Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement

L’objectif principal de cette procédure est d’analyser la qualité du sperme de poisson en fonction de la motilité des spermatozoïdes afin de contribuer à la réussite de la fécondation artificielle. Je suis le Dr Carles Soler, professeur à l’Université de Valence et directeur scientifique de PROiSER R+D. Je m’appelle Carina Caldeira, je suis boursière du projet Impress.

La technologie CASA a été mise au point il y a quelques décennies pour l’analyse du sperme des espèces de mammifères à l’aide d’une analyse du sperme assistée par ordinateur. Dans le cas du poisson, il est nécessaire de prendre en compte deux choses. Le premier est le fait que ces animaux fertilisent normalement à des températures basses, autour de quatre degrés, et pour cette raison, il n’est pas possible d’analyser le sperme à la température domestique, mais il est nécessaire de développer des outils spécifiques pour réfrigérer les échantillons.

L’autre problème, c’est que la motilité diminue très rapidement après l’activation, et il est nécessaire d’analyser ce fait, de définir ce qui est un bon moment pour l’analyse de la qualité, ou de la qualité du sperme. Nous allons donc montrer l’analyse des spermatozoïdes de poissons, et ce protocole sera une modification du protocole des mammifères, et inclura une analyse de motilité à l’aide de Alors, commençons. Les poissons sont anesthésiés pour l’injection d’hormones, et des échantillons de sperme sont prélevés 24 heures plus tard.

La zone génitale est nettoyée pour éviter toute contamination. Les spermatozoïdes sont collectés en appliquant une légère pression. Les échantillons de sperme sont conservés à quatre degrés, jusqu’à ce que des analyses de motilité soient effectuées.

Le dilueur et l’activateur sont préparés au préalable. Réglez le bloc refroidisseur à quatre degrés pour maintenir les échantillons à une température constante. Attendez qu’il se stabilise.

Diluer les échantillons de sperme à l’aide du dilueur spécifique à chaque espèce. Pour l’anguille européenne, les spermatozoïdes sont dilués dans le milieu P1, avec un rapport de 1:50. Préparez 500 microlitres de sperme dilué, en ajoutant 450 microlitres de P1 et 50 microlitres d’échantillon de sperme frais.

Bien mélanger. Prenez un aliquarter de solution activatrice et placez-le dans le bloc refroidisseur. Réglez l’étage plus froid à quatre degrés.

Attendez qu’il se stabilise. Sélectionnez le module de motilité et, si nécessaire, utilisez un nom et un mot de passe. Choisissez les propriétés.

Cliquez sur l’espèce et sélectionnez poisson. Sélectionnez le nombre d’images par seconde et le nombre d’images que vous souhaitez utiliser. Il est obligatoire d’utiliser un contraste négatif.

Sélectionnez la chambre de comptage et l’échelle correspondantes. Pour chaque espèce, adaptez la surface des particules et la connectivité. Pour l’anguille européenne, la surface minimale de particules devrait être de deux et la connectivité de sept.

Enregistrez la configuration. Ouvrez la capture. Prenez quatre microlitres de solution activatrice et placez-les dans la chambre.

Homogénéisez bien les spermatozoïdes dilués. Prenez 5 microlitres de sperme et mélangez-les avec un activateur. Placez le couvercle.

Concentrez-vous sur l’échantillon et trouvez la meilleure zone visuelle. Sélectionnez la capture vidéo pour obtenir des traces de spermatozoaires, qui sont séparées en fonction de la vitesse. D’autres champs peuvent être capturés.

Sélectionnez capturer et procédez comme précédemment. Cliquez sur quitter pour obtenir une vue générale de tous les champs. Les captures de spermatozoïdes ont été effectuées à des intervalles de temps précis après l’activation.

Cependant, une analyse des spermatozoïdes a été effectuée pour chaque répétition d’intervalle de temps. Le rapport partiel pour chaque intervalle de temps peut être obtenu en sélectionnant des champs et en cliquant sur partiel. La feuille Excel fournit les valeurs moyennes de données partielles, des graphiques et des images des traces de spermatozoïdes.

Répétez la même procédure pour les autres champs. L’autre option est celle des données générales. Ces données fournissent des valeurs cinétiques pour des spermatozoïdes individuels de tous les champs.

Avec le rapport partiel, le pourcentage de motilité et de progressivité pour les différents temps peut être comparé immédiatement, à l’aide de graphiques circulaires. Les données générales donnent la possibilité d’obtenir plusieurs analyses statistiques à l’aide des paramètres cinétiques. Les traces de spermatozoïdes donnent trois paramètres.

VCL, vitesse curvilinale, VSL, vitesse progressive, et VAP, vitesse de trajet. La VCL est le paramètre le plus important et change avec le nombre d’images par seconde. En augmentant le nombre de cadres, la VCL augmente également, ce qui permet une analyse presque parfaite de la piste.

La meilleure fréquence d’images peut varier selon les espèces. L’objectif est de trouver la valeur la plus élevée de VCL, après quoi toute différence potentielle avec d’autres outils, tels que les chambres de comptage, peut être observée. Les sous-populations sont actuellement une analyse statistique importante qui donne plus d’informations sur l’échantillon de sperme.

Voici un exemple d’échantillons de sperme de saumon de l’Atlantique. Différentes sous-populations de spermatozoïdes peuvent être observées dans différentes générations produites en captivité. Nous avons montré comment utiliser un système informatique pour l’analyse du sperme des poissons, et aussi comment optimiser les aspects techniques et méthodologiques tels que la chambre de comptage, la température et les fréquences d’images.

Ainsi, avec ces données, nous pouvons faire beaucoup d’analyses dans différents domaines, comme l’élevage de poissons, non seulement pour l’aquaculture, mais aussi pour des programmes de conservation, des études phylogénétiques, ou pour accroître les connaissances sur la population de spermatozoïdes. J’espère donc que ce protocole vous aidera dans vos études.