Name: Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Découvrez l'analyse de sperme de poissons par CASA avec contrôle thermique à 4°C. Cette méthode évalue la motilité des spermatozoïdes pour améliorer la fécondation artificielle en aquaculture.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce projet a reçu un financement de l’Association de coût (l’alimentation et l’Agriculture coût Action FA1205 : AQUAGAMETE et programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne en vertu de la Marie Sklodowska-Curie du projet IMPRESS (GA No 642893). Nous tenons à remercier toute l’équipe scientifique de PROiSER, plus précisément à l’étudiant Alberto Vendrell Bernabéu, pour sa participation active dans l’enregistrement vidéo de ce projet.

Procédures avec des sujets animaux ont été approuvées (2015/VSC/pois/00064) par la Direction générale de la Production agricole et l’élevage à l’Universitat Politècnica de València.
1. recueillir des spermatozoïdes d’anguilles européennes matures en captivité
Remarque : Utilisation anguille européenne les mâles maintenus dans des réservoirs avec l’eau de mer et un système de recirculation à température constante (20 ° C). Traiter avec des hormones par injection intrapéritonéale hebdomadaire (gonadotrophine chorionique humaine (hCG) ; 1,5 UI / g de poids poisson). Acclimater les poissons graduellement à partir de 3 jours en eau douce suivie de remplacement avec l’eau de mer (1/3 de l’eau dans le réservoir) tous les 2 jours jusqu'à arriver à une salinité de 37,0 g/mL.
<ol><li>Anesthésier l’anguille 24 h après l’injection d’hormones pour prélever des échantillons avec une meilleure qualité de sperme.<ol>
<li>Avant l’anesthésie au préalable : ajouter 300 mg de benzocaïne à 100 mL d’éthanol à 70 %. Bien mélanger et conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Diluer dans un seau flexible avec 5 L d’eau du système pour obtenir une concentration finale de 60 mg/L et de mélanger correctement la benzocaïne.</li>
		<li>Transférer le poisson dans le seau d’eau de système et de la benzocaïne. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le poisson se calme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effacer les parties génitales avec de l’eau et sécher avec du papier absorbant pour éviter la contamination des échantillons de sperme par les matières fécales, urine ou l’eau de mer.</li>
	<li>Appliquez une légère pression dans la région abdominale et recueillir des échantillons de sperme dans des tubes en plastique 15 mL à l’aide de la pompe à vide. Volume de sperme jusqu'à 6-7 mL, dépendant de l’homme.</li>
	<li>Conserver les échantillons de sperme à 4 ° C pendant au moins 1 h jusqu'à ce que la motilité analyse est effectuée.</li>
</ol>2. conserver au réfrigérateur et de diluer les échantillons de sperme
<ol><li>Préparer la solution DILUTEUR au préalable. Remarque : Les échantillons de sperme doivent être dilués dans la solution d’extension spécifique pour chaque espèce.<ol>
<li>Préparer le milieu non-activator pour les échantillons de sperme anguille (P1 moyen). Ajouter 0,42 g de bicarbonate de sodium, 1,828 g de chlorure de sodium, 0,127 g de chlorure de magnésium, 0,56 g de chlorure de potassium et 0,037 g de chlorure de calcium à 250 mL d’eau distillée. Mélange bien à dissoudre. Conserver à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Définir le bloc refroidisseur à 4 ° C pour conserver les échantillons à une température constante. Attendez que la température se stabilise.</li>
	<li>Diluer les échantillons de sperme à l’aide de DILUTEUR solution spécifique pour chaque espèce. Remarque : Le coefficient de dilution est spécifique à l’espèce et doit être défini afin de standardiser le protocole. Tout d’abord, évaluer la concentration des spermatozoïdes après la concentration obtenue dans l’analyse préalable de la motilité utilisant le logiciel, comme indiqué dans les étapes 3 et 4. Avec cette analyse, il est également possible de sélectionner les meilleurs échantillons de sperme selon le pourcentage de la motilité. Après cela, le chercheur peut commencer à collecter les données de l’expérience en utilisant les meilleurs échantillons avec la concentration correcte.<ol>
<li>Diluer les échantillons de sperme anguille dans le milieu de la P1 avec un ratio de 01:50. Pour préparer 500 µL de sperme anguille dilué, ajouter 50 µL de l’échantillon de sperme frais et 450 µL de P1. Bien mélanger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. évaluer les paramètres de la motilité de sperme
<ol><li>
Mise en place du Module de motilité du logiciel
	<ol>
<li>Préparer un refroidisseur à 4 ° C et attendre qu’il se stabilise.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel et sélectionnez Le Module de motilité. Créer le nom d’utilisateur et mot de passe si nécessaire.</li>
		<li>Sélectionnez Propriétés et choisissez les paramètres souhaités avant de commencer l’analyse du sperme.<ol>
<li>Cliquez sur espèces | Poissons.</li>
			<li>Sélectionnez Nombre d’Images, Images par seconde et selon les meilleures conditions techniques pour chaque espèce. Définissez les deux options à 120 images par seconde.</li>
			<li>Choisissez le contraste négatif. Il est obligatoire pour une reconstruction exacte des spermatozoïdes trajectoires16.</li>
			<li>Sélectionnez la correspondante Chambre de comptage et l' échelle de la caméra vidéo. Calibrer la caméra vidéo pour la lentille de grossissement utilisée dans l’expérience. Définir SpermTrack10 comme chambre de comptage et échelle de X 10. Remarque : en général, une profondeur de 10 µm dans la chambre de comptage et une lentille de grossissement de 10 X sont les conditions recommandées car elles fournissent la meilleure mise au point de tous les spermatozoïdes et capturent le plus grand nombre de cellules. Toutefois, il est recommandé de réaliser une étude précédente sur les conditions optimales pour l’analyse de la motilité de chaque espèce.</li>
			<li>Ajustez la Zone de particules et de la connectivité pour chaque espèce. Définir zone minimale de particules à 2 µm2 et la connectivité à 7 µm. Remarque : Pour les poissons, la valeur minimale de la plage s’étend entre 2 à 5 µm et la connectivité des particules dépend de la vélocité des spermatozoïdes et la cadence.</li>
			<li>Enregistrer la mise en place.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sélectionnez Capture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse de sperme anguille européenne avec le logiciel
	<ol>
<li>Préparer la solution d’activateur (eau de mer artificielle) en ajoutant 0,946 g de sel commercial à 25 mL d’eau distillée avec 2 % de BSA.</li>
		<li>Prenez 500 mL de solution d’activateur (eau de mer artificielle) et placer dans le bloc refroidisseur. Remarque : en général, poisson sperme est activé par un événement choc osmotique, bien que pour certaines espèces, la concentration en ions pourrait aussi être importante. Pour les espèces d’eau douce, le milieu de l’activateur devrait avoir osmolalité hypotonique, tandis que les espèces marines, le milieu doit être hypertonique.</li>
		<li>Mettre la chambre de comptage dans l’étape de refroidissement et attendez que la température se stabilise à 4 ° C.</li>
		<li>Mélanger le déclencheur et le sperme dilué pour activer les spermatozoïdes et lancer la vidéo de la motilité d’enregistrement entre 5-10 s après l’activation.<ol>
<li>Prendre 4 µL de solution d’activateur et place dans la chambre de comptage.</li>
			<li>Homogénéiser doucement le sperme dilué en secouant la microcentrifugeuse 3 fois pour éviter des dommages dans les cellules des spermatozoïdes.</li>
			<li>Prendre 0,5 µL de sperme dilué, mixer avec l’activateur et mettez le couvercle dans la chambre de comptage rapidement. Remarque : Cette étape ne devrait pas prendre plus de 5 s pour commencer l’analyse dès que possible.</li>
			<li>Mettre l’accent sur les cellules des spermatozoïdes et trouver la meilleure zone visuelle, qui est définie par un faible nombre de spermatozoïdes (150 à 200 cellules) pour éviter l’interception entre les cellules (Supplemental Figure 1 a). Sélectionnez Capture vidéo pour obtenir les pistes de spermatozoïdes, qui sont séparées en fonction de la vitesse.</li>
			<li>Sélectionnez capturer pour obtenir 3 à 7 champs, qui sont l’intervalle optimal pour obtenir une faible variabilité dans les résultats et procédez comme ci-dessus. Enregistrer des vidéos jusqu'à 120 s après l’activation afin d’éviter la condensation sur le couvercle de la chambre de comptage.</li>
			<li>Appuyez sur Exit pour avoir une vue générale de tous les champs.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. obtenir des données de motilité
<ol><li>Sélectionnez les champs de | Partielle | Enregistrer et choisir un nom de fichier. Cliquez sur Enregistrer. NOTE : La feuille de calcul donne des valeurs moyennes des données partielles, des graphiques et des images de morceaux de spermatozoïdes.</li>
	<li>Sélectionnez les données générales de | Nom du fichier | Enregistrer. NOTE : Les données fournissent les valeurs cinétiques pour les spermatozoïdes individuels de tous les champs.</li>
</ol>

<ol><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166445X96008065">Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals.</a> Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Bobe, J., Labbé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+and+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Egg and sperm quality in fish.</a> General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).</li>
<li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848603008330">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234, 1-28 (2004).</li>
<li>Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+reproductive+competition+in+spawning+aggregations+of+cod+%28Gadus+morhua%2C+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.).</a> Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).</li>
<li>Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+laboratory+test%3A+the+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">The neglected laboratory test: the semen analysis.</a> Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).</li>
<li>Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+tests+for+human+male+reproductive+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Teratogenesis%2C+Carcinogenesis%2C+and+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Laboratory tests for human male reproductive risk assessment.</a> Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).</li>
<li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+European+eel+%28Anguilla+anguilla%29+sperm+motility+evaluation+by+CASA+software%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software.</a> Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).</li>
<li>Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0426.2010.01529.x">Evaluation of fish sperm quality.</a> Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).</li>
<li>Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+observations+of+flagellar+motility+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).</li>
<li>Bompart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASA-Mot+technology%3A+How+results+are+affected+by+the+frame+rate+and+counting+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Vladić, T., Järvi, T. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1095-8649.1997.tb01632.x">Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature.</a> Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).</li>
<li>Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11245263">Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus).</a> Theriogenology. 55, 751-769 (2001).</li>
<li>Cosson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+fish+spermatozoa%3A+racing+ephemeral+swimmers%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers.</a> Reproduction. 136, 277-294 (2008).</li>
<li>Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+best+frame+rate+for+evaluation+of+sperm+motility+in+different+species+by+computer-assisted+sperm+analysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?</a> Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holographic+solution+for+sperm+motility+analysis+in+boar+samples.+Effect+of+counting+chamber+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo+method+of+measuring+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A photo method of measuring sperm motility.</a> Journal of Animal Science. 37, 310(1973).</li>
<li>Katz, D. F., Dott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+measuring+swimming+speed+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Methods of measuring swimming speed of spermatozoa.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).</li>
<li>Liu, Y. T., Warme, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+evaluation+of+sperm+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Computerized evaluation of sperm cell motility.</a> Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).</li>
<li>Jecht, E. W., Russo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+the+quantitative+analysis+of+human+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">A system for the quantitative analysis of human sperm motility.</a> Andrologia. 5, 215-221 (1973).</li>
<li>Holt, W. V., Palomo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+continuous+real-time+computerized+semen+analysis+system+for+ram+sperm+motility+assessment%2C+and+evaluation+of+four+methods+of+semen+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation.</a> Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).</li>
<li>Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description%2C+validation%2C+and+performance+characteristics+of+a+new+computer-automated+sperm+motility+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system.</a> Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).</li>
<li>Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+CellSoft+automated+semen+analysis+system+in+a+routine+laboratory+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting.</a> Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+of+capacitating+human+spermatozoa+analysed+at+60+Hz%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz.</a> Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).</li>
<li>Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+interpretation+of+computer-assisted+sperm+analyses+and+sperm+sorting+methods+in+assisted+breeding+and+comparative+research%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research.</a> Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).</li>
<li>Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+two+computerized+semen+motility+analyzers%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Comparative study of two computerized semen motility analyzers.</a> Andrologia. 20, 433-440 (1988).</li>
<li>Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2254179">A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion.</a> Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).</li>
<li>Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis%3A+Evaluation+of+method+and+assessment+of+the+influence+of+sperm+concentration+on+linear+velocity+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination.</a> Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Scherr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+numerical+simulation+as+methods+for+standardization+of+zebrafish+sperm+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation.</a> Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+image+sampling+frequency+on+established+and+smoothing-independent+kinematic+values+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).</li>
<li>Hoogewijs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+counting+chamber+type+on+CASA+outcomes+of+equine+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis.</a> Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/289987642_Effect_of_counting_chamber_on_seminal_parameters_analyzing_with_the_ISASv1_R">Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®.</a> Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).</li>
<li>Didion, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis+and+its+utility+for+profiling+boar+semen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples.</a> Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).</li>
<li>David, G., Serres, C., Jouannet, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2384341">Kinematics of human spermatozoa.</a> Gamete Research. 4, 83-95 (1981).</li>
<li>Björndahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+semen+quality%3F+On+the+use+and+abuse+of+reference+limits+for+the+interpretation+of+semen+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results.</a> Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).</li>
<li>Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57, 149-179 (2002).</li>
<li>Alavia, S. M. H., Cosson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+motility+in+fishes.+I.+Effects+of+temperature+and+pH%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review.</a> Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).</li>
<li>Islam, M. S., Akhter, T. <a target="_blank" href="http://article.sapub.org/10.5923.j.als.20110101.03.html">Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review.</a> Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).</li>
<li>Dadras, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+common+carp+Cyprinus+carpio+sperm+motility+and+lipid+composition+using+different+in+vitro+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures.</a> Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).</li>
<li>Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+and+subpopulations%27+structure+definition+of+blue+fox+%28Alopex+lagopus%29+sperm+motility+using+the+ISASV1+CASA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system.</a> Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).</li>
<li>Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermiogram+and+sperm+head+morphometry+assessed+by+multivariate+cluster+analysis+results+during+adolescence+%2812-18+years%29+and+the+effect+of+varicocele%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+sperm+head+morphometry%3A+its+diversity+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution.</a> Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).</li>
<li>Valverde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+and+subpopulation+structure+of+Holstein+bull+spermatozoa%3A+variations+in+ejaculates+and+cryopreservation+straws%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le logiciel d’analyse de sperme utilisé dans le présent protocole a servi par des chercheurs dans le monde entier pour les différentes espèces, y compris les poissons. Cependant, les poissons ont certaines caractéristiques spécifiques qui peuvent influer sur l’évaluation de sperme. Spermatozoïdes de poissons a montré la grande vitesse au moment de l’activation qui décline rapidement et mène à une courte période de motilité après activation. En outre, la température de reproduction dépend de l’espèce et, dans certains cas...

L’efficacité de la reproduction dépend de la qualité de ces deux gamètes (oeufs et du sperme)1,2. C’est le principal facteur qui contribue à une fécondation réussie, permettant le développement d’une descendance viable3,4. L’évaluation pratique de la qualité des gamètes est le meilleur outil pour définir le potentiel de fécondité d’un spécimen.
Mélange de spermatozoïdes provenant de plusieurs mâles est une pratique courante dans la production de nombreuses espèces commerciales aquatique4. Cependant, la variabilité de sperme entre mâles peut conduire à la compétition spermatique et, par conséquent, pas tous les hommes contribuent également au pool génétique5. En ce sens, l’évaluation correcte des fonctionnalités de chaque éjaculat/spermatozoïdes, tels que la motilité, est fondamentale pour obtenir des informations au sujet de la fertilité masculine individuelle potentiel discriminatoires. L’observation directe de la motilité des spermatozoïdes peut produire des données inexactes et subjectives car elle nécessite temps et l’expérience, ce qui conduit à un manque d’uniformité et d’incompatibilité des résultats6,7. Cependant, il y a beaucoup de techniques innovantes, rapides et quantitatives qui peut fournir un sperme fiable qualité analyse2,4.
Spermogramme assistée par ordinateur a été développé pour offrir des données précises sur la qualité de sperme8. Cette technologie comprend le développement d’un logiciel associé à un microscope à contraste de phase qui permet l’évaluation de la motilité des spermatozoïdes. Cependant, un facteur limitatif du paramètre de la motilité est la fréquence d’images de la caméra vidéo. Spermatozoïdes individuels trajectoires sont basés sur les spermatozoïdes tête position centroïde dans images consécutives d’enregistrements vidéo, qui est en corrélation avec le mouvement flagellaire patrons3,9,10, 11. les principaux paramètres cinétiques mesurés sont la vitesse linéaire (VSL), la vitesse curviligne (VCL) et la vitesse moyenne des chemins (VAP). VSL est la distance entre le début et le virage pris par les spermatozoïdes divisés par le temps. VCL est la vitesse réelle le long de la trajectoire exacte prise par les spermatozoïdes. VAP est la vitesse sur un tracé lissée dérivée de trajectoire. Ces paramètres permettent de plus d’informations cinétiques, y compris linéarité (LIN), rectitude (STR), wobble (WOB) et battant mesures comme l’amplitude de mouvement latéral de la tête (ALH) et la fréquence de battement-Croix (BCF)4,10.
Le système d’analyse de sperme a été initialement utilisé pour les espèces de mammifères, et l’une des exigences pour le système doit fonctionner à la température du corps du donneur (environ 37 ° C). Ce logiciel pourrait également être utilisé pour les espèces de poissons ; mais, il est nécessaire de faire quelques adaptations afin de réduire l’erreur des résultats d’analyse de sperme. Chez certaines espèces de poissons, tels que les salmonidés et les anguilles8,12, la fécondation a eu lieu à basse température (environ 4 ° C)2,4. Ainsi, les dispositifs de refroidissement devraient être élaboré afin d’éviter des conditions de travail pénibles. En outre, les spermatozoïdes de poissons sont immobiles dans le liquide séminal et nécessitent un choc osmotique pour activer la motilité. Pour les espèces d’eau douce, le milieu de l’activateur devrait avoir osmolalité hypotonique, tandis que les espèces marines, le milieu doit être hypertonique. Toutefois, pour certaines espèces, comme les salmonidés, la concentration en ions pourrait également être important3,4,9. Après activation, poisson sperme est caractérisé par une rapide diminution de la motilité (moins de 2 min)13,14 et haute vitesse, étant essentiel pour déterminer la fréquence d’images optimale afin d’obtenir des données fiables15.
Cette étude vise à concevoir et appliquer des systèmes de réfrigération pour les échantillons de sperme de poissons. En outre, ce protocole définit comment déterminer la cadence optimale pour la mise en place de protocoles normalisés selon les espèces. L’utilisation de ce protocole ouvre de nouveaux horizons dans le cadre de l’évaluation séminal du poisson, à l’aide de l’anguille européenne comme un modèle.

<table><tbody><tr><td>Gonadotrophine chorionique humaine</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>hCG</td><td>Hormone</td></tr><tr><td>Benzocaïne</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>Anesthésie</td></tr><tr><td>bicarbonate de sodium</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma&nbsp ;</td><td>P1 moyen</td></tr><tr><td>chlorure de sodium</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 chlorure de</td></tr><tr><td>magnésium</td> moyen <td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 chlorure de</td></tr><tr><td>potassium</td><td>moyen Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 chlorure de</td></tr><tr><td>calcium</td> moyen <td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1</td></tr><tr><td>sel commercial</td> moyen <td>Aqua Medic ;</td><td>Meersalz</td><td>Activator solution&nbsp ;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>Activator solution&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes Falcon 15 ml</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon support</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfs</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 20 &micro ; l</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&reg ; </td> Micropipet classique <td></td></tr><tr><td>10 & micro ; l</td><td>Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Embouts pour micropipets 20 &micro ; l</td><td>Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Embouts pour micropipets 10 &micro ; l</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td> Chambre <td></td><td>de comptage</td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td> Microscope <td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>UB 200i Série</td><td>PROiSER</td><td>Microscope</td><td></td></tr><tr><td>Plaque réfrigérante</td><td>PROiSER Prototype PROiSER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloc réfrigérant</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>Logiciel PROiSER</td><td>ISAS</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Pour l’évaluation de qualité de gamètes, il y a des techniques innovantes, rapides et quantitatives pouvant fournir des données utiles pour l’aquaculture. Systèmes informatisés pour l’analyse du sperme ont été développées pour mesurer plusieurs paramètres et un du plus souvent mesurée est la motilité des spermatozoïdes.
Au départ, cette technologie informatique a été conçue pour les espèces de mammifères, mais il peut également être utilisé pour l’analyse de sperme des poissons. Les poissons ont des caractéristiques spécifiques qui peuvent affecter le sperme évaluation comme un temps de motilité court après l’activation et, dans certains cas, adaptation aux températures inférieures. Ainsi, il est nécessaire de modifier les composants logiciels et du matériel pour faire l’analyse de motilité plus efficace pour l’analyse du sperme poisson. Pour des spermatozoïdes chez les mammifères, la plaque chauffante est utilisée pour maintenir les températures optimales de spermatozoïdes. Toutefois, pour certaines espèces de poissons, il est avantageux d’utiliser une température plus basse pour prolonger la durée de la motilité, étant donné que les spermatozoïdes restent actives pendant moins de 2 min. Dispositifs de refroidissement sont donc nécessaires de réfrigérer les échantillons à température constante pendant la durée de l’analyse, le microscope optique. Ce protocole décrit l’analyse de la motilité de sperme du poisson à l’aide de logiciels pour l’analyse du sperme et de nouveaux dispositifs afin d’optimiser les résultats de refroidissement.

Analyse de l’effet du temps sur la motilité des spermatozoïdes
Dans le cas de l’anguille européenne, le pourcentage de spermatozoïdes statiques est passée de 15 s à 120 s après l’activation (à partir de 24,4 % à 40,7 %) et le pourcentage de spermatozoïdes progressives mobiles a diminué (passant de 36,9 % à 20,9 %) (Figure 1 a et 1 b). Basé sur la vitesse, cellules s...

Le présent protocole décrit une procédure d’évaluation de sperme du poisson à l’aide de spermogramme assistée par ordinateur et de dispositifs de refroidissement. Le logiciel donne un rapide, précis et l’analyse quantitative de la qualité du sperme poisson basée sur la motilité des spermatozoïdes, qui peut être un outil utile pour l’aquaculture afin d’améliorer le succès de la reproduction.

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

L’objectif principal de cette procédure est d’analyser la qualité du sperme de poisson en fonction de la motilité des spermatozoïdes afin de contribuer à la réussite de la fécondation artificielle. Je suis le Dr Carles Soler, professeur à l’Université de Valence et directeur scientifique de PROiSER R+D. Je m’appelle Carina Caldeira, je suis boursière du projet Impress.La technologie CASA a été mise au point il y a quelques décennies pour l’analyse du sperme des espèces de mammifères à l’aide d’une analyse du sperme assistée par ordinateur. Dans le cas du poisson, il est nécessaire de prendre en compte deux choses. Le premier est le fait que ces animaux fertilisent normalement à des températures basses, autour de quatre degrés, et pour cette raison, il n’est pas possible d’analyser le sperme à la température domestique, mais il est nécessaire de développer des outils spécifiques pour réfrigérer les échantillons.L’autre problème, c’est que la motilité diminue très rapidement après l’activation, et il est nécessaire d’analyser ce fait, de définir ce qui est un bon moment pour l’analyse de la qualité, ou de la qualité du sperme. Nous allons donc montrer l’analyse des spermatozoïdes de

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Cette vidéo-article décrit, étape par étape, comment traiter un échantillon de sperme d'atteindre une bonne qualité de...

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Les œufs et les revêtements extracellulaire autour des œufs fréquemment communiqué peptides, protéines et petites molécules qui communiquent avec le sperme pour les guider vers l'ovule favorisant ainsi la fécondation. En utilisant le sperme de grenouille nous décrire et comparer deux classes de tests utilisés pour détecter la chimio-attraction des spermatozoïdes - essais d'accumulation de sperme et des tests de suivi du sperme.

Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection

Nous décrivons une stratégie de tri pour les spermatides de souris à l’aide de la cytométrie en flux. Les spermatides sont classées en quatre populations très pures : rondes (étapes 1 à 9 de la spermiogenèse), allongées précoces (étapes 10 à 12 de la spermiogenèse), allongées tardives (étapes 13 et 14 de la spermiogenèse) et spermatides allongées (étapes 15 et 16 de la spermogenèse). La coloration de l’ADN, la taille et la granulosité sont utilisées comme paramètres de sélection.

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.

Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

Protocoles pour la cryoconservation de maturation et de sperme anguille d’Europe ont été améliorés ces dernières années. Cet article décrit le meilleur protocole disponible à l’aide de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pour induire la maturation et le méthanol comme cryoprotectant.

Manutention et traitement des anguilles mâles sur l’Europe (Anguilla anguilla) pour Maturation hormonale et cryoconservation de sperme

Nous présentons ici les méthodes pour évaluer l’intégrité membranaire de spermatozoïde, une fonctionnalité cellulaire associée à compétence de fertilisation de sperme. Nous décrivons trois techniques pour l’évaluation fluorimétrique des membranes des spermatozoïdes : coloration simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques, microscopie à fluorescence et avancé cytométrie dédiés au sperme. Exemples de combiner les méthodes sont également présentés.

Fluorimétrique Techniques pour l’évaluation des Membranes des spermatozoïdes

Dans cet article, nous visons à décrire les performances de la technique de centrifugation en gradient de densité et de son application dans la recherche de la physiologie de sperme.

Prélèvement du sperme de qualité différentielle en utilisant la Centrifugation en Gradient de densité

Cet article rapporte une inhibition in vivo de la CENP-E par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295, un modèle précieux pour la division méiotique masculine. En utilisant les tests d’immunofluorescence, de cytométrie en flux et de microscopie électronique à transmission, nous montrons que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et une instabilité du génome dans les spermatocytes de souris.

Évaluation fonctionnelle de la kinésine-7 CENP-E dans les spermatocytes à l’aide de l’inhibition in vivo , de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux

Cet article décrit deux méthodes rapides et efficaces pour collecter le sperme du petit poisson modèle medaka (Oryzias latipes), ainsi qu’un protocole pour évaluer de manière fiable la qualité du sperme à l’aide de l’analyse assistée par ordinateur du sperme (CASA).

Collecte de sperme et analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes dans le modèle téléostéen japonais Medaka (Oryzias latipes)

Ce protocole décrit une méthode de criblage de spermatozoïdes de haute qualité avec un faible indice de fragmentation de l’ADN en utilisant les caractéristiques de motilité des spermatozoïdes et la thigmotaxie. La méthode utilise un couloir de nage horizontal en forme de U, permettant aux spermatozoïdes de haute qualité d’atteindre le côté opposé à travers des gouttelettes tampons, tandis que les spermatozoïdes morts, les débris cellulaires et les impuretés sont exclus.

Technique de nage horizontale en forme de U pour la préparation de spermatozoïdes de haute qualité avec un faible indice de fragmentation de l’ADN

Découvrez l'analyse de sperme de poissons par CASA avec contrôle thermique à 4°C. Cette méthode évalue la motilité des spermatozoïdes pour améliorer la fécondation artificielle en aquaculture.

Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement

Explorer plus de vidéos