Name: Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Découvrez le profilage ribosomique pour quantifier la traduction protéique à l'échelle du génome chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode haut débit offre une sensibilité accrue pour étudier la régulation translationnelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions AG040191 et AG054566 à VML. Cette recherche a été menée alors que VML est un bénéficiaire d’une subvention de recherche AFAR de l’American Federation for Aging Research.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’approche de Ribo-Seq est devenue une technologie puissante pour l’analyse de l’ARNm traduction in vivo à l’échelle du génome niveau 3. Des études utilisant cette approche, qui permet de contrôler la traduction avec une résolution unique-codon, a contribué à notre compréhension de la régulation traductionnelle. Malgré ses avantages, Ribo-Seq présente plusieurs limites. Fragments d’ARN ribosomal (ARNr) sont toujours co purifiés lors de l’isolation des empreintes protégé par ribosome dimin...

traduction de l’ARNm est un processus fondamentales dans la cellule, qui joue un rôle important dans la régulation de l’expression de la protéine. Par conséquent, la traduction de l’ARNm est étroitement contrôlée en réponse à différents stimuli physiologiques internes et externes 1,2. Cependant, les mécanismes de régulation traductionnelle demeurent peu étudiées. Nous décrivons ici le protocole pour la quantification du génome entier de traduction dans la levure de bière par profilage du ribosome. L’objectif global de la technique de profilage de ribosome est d’étudier et de quantifier la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires différentes. Cette technique utilise le séquençage de la prochaine génération d’analyser quantitativement occupation ribosome dans tout le génome et permet de contrôler le taux de protéine synthèse in vivo au codon unique résolution 3,4. Actuellement, cette méthode fournit les moyens de mesurer les niveaux de la traduction des protéines les plus avancées et s’est avéré pour être un outil de découverte utiles fournissant des informations qui ne peuvent être révélées par d’autres techniques actuellement disponibles, p. ex. puces ou traduction état Tableau analyse (TSAA) 5. Ribosome profilage des rapports sur l’évolution combinée des niveaux de transcription et sortie translationnelle, il apporte aussi beaucoup plus grande sensibilité par rapport aux autres méthodes.
Cette approche est basée sur le séquençage en profondeur du ribosome-protégé de fragments de mRNA 3. Au cours de la traduction des protéines, protègent les ribosomes ~ 28 portions de nt de l' ARNm (appelé empreintes) 6. En déterminant la séquence des fragments protégé par ribosome, Ribo-Seq peut carte la position des ribosomes sur l’ARNm traduits et identifier quelles régions de l’ARNm sont susceptibles d’être activement traduit en protéine 3,7. En outre, nous pouvons mesurer quantitativement la traduction des ARNm en comptant le nombre d’empreintes de pas qui s’harmonisent à une transcription ARNm donnée.
Afin d’isoler les fragments protégé par ribosome, lysats cellulaires sont initialement traités avec un inhibiteur de la traduction à caler les ribosomes suivies par digestion de ribonucléase. Considérant que la libre ARNm et les portions des ARNm traduit ne pas protégés par les ribosomes sont dégradées par la ribonucléase, les fragments d’ADN messagère ribosome protégé peuvent être récupérés par purifiant complexes ribosome intact-empreinte. Ces empreintes d’ARNm sont ensuite convertis en ADNc et analysés par séquençage en profondeur (Figure 1). En parallèle aux ribosomes de profilage, ARNm intacte est extraite à partir du même échantillon et séquencé. En comparant le volume de traduction identifiée par Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm, nous pouvons identifier les gènes qui sont spécifiquement ou down-régulation au niveau de la traduction et calculer l’efficacité de la traduction de l’ARNm à l’échelle du génome. Alors que le protocole décrit dans cet article est spécifique pour la levure, il devrait être aussi utile pour les chercheurs qui vont tenter d’établir le protocole de Ribo-Seq dans d’autres systèmes.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu ; Filtres à membrane M</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Filtres centrifuges (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 à 4&deg ; C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X tampon TBE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10 % TBE-uréa gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15 % TBE-urée</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X tampon d’échantillon TBE-urée</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5,5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/&mu ; L)</td><td>Epicentre</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampon de chargement d’échantillons d’acide nucléique</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8 % TBE gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acide-Phénol :Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur à lumière bleue</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Billes d’acier chromé, 3,2 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryobroyeur</td><td>Produit Biospec</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de solutions de désoxynucléotide (dNTP) (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Système de fractionnement par gradient</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase haute fidélité (2 000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Fourni avec 5X Phusion HF Buffer</td></tr><tr><td>Kit de quantification de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Coloration au gel d’acide nucléique</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de l’ARNm Poly(A)</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J exonucléase (10 U/&mu ; L)</td><td>Épicentre</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse (200 U/&mu ; L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Livré avec un tampon de premier brin 5X et un tampon de fragmentation d’ARN DTT de 0,1 m</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu ; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase (20 U/&mu ; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Capuchons en caoutchouc silicone</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligase (100 U/&mu ; L)</td><td>Epicentre</td><td>CL9021K</td><td>Fourni avec tampon 10X CircLigase II et 50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Flacons en acier inoxydable, 1,8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Polynucléotide kinase T4 (10 000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Livré avec tampon polynucléotide kinase 10X T4</td></tr><tr><td>ARN ligase T4 2 KQ tronquée (200 000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Livré avec tampon ARN ligase 10X T4 et 50 % PEG8000</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>tubes polyallomères à paroi mince, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Moniteur UV</td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>souche Saccharomyces cerevisiae BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide quantification de la traduction dans la levure de bière par ribosome profilage

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Traduction de l’ARNm en protéines est un processus complexe impliquant plusieurs couches du règlement. Il est souvent supposé que les modifications dans la transcription de l’ARNm reflètent les changements dans la synthèse des protéines, mais beaucoup d’exceptions ont été observés. Récemment, une technique appelée ribosome profilage (ou Ribo-Seq) est devenue une méthode puissante qui permet d’identifier, avec précision, quelles régions de l’ARNm sont traduites en protéines et la quantification de la traduction à l’échelle du génome. Nous présentons ici un protocole généralisé pour la quantification de tout le génome de la traduction à l’aide de Ribo-Seq dans la levure de bière. En outre, combinant les données de Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm permet simultanément de quantifier l’efficacité traduction de milliers de transcriptions d’ARNm dans le même échantillon et comparer les variations de ces paramètres en réponse à l’expérimental manipulations ou dans différents États physiologiques. Les auteurs décrivent un protocole détaillé de génération d’empreintes de pas de ribosome à l’aide la digestion nucléasique, isolement des complexes ribosome intact-empreinte par fractionnement de gradients de sucrose et préparation des bibliothèques d’ADN pour le séquençage en profondeur ainsi qu’il est approprié contrôles de qualité nécessaires pour une analyse précise de la traduction de in vivo .

Détaillée des pipelines pour l’analyse bioinformatique des données de profilage de ribosomes ont été décrits précédemment 8,9. En outre, plusieurs groupes de recherche ont mis au point des outils bioinformatiques pour l’analyse de l’expression différentielle des gènes et de traitement des données de séquençage, qui sont spécifiques pour ribosome profilage méthode 10,11<sup...

Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier quelles régions de l’ARNm sont traduites en protéines, de mesurer quantitativement la traduction des protéines chez la levure bourgeonnante saccharomyces cerevisiae au niveau du génome. Le profilage des ribosomes peut être utilisé pour surveiller le taux de protéines et de maladies et pour étudier les mécanismes de régulation traductionnelle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ajoute une sensibilité beaucoup plus grande par rapport à d’autres méthodes, et parmi celles-ci, la mesure des protéines et des maladies in vivo à la résolution à contact unique.Bien que ce protocole soit spécifique aux levures en bourgeonnement, il est également utile pour les chercheurs qui tentent d’établir le profil des ribosomes dans d’autres systèmes modèles, tels que les cellules et les tissus de mammifères. Les extraits seront préparés à partir de cellules de levure cultivées jusqu’à la moitié de la phase logarithmique. Utilisez un ensemble de filtre en verre pour filtrer la culture à travers des filtres à micromembrane de 0,45.Grattez la pastille avec la spatule, congelez-la rapidement dans de l’azote liquide et conservez-la à moins 80 degrés Celsius. Placez trois billes d’acier chromé de 3,2 millimètres dans un tube en acier inoxydable de 1,8 millilitre et pré-refroidissez le tube dans de l’azote liquide. Ajoutez les granulés congelés et couvrez le tube d’acier avec un capuchon en caoutchouc de silicone.Homogénéiser l’échantillon par cryo-broyage pendant 10 secondes à 4200 tr/min. Pour maintenir les échantillons congelés pendant toute la procédure de broyage, il est essentiel de refroidir le tube dans de l’azote liquide pendant au moins 10 secondes entre chaque broyage. Lorsque l’homogénéisation est terminée, ajoutez un millilitre de tampon de lyse contenant du cycloheximide à l’échantillon.Bien mélanger par pipetage et transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Centrifuger à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.Transférez 100 microlitres de lysat dans un autre nouveau tube de 1,5 millilitre pour l’isolement de l’ARNm poly(A). Congelez rapidement les tubes contenant les échantillons d’ARNm sur le reste du lysat, qui seront utilisés pour l’extraction de l’empreinte dans l’azote liquide, et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. La nuit précédant l’extraction de l’empreinte, le dégel avait préalablement préparé des gradients de saccharose à quatre degrés Celsius.Le lendemain, décongelez le lysat cellulaire sur de la glace. Transférez une aliquote de lysat cellulaire contenant 50 unités OD260 dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, ajoutez un tampon de lyse frais jusqu’à un millilitre et 10 microlitres de RNase. Incuber à température ambiante avec une rotation douce sur un rotateur tête sur talons pendant une heure.Ensuite, superposez doucement l’échantillon de lysat sur un gradient de 10 % à 50 % de saccharose dans des tubes en polymère. À l’aide d’un rotor SW41 ti, ultra centrifugeuse à 35 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Lors de l’ultra cétrifugation, mettez en place le système de fractionnement par gradient.Allumez les composants et laissez le moniteur UV se réchauffer pendant au moins 30 minutes. Remplissez la seringue avec la solution de chasse et éliminez toutes les bulles d’air à l’intérieur de la seringue et de la canule. Lorsque l’ultracentrifugation est terminée, installez et percez le tube de l’ultracentrifugeuse contenant le gradient de saccharose.Démarrez le pousse-seringue à un millilitre par minute et collectez des fractions d’un millilitre tout en surveillant les valeurs A254. Les fractions représentant le pic de monosome ADS sont collectées et regroupées. Filtrez les fractions à travers des filtres centrifuges de 0,5 millilitre à 12 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, jetez l’écoulement et répétez jusqu’à ce que le volume soit inférieur à 100 microlitres.À 400 microlitres de tampon de libération mélangés par pipetage et incubés sur glace pendant 10 minutes, transférez l’unité dans un nouveau tube de collecte et centrifugez-la à 12 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Récupérez le flux continu. Par la suite, purifier les fragments d’empreinte et précipiter les échantillons à l’aide d’une précipitation à l’éthanol, comme décrit dans le protocole textuel.Pour commencer cette procédure, centrifugez les échantillons d’empreinte précipitée et d’ARNm fragmentés à 20 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir retiré l’éthanol et séché les granulés à l’air, nous suspendons chaque granulé dans 7,75 microlitres d’eau. À chaque pastille, ajoutez un microlitre de tampon de polynucléotide kinase 10XT4, un microlitre de polynucléotide kinase T4 et 0,25 microlitre d’inhibiteur de RNase.Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez 10 microlitres de tampon d’échantillon d’urée 2X TBE à 10 microlitres de chaque empreinte et échantillon d’ARNm. Incuber les échantillons et les commandes appropriées à 75 degrés Celsius pendant trois minutes, les faire tourner vers le bas et les mettre sur de la glace pendant une minute.Chargez chaque échantillon dans deux puits d’un gel d’urée à 15 % TBE et séparez les fragments d’ARN par électrophorèse sur gel à 180 volts pendant une heure. Teignez le gel avec une coloration de gel d’acide nucléique, à l’abri de la lumière pendant cinq minutes. Tout en visualisant le gel sous un transilluminateur de lumière bleue, excisez la bande appropriée entre 28 et 32 nucléotides pour les échantillons d’empreintes et environ 50 à 70 nucléotides pour les échantillons d’ARNm.Congelez les morceaux de gel de polyacrylamide excisés à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes avant d’extraire l’ARN du gel de polyacrylamide. Avant la transcription inverse, effectuez une ligature à trois adaptateurs principaux et précipitez les échantillons comme décrit dans le protocole de texte. Remettez en suspension chaque pastille dans 11,5 microlitres d’eau sans nucléases.Ajoutez ensuite 0,5 microlitre d’amorce de transcription inverse de huit micromolaires et un microlitre de mélange dNTP. Incuber à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis placer sur de la glace. À chaque échantillon, ajoutez quatre microlitres de tampon 5x premier brin, deux microlitres de DTT 0,1 molaire, 0,5 microlitre d’inhibiteur de RNase et 0,5 microlitre de transcriptase inverse.Incuber à 48 degrés Celsius pendant 30 minutes, à 65 degrés Celsius pendant une minute et à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Procéder immédiatement à l’hydrolyse de l’ARN en ajoutant 0,8 microlitre de deux molaires d’hydroxyde de sodium à chaque échantillon et en incubant à 98 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez 0,8 microlitre de chlorure d’hydrogène à deux molaires pour neutraliser la réaction.Après avoir précipité les échantillons comme décrit dans le protocole de texte, remettre chaque pastille en suspension dans cinq microlitres d’eau sans nucléase et ajouter cinq microlitres de tampon d’échantillon d’urée 2x TBE. Incuber à 75 degrés Celsius pendant trois minutes, tourner vers le bas et glacer pendant une minute. Chargez l’échantillon dans un puits d’un gel d’urée à 10 % TBE.Séparer les produits de la réaction de transcription inverse par électrophorèse sur gel 180 volts pendant 50 minutes. Teignez le gel avec une coloration de gel d’acide nucléique à l’abri de la lumière pendant cinq minutes. À l’aide d’un transilluminateur de lumière bleue, excisez la bande autour de 128 nucléotides et plus.Congelez les morceaux de gel de polyacrylamide à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes avant d’extraire l’ADN du gel de polyacrylamide. Pour circulariser l’ADN, remettez en suspension chaque pastille d’ADN dans 16,75 microlitres d’eau sans nucléases. Ajoutez deux microlitres de 10 tampons d’ADN lygase simple brin, un microlitre de chlorure de manganèse 50 millimolaires et 0,25 microlitre d’ADN ligase simple brin.Incuber à 60 degrés Celsius pendant une heure, puis à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Sans précipiter, conservez le produit de réaction de ligature de l’ADN simple brin à moins 20 degrés Celsius. Par la suite, effectuez une amplification de la banque PCR suivie d’une quantification de la bibliothèque et d’un séquençage à haut débit comme décrit dans le protocole texte.Les profils représentatifs des bioanalyseurs de la banque d’empreintes amplifiées par PCR et de la banque de séquençage obtenue pour les échantillons d’ARNm sont présentés. La taille moyenne attendue de la banque d’empreintes est de 148 à 152 nucléotides, et la taille attendue de la banque d’ARNm est de 170 à 190 nucléotides. Ce graphique montre le nombre combiné de lectures d’ARNm, d’empreinte et d’ARNr obtenues pour deux réplicats biologiques indépendants d’un échantillon de type sauvage et du mutant de délétion hbs1.50 à 60 % de toutes les lectures séquencées dans les bibliothèques d’empreintes correspondaient à des fragments d’empreintes protégés par des ribosomes. En revanche, seulement 3 % des fragments d’ARNr ont été observés dans les banques d’ARNm, ce qui démontre que l’isolement des poly(A)ARNm permet une élimination efficace des lectures d’ARNr. Les banques d’échantillons d’empreintes et d’ARNm présentent une bonne reproductibilité, comme l’indique un coefficient de corrélation de Pearson d’environ 0,99 entre les échantillons appariés.Lorsqu’il est combiné avec des mesures d’abondance d’ARNm, le profilage des ribosomes permet de mesurer les changements d’efficacité de traduction entre les conditions expérimentales. Les gènes significativement régulés à la hausse et à la baisse dans le mutant de délétion hbs1 sont regroupés selon qu’ils sont affectés par un changement de transcription de l’ARNm, l’efficacité de la traduction ou par un effet commun. Une fois maîtrisé, l’ensemble du protocole peut être réalisé en 11 jours environ.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de porter des gants et d’effectuer toutes les étapes à l’aide de réactifs et de consommables libres de RNase pour éviter la contamination par la RNase et réduire le risque de dégradation de l’ARN dans les échantillons. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des empreintes de ribosomes à l’aide de la digestion de nucléases, d’isoler des complexes d’empreintes de ribosomes intacts par fractionnement par gradient de saccharose et de préparer des banques d’ADN pour le séquençage profond. N’oubliez pas que travailler avec de l’azote liquide peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité et de cryo-gants doivent toujours être prises lors de la manipulation de matériaux extrêmement froids.

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.

Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

Le protocole décrit ici est basé sur la quantification de Génome-large d’ARNm nouvellement synthétisées purifiée à partir de cellules de levure marquées avec 4-thio-uracile. Cette méthode permet de mesurer la synthèse d’ARNm dételée de désintégration de l’ARNm et, par conséquent, donne une mesure précise de la transcription de l’ARN polymérase II.

Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la...

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

La traduction des ribosomes décode trois nucléotides par codon en peptides. Leur mouvement le long de l’ARNm, capturé par profilage des ribosomes, produit les empreintes présentant une périodicité caractéristique du triplet. Ce protocole décrit comment utiliser RiboCode pour déchiffrer cette caractéristique importante à partir des données de profilage des ribosomes afin d’identifier les cadres de lecture ouverts activement traduits au niveau du transcriptome entier.

De novo Identification de cadres de lecture ouverts activement traduits avec des données de profilage de ribosomes

Découvrez le profilage ribosomique pour quantifier la traduction protéique à l'échelle du génome chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode haut débit offre une sensibilité accrue pour étudier la régulation translationnelle.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Explorer plus de vidéos