Name: Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Découvrez le profilage ribosomique pour quantifier la traduction protéique à l'échelle du génome chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode haut débit offre une sensibilité accrue pour étudier la régulation translationnelle.

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Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions AG040191 et AG054566 à VML. Cette recherche a été menée alors que VML est un bénéficiaire d’une subvention de recherche AFAR de l’American Federation for Aging Research.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
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<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
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<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
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<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’approche de Ribo-Seq est devenue une technologie puissante pour l’analyse de l’ARNm traduction in vivo à l’échelle du génome niveau 3. Des études utilisant cette approche, qui permet de contrôler la traduction avec une résolution unique-codon, a contribué à notre compréhension de la régulation traductionnelle. Malgré ses avantages, Ribo-Seq présente plusieurs limites. Fragments d’ARN ribosomal (ARNr) sont toujours co purifiés lors de l’isolation des empreintes protégé par ribosome dimin...

traduction de l’ARNm est un processus fondamentales dans la cellule, qui joue un rôle important dans la régulation de l’expression de la protéine. Par conséquent, la traduction de l’ARNm est étroitement contrôlée en réponse à différents stimuli physiologiques internes et externes 1,2. Cependant, les mécanismes de régulation traductionnelle demeurent peu étudiées. Nous décrivons ici le protocole pour la quantification du génome entier de traduction dans la levure de bière par profilage du ribosome. L’objectif global de la technique de profilage de ribosome est d’étudier et de quantifier la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires différentes. Cette technique utilise le séquençage de la prochaine génération d’analyser quantitativement occupation ribosome dans tout le génome et permet de contrôler le taux de protéine synthèse in vivo au codon unique résolution 3,4. Actuellement, cette méthode fournit les moyens de mesurer les niveaux de la traduction des protéines les plus avancées et s’est avéré pour être un outil de découverte utiles fournissant des informations qui ne peuvent être révélées par d’autres techniques actuellement disponibles, p. ex. puces ou traduction état Tableau analyse (TSAA) 5. Ribosome profilage des rapports sur l’évolution combinée des niveaux de transcription et sortie translationnelle, il apporte aussi beaucoup plus grande sensibilité par rapport aux autres méthodes.
Cette approche est basée sur le séquençage en profondeur du ribosome-protégé de fragments de mRNA 3. Au cours de la traduction des protéines, protègent les ribosomes ~ 28 portions de nt de l' ARNm (appelé empreintes) 6. En déterminant la séquence des fragments protégé par ribosome, Ribo-Seq peut carte la position des ribosomes sur l’ARNm traduits et identifier quelles régions de l’ARNm sont susceptibles d’être activement traduit en protéine 3,7. En outre, nous pouvons mesurer quantitativement la traduction des ARNm en comptant le nombre d’empreintes de pas qui s’harmonisent à une transcription ARNm donnée.
Afin d’isoler les fragments protégé par ribosome, lysats cellulaires sont initialement traités avec un inhibiteur de la traduction à caler les ribosomes suivies par digestion de ribonucléase. Considérant que la libre ARNm et les portions des ARNm traduit ne pas protégés par les ribosomes sont dégradées par la ribonucléase, les fragments d’ADN messagère ribosome protégé peuvent être récupérés par purifiant complexes ribosome intact-empreinte. Ces empreintes d’ARNm sont ensuite convertis en ADNc et analysés par séquençage en profondeur (Figure 1). En parallèle aux ribosomes de profilage, ARNm intacte est extraite à partir du même échantillon et séquencé. En comparant le volume de traduction identifiée par Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm, nous pouvons identifier les gènes qui sont spécifiquement ou down-régulation au niveau de la traduction et calculer l’efficacité de la traduction de l’ARNm à l’échelle du génome. Alors que le protocole décrit dans cet article est spécifique pour la levure, il devrait être aussi utile pour les chercheurs qui vont tenter d’établir le protocole de Ribo-Seq dans d’autres systèmes.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu ; Filtres à membrane M</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Filtres centrifuges (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 à 4&deg ; C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X tampon TBE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10 % TBE-uréa gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15 % TBE-urée</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X tampon d’échantillon TBE-urée</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5,5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/&mu ; L)</td><td>Epicentre</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampon de chargement d’échantillons d’acide nucléique</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8 % TBE gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acide-Phénol :Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur à lumière bleue</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Billes d’acier chromé, 3,2 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryobroyeur</td><td>Produit Biospec</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de solutions de désoxynucléotide (dNTP) (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Système de fractionnement par gradient</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase haute fidélité (2 000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Fourni avec 5X Phusion HF Buffer</td></tr><tr><td>Kit de quantification de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Coloration au gel d’acide nucléique</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de l’ARNm Poly(A)</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J exonucléase (10 U/&mu ; L)</td><td>Épicentre</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse (200 U/&mu ; L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Livré avec un tampon de premier brin 5X et un tampon de fragmentation d’ARN DTT de 0,1 m</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu ; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase (20 U/&mu ; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Capuchons en caoutchouc silicone</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligase (100 U/&mu ; L)</td><td>Epicentre</td><td>CL9021K</td><td>Fourni avec tampon 10X CircLigase II et 50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Flacons en acier inoxydable, 1,8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Polynucléotide kinase T4 (10 000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Livré avec tampon polynucléotide kinase 10X T4</td></tr><tr><td>ARN ligase T4 2 KQ tronquée (200 000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Livré avec tampon ARN ligase 10X T4 et 50 % PEG8000</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>tubes polyallomères à paroi mince, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Moniteur UV</td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>souche Saccharomyces cerevisiae BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide quantification de la traduction dans la levure de bière par ribosome profilage

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Traduction de l’ARNm en protéines est un processus complexe impliquant plusieurs couches du règlement. Il est souvent supposé que les modifications dans la transcription de l’ARNm reflètent les changements dans la synthèse des protéines, mais beaucoup d’exceptions ont été observés. Récemment, une technique appelée ribosome profilage (ou Ribo-Seq) est devenue une méthode puissante qui permet d’identifier, avec précision, quelles régions de l’ARNm sont traduites en protéines et la quantification de la traduction à l’échelle du génome. Nous présentons ici un protocole généralisé pour la quantification de tout le génome de la traduction à l’aide de Ribo-Seq dans la levure de bière. En outre, combinant les données de Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm permet simultanément de quantifier l’efficacité traduction de milliers de transcriptions d’ARNm dans le même échantillon et comparer les variations de ces paramètres en réponse à l’expérimental manipulations ou dans différents États physiologiques. Les auteurs décrivent un protocole détaillé de génération d’empreintes de pas de ribosome à l’aide la digestion nucléasique, isolement des complexes ribosome intact-empreinte par fractionnement de gradients de sucrose et préparation des bibliothèques d’ADN pour le séquençage en profondeur ainsi qu’il est approprié contrôles de qualité nécessaires pour une analyse précise de la traduction de in vivo .

Détaillée des pipelines pour l’analyse bioinformatique des données de profilage de ribosomes ont été décrits précédemment 8,9. En outre, plusieurs groupes de recherche ont mis au point des outils bioinformatiques pour l’analyse de l’expression différentielle des gènes et de traitement des données de séquençage, qui sont spécifiques pour ribosome profilage méthode 10,11<sup...

Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier quelles régions de l’ARNm sont traduites en protéines, de mesurer quantitativement la traduction des protéines chez la levure bourgeonnante saccharomyces cerevisiae au niveau du génome. Le profilage des ribosomes peut être utilisé pour surveiller le taux de protéines et de maladies et pour étudier les mécanismes de régulation traductionnelle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ajoute une sensibilité beaucoup plus grande par rapport à d’autres méthodes, et parmi celles-ci, la mesure des protéines et des maladies in vivo à la résolution à contact unique.Bien que ce protocole soit spécifique aux levures en bourgeonnement, il est également utile pour les chercheurs qui tentent d’établir le profil des ribosomes dans d’autres systèmes modèles, tels que les cellules et les tissus de mammifères. Les extraits seront préparés à partir de cellules de levure cultivées jusqu’à la moitié de la phase logarithmique. Utilisez un ensemble de filtre en verre pour filtrer la culture à travers des filtres à micromembrane de 0,45.Grattez la pastille avec la spatule, congelez-la rapidement dans de l’azote liquide et conservez-la à mo

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

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Biochimie

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.

Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

Le protocole décrit ici est basé sur la quantification de Génome-large d’ARNm nouvellement synthétisées purifiée à partir de cellules de levure marquées avec 4-thio-uracile. Cette méthode permet de mesurer la synthèse d’ARNm dételée de désintégration de l’ARNm et, par conséquent, donne une mesure précise de la transcription de l’ARN polymérase II.

Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la...

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

La traduction des ribosomes décode trois nucléotides par codon en peptides. Leur mouvement le long de l’ARNm, capturé par profilage des ribosomes, produit les empreintes présentant une périodicité caractéristique du triplet. Ce protocole décrit comment utiliser RiboCode pour déchiffrer cette caractéristique importante à partir des données de profilage des ribosomes afin d’identifier les cadres de lecture ouverts activement traduits au niveau du transcriptome entier.

De novo Identification de cadres de lecture ouverts activement traduits avec des données de profilage de ribosomes

Découvrez le profilage ribosomique pour quantifier la traduction protéique à l'échelle du génome chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode haut débit offre une sensibilité accrue pour étudier la régulation translationnelle.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

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