures d’affinité des aptamères. Pour commencer la réaction, ajoutez 100 microlitres d’eau sans RNase au produit PCR aptamère purifié. Agitez le mélange jusqu’à ce que le précipité soit dissous.

La réaction de l’exonucléase lambda est sensible à la concentration de sel et est un produit qui devrait proliférer par la précipitation de l’éthanol, mais un autre isopropanol. Placez dans chacun des cinq tubes de micro-centrifugeuse, cinq microlitres de solution d’aptame, 11 microlitres d’eau libre de Rnase et deux microlitres de tampon de réaction 10x. Ajoutez deux microlitres d’eau libre de Rnase et des solutions de deux, cinq, huit et 10 unités d’exonucléase lambda dans de l’eau libre de Rnase dans un tube chacun.

Bien mélanger avec un pipetage doux. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 35 minutes et à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes. Tenez ensuite les tubes à quatre degrés Celsius et préparez un gel de page natif à 12 %.

Ajouter à chaque tube un microlitre de colorant de chargement et quatre microlitres d’eau libre de Rnase. Faites fonctionner les mélanges dans le gel de la page native à 150 volts pendant 45 minutes. Identifiez la plus petite quantité d’exonucléase lambda nécessaire pour générer complètement de l’ADN simple brin.

Effectuer une réaction à grande échelle pour générer de l’ADN simple brin. Pour chaque cible de liaison à tester, incuber 10 microlitres de billes magnétiques codées DBP fonctionnalisées moyennes avec 500 microlitres d’une solution micromolaire de DBP-1 pendant une heure à température ambiante pendant la rotation. Jetez ensuite le surnageant.

Lavez les billes quatre fois avec des portions de 200 microlitres de tampon de liaison PAE et remettez les billes en suspension dans 10 microlitres de tampon de liaison PAE. Obtenir 10 dispersions de test de liaison micromolaire dans le tampon de liaison PAE. C’est un excellent moyen de disperser les cibles hydrophobes dans le tampon de liaison PAE.

Pour s’assurer qu’il y a un enrichissement de la bibliothèque, nous avons été sélectionnés dans le cadre de tests d’affinité. Ajoutez 10 microlitres de billes codées DBP-1 à 110 microlitres de chaque solution d’essai cible. Incuber les mélanges pendant une heure et recueillir les surnageants par séparation magnétique.

Diluez les surnageants 100 fois et utilisez trois microlitres pour chaque PCR quantitative. Calculez les affinités relatives en divisant le nombre de DBP-1 libérés en présence de l’échantillon d’essai par le nombre de DBP-1 libérés dans le tampon de liaison PAE seul. Avant d’effectuer les mesures, synthétisez et purifiez la sonde de séquence de noyau thiolé basée sur DBP-1 et la sonde de signalisation.

Reconstituer la sonde thiolée et la sonde de signalisation sous forme de 100 solutions micromolaires dans de l’eau sans nucléases. Ensuite, polissez une électrode d’or de deux millimètres de diamètre sur une surface semblable à un miroir avec une poudre d’alumine de 0,3 et 0,5 micron et un chiffon en microfibre pendant cinq minutes chacun. Soniquez l’électrode dans de l’eau ultra pure pendant cinq minutes après chaque polissage.

Plongez l’électrode polie dans une solution 0,5 molaire d’acide sulfurique. Nettoyez l’électrode avec 35 balayages voltélectrométriques cycliques successifs de moins 0,4 à 1,2 volts positifs contre 100 millivolts par seconde pour le calomel de mercure. Ensuite, préparez dans un tube à centrifuger à paroi mince un mélange de sonde thiolée DBP-1 de 0,5 micromolaire.

Et 0,5 micromolaire FC modifié DBP-1 dans 100 microlitres de PBS. Faites chauffer le mélange dans un bain-marie réglé à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Laissez ensuite le mélange refroidir à température ambiante dans le bain-marie.

Ajouter un microlitre d’une solution mère de TCEP de 10 millimolaires au mélange refroidi et maintenir à température ambiante pendant une heure. Plongez ensuite l’électrode d’or propre dans le mélange pendant 12 heures à température ambiante. Rincez l’électrode avec du PBS, puis plongez l’électrode dans une solution millimolaire de PEG thiolé dans du PBS pendant une heure.

Rincez abondamment l’électrode avec un tampon de liaison PAE sans cible et plongez l’électrode dans le tampon. Ensuite, des cellules électrolytiques sonicates composées d’une contre-électrode de platine et d’une électrode de référence de calomel saturé pendant deux minutes chacune dans de l’eau ultra pure et un tampon de liaison PAE en séquence. Ouvrez le logiciel de l’instrument de voltampérométrie à ondes carrées et entrez les paramètres de l’expérience.

Remplissez une cellule électrolytique propre avec un tampon de liaison PAE sans cible. Connectez les trois électrodes propres à un potentiostat et plongez les électrodes dans le tampon. Acquisition d’une analyse SWV en arrière-plan.

Plongez ensuite l’électrode de travail de l’or dans une solution de DEHP de 10 picamolaires dans un tampon de liaison PAE pendant 30 minutes à température ambiante. Rincez abondamment l’électrode avec un tampon de liaison PAE. Immergez les trois électrodes dans un tampon de liaison PAE frais et collectez une autre courbe SWV en utilisant les mêmes paramètres que précédemment.

Répétez ce processus avec des concentrations croissantes de DEHP pour obtenir une courbe de titrage. La quantité minimale d’exonucléase lambda nécessaire pour obtenir uniquement de l’ADN simple brin s’est avérée être de deux unités sur la base de réactions à petite échelle. Le candidat aptamère DBP-1 a été identifié par SELEX, suivi d’un séquençage à haut débit.

DBP-1 a montré une bonne spécificité de groupe par rapport aux congénères PAE. Un capteur aptaélectrique utilisant le DBP-1 a réagi de manière sélective au DEHP par rapport à d’autres polluants environnementaux courants. L’aptasensor était très sensible au DEHP, avec une réponse à des concentrations aussi faibles que 10 picamolaires.

Sélection et caractérisation d’aptamères pour les petites molécules hydrophobes dangereuses. La caractérisation et la volatilisation des aptamères de petites molécules hydrophobes comme les PAE sont généralement assez difficiles, en raison de la solubilité dans l’eau extrêmement limitée et du faible poids des molécules des PAE. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’un aptacapteur électrochimique et de la façon de l’utiliser pour détecter les titres.