Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

L’objectif global de cette procédure est d’identifier quelles régions de l’ARNm sont traduites en protéines, de mesurer quantitativement la traduction des protéines chez la levure bourgeonnante saccharomyces cerevisiae au niveau du génome. Le profilage des ribosomes peut être utilisé pour surveiller le taux de protéines et de maladies et pour étudier les mécanismes de régulation traductionnelle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ajoute une sensibilité beaucoup plus grande par rapport à d’autres méthodes, et parmi celles-ci, la mesure des protéines et des maladies in vivo à la résolution à contact unique.

Bien que ce protocole soit spécifique aux levures en bourgeonnement, il est également utile pour les chercheurs qui tentent d’établir le profil des ribosomes dans d’autres systèmes modèles, tels que les cellules et les tissus de mammifères. Les extraits seront préparés à partir de cellules de levure cultivées jusqu’à la moitié de la phase logarithmique. Utilisez un ensemble de filtre en verre pour filtrer la culture à travers des filtres à micromembrane de 0,45

Grattez la pastille avec la spatule, congelez-la rapidement dans de l’azote liquide et conservez-la à moins 80 degrés Celsius. Placez trois billes d’acier chromé de 3,2 millimètres dans un tube en acier inoxydable de 1,8 millilitre et pré-refroidissez le tube dans de l’azote liquide. Ajoutez les granulés congelés et couvrez le tube d’acier avec un capuchon en caoutchouc de silicone.

Homogénéiser l’échantillon par cryo-broyage pendant 10 secondes à 4200 tr/min. Pour maintenir les échantillons congelés pendant toute la procédure de broyage, il est essentiel de refroidir le tube dans de l’azote liquide pendant au moins 10 secondes entre chaque broyage. Lorsque l’homogénéisation est terminée, ajoutez un millilitre de tampon de lyse contenant du cycloheximide à l’échantillon.

Bien mélanger par pipetage et transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Centrifuger à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Transférez 100 microlitres de lysat dans un autre nouveau tube de 1,5 millilitre pour l’isolement de l’ARNm poly(A). Congelez rapidement les tubes contenant les échantillons d’ARNm sur le reste du lysat, qui seront utilisés pour l’extraction de l’empreinte dans l’azote liquide, et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. La nuit précédant l’extraction de l’empreinte, le dégel avait préalablement préparé des gradients de saccharose à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, décongelez le lysat cellulaire sur de la glace. Transférez une aliquote de lysat cellulaire contenant 50 unités OD260 dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, ajoutez un tampon de lyse frais jusqu’à un millilitre et 10 microlitres de RNase. Incuber à température ambiante avec une rotation douce sur un rotateur tête sur talons pendant une heure.

Ensuite, superposez doucement l’échantillon de lysat sur un gradient de 10 % à 50 % de saccharose dans des tubes en polymère. À l’aide d’un rotor SW41 ti, ultra centrifugeuse à 35 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Lors de l’ultra cétrifugation, mettez en place le système de fractionnement par gradient.

Allumez les composants et laissez le moniteur UV se réchauffer pendant au moins 30 minutes. Remplissez la seringue avec la solution de chasse et éliminez toutes les bulles d’air à l’intérieur de la seringue et de la canule. Lorsque l’ultracentrifugation est terminée, installez et percez le tube de l’ultracentrifugeuse contenant le gradient de saccharose.

Démarrez le pousse-seringue à un millilitre par minute et collectez des fractions d’un millilitre tout en surveillant les valeurs A254. Les fractions représentant le pic de monosome ADS sont collectées et regroupées. Filtrez les fractions à travers des filtres centrifuges de 0,5 millilitre à 12 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, jetez l’écoulement et répétez jusqu’à ce que le volume soit inférieur à 100 microlitres.

À 400 microlitres de tampon de libération mélangés par pipetage et incubés sur glace pendant 10 minutes, transférez l’unité dans un nouveau tube de collecte et centrifugez-la à 12 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Récupérez le flux continu. Par la suite, purifier les fragments d’empreinte et précipiter les échantillons à l’aide d’une précipitation à l’éthanol, comme décrit dans le protocole textuel.

Pour commencer cette procédure, centrifugez les échantillons d’empreinte précipitée et d’ARNm fragmentés à 20 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir retiré l’éthanol et séché les granulés à l’air, nous suspendons chaque granulé dans 7,75 microlitres d’eau. À chaque pastille, ajoutez un microlitre de tampon de polynucléotide kinase 10XT4, un microlitre de polynucléotide kinase T4 et 0,25 microlitre d’inhibiteur de RNase.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez 10 microlitres de tampon d’échantillon d’urée 2X TBE à 10 microlitres de chaque empreinte et échantillon d’ARNm. Incuber les échantillons et les commandes appropriées à 75 degrés Celsius pendant trois minutes, les faire tourner vers le bas et les mettre sur de la glace pendant une minute.

Chargez chaque échantillon dans deux puits d’un gel d’urée à 15 % TBE et séparez les fragments d’ARN par électrophorèse sur gel à 180 volts pendant une heure. Teignez le gel avec une coloration de gel d’acide nucléique, à l’abri de la lumière pendant cinq minutes. Tout en visualisant le gel sous un transilluminateur de lumière bleue, excisez la bande appropriée entre 28 et 32 nucléotides pour les échantillons d’empreintes et environ 50 à 70 nucléotides pour les échantillons d’ARNm.

Congelez les morceaux de gel de polyacrylamide excisés à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes avant d’extraire l’ARN du gel de polyacrylamide. Avant la transcription inverse, effectuez une ligature à trois adaptateurs principaux et précipitez les échantillons comme décrit dans le protocole de texte. Remettez en suspension chaque pastille dans 11,5 microlitres d’eau sans nucléases.

Ajoutez ensuite 0,5 microlitre d’amorce de transcription inverse de huit micromolaires et un microlitre de mélange dNTP. Incuber à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis placer sur de la glace. À chaque échantillon, ajoutez quatre microlitres de tampon 5x premier brin, deux microlitres de DTT 0,1 molaire, 0,5 microlitre d’inhibiteur de RNase et 0,5 microlitre de transcriptase inverse.

Incuber à 48 degrés Celsius pendant 30 minutes, à 65 degrés Celsius pendant une minute et à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Procéder immédiatement à l’hydrolyse de l’ARN en ajoutant 0,8 microlitre de deux molaires d’hydroxyde de sodium à chaque échantillon et en incubant à 98 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez 0,8 microlitre de chlorure d’hydrogène à deux molaires pour neutraliser la réaction.

Après avoir précipité les échantillons comme décrit dans le protocole de texte, remettre chaque pastille en suspension dans cinq microlitres d’eau sans nucléase et ajouter cinq microlitres de tampon d’échantillon d’urée 2x TBE. Incuber à 75 degrés Celsius pendant trois minutes, tourner vers le bas et glacer pendant une minute. Chargez l’échantillon dans un puits d’un gel d’urée à 10 % TBE.

Séparer les produits de la réaction de transcription inverse par électrophorèse sur gel 180 volts pendant 50 minutes. Teignez le gel avec une coloration de gel d’acide nucléique à l’abri de la lumière pendant cinq minutes. À l’aide d’un transilluminateur de lumière bleue, excisez la bande autour de 128 nucléotides et plus.

Congelez les morceaux de gel de polyacrylamide à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes avant d’extraire l’ADN du gel de polyacrylamide. Pour circulariser l’ADN, remettez en suspension chaque pastille d’ADN dans 16,75 microlitres d’eau sans nucléases. Ajoutez deux microlitres de 10 tampons d’ADN lygase simple brin, un microlitre de chlorure de manganèse 50 millimolaires et 0,25 microlitre d’ADN ligase simple brin.

Incuber à 60 degrés Celsius pendant une heure, puis à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Sans précipiter, conservez le produit de réaction de ligature de l’ADN simple brin à moins 20 degrés Celsius. Par la suite, effectuez une amplification de la banque PCR suivie d’une quantification de la bibliothèque et d’un séquençage à haut débit comme décrit dans le protocole texte.

profils représentatifs des bioanalyseurs de la banque d’empreintes amplifiées par PCR et de la banque de séquençage obtenue pour les échantillons d’ARNm sont présentés. La taille moyenne attendue de la banque d’empreintes est de 148 à 152 nucléotides, et la taille attendue de la banque d’ARNm est de 170 à 190 nucléotides. Ce graphique montre le nombre combiné de lectures d’ARNm, d’empreinte et d’ARNr obtenues pour deux réplicats biologiques indépendants d’un échantillon de type sauvage et du mutant de délétion hbs1.

50 à 60 % de toutes les lectures séquencées dans les bibliothèques d’empreintes correspondaient à des fragments d’empreintes protégés par des ribosomes. En revanche, seulement 3 % des fragments d’ARNr ont été observés dans les banques d’ARNm, ce qui démontre que l’isolement des poly(A)ARNm permet une élimination efficace des lectures d’ARNr. Les banques d’échantillons d’empreintes et d’ARNm présentent une bonne reproductibilité, comme l’indique un coefficient de corrélation de Pearson d’environ 0,99 entre les échantillons appariés.

Lorsqu’il est combiné avec des mesures d’abondance d’ARNm, le profilage des ribosomes permet de mesurer les changements d’efficacité de traduction entre les conditions expérimentales. Les gènes significativement régulés à la hausse et à la baisse dans le mutant de délétion hbs1 sont regroupés selon qu’ils sont affectés par un changement de transcription de l’ARNm, l’efficacité de la traduction ou par un effet commun. Une fois maîtrisé, l’ensemble du protocole peut être réalisé en 11 jours environ.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de porter des gants et d’effectuer toutes les étapes à l’aide de réactifs et de consommables libres de RNase pour éviter la contamination par la RNase et réduire le risque de dégradation de l’ARN dans les échantillons. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des empreintes de ribosomes à l’aide de la digestion de nucléases, d’isoler des complexes d’empreintes de ribosomes intacts par fractionnement par gradient de saccharose et de préparer des banques d’ADN pour le séquençage profond. N’oubliez pas que travailler avec de l’azote liquide peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité et de cryo-gants doivent toujours être prises lors de la manipulation de matériaux extrêmement froids.