Name: Application d’une Stimulation chronique pour étudier les Rat d’induite par l’activité Contractile du Muscle squelettique phénotypique Adaptations (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez le modèle d'activité contractile chronique pour étudier les adaptations du muscle squelettique chez le rat. Cette méthode permet d'observer la biogenèse mitochondriale et l'autophagie en seulement sept jours.

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Nous sommes reconnaissants à Liam Tyron pour son expert lecture du manuscrit. Ce travail a été financé par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) à D. A. hotte. D. A. Hood est également titulaire d’une Chaire de recherche du Canada en physiologie cellulaire.

Toutes les procédures liées aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux York University. À l’arrivée à l’animalerie à l’Université York, tous les rats ont reçu un minimum de cinq jours pour s’acclimater à leur environnement avant l’intervention chirurgicale, avec nourriture fournie ad libitum. Bien que ce protocole a été appliqué auparavant à d’autres espèces15,17,22, le présent document s’appuie sur le travail pionnier de pipette et collègues23 et se concentre sur le modèle de rat, plus précisément.
1. préparation de l’unité de l’activité Contractile chronique
<ol><li>À l’aide d’un voltmètre, vérifier le potentiel des batteries au lithium pièce. Remarque : Le potentiel de chaque batterie doit être 3,0 ± 0,10 V.</li>
	<li>Insérer deux ou trois piles dans la fente de l’appareil afin que le potentiel total est de 6-9 V. NOTE : C’est à la discrétion des chercheurs à considérer combien potentiel (6 ou 9 V) pour maintenir au cours de la procédure expérimentale ensemble. Selon la conception de l’étude et l’intensité désirée du stimulus, batteries de 2 ou 3 peuvent être utilisées.</li>
	<li>Vérifiez que l’appareil fonctionne correctement via l’indicateur de pouls, en exposant l’unité à 1 impulsion émise par une lampe infrarouge portative de stroboscope.</li>
</ol>2. intervention chirurgicale de l’activité Contractile chronique
NOTE : Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant l’intervention chirurgicale. Pendant et immédiatement après la chirurgie, la température corporelle des rats est maintenue par un coussin chauffant. Il est souhaitable d’effectuer l’intervention chirurgicale sur un drapé chirurgical. Le chirurgien devrait porter des gants chirurgicaux stériles, mais aussi une blouse propre. Si nécessaire, il est recommandé de porter un masque respiratoire jetable.
<ol><li>Anesthésier sous 1 à 3 % des rats par inhalation isoflurane avec l’oxygène, qui est géré par un système de vaporisateur de gaz. Confirmer l’animal est entièrement sous sédation en vérifiant la pincée d’orteil postérieur et en observant les taux et profondeur respiratoire. Appliquer du lubrifiant oculaire sur les yeux pour éviter la sécheresse. Appliquer une injection sous-cutanée de Meloxicam (0,5 mg/mL) à 2 mg/kg. Remarque : Il est également recommandé d’avoir une application multi modale de l’analgésie (p. ex., Meloxicam plus lidocaïne) afin de minimiser toute douleur pendant et après la chirurgie.</li>
	<li>Doucement se raser le postérieur gauche, ainsi qu’une bande autour du torse de l’arrière du cou, environ derrière les membres antérieurs et à travers le thorax antérieur. Essuyez délicatement les zones rasées avec l’iode et d’alcool éthylique pour désinfecter.</li>
	<li>Avec l’animal couché sur le ventre, faire une petite incision (~0.5 cm) à l’arrière du cou dans le centre de la région rasée (la zone palpable entre les omoplates) à l’aide d’un scalpel (lame n ° 10).</li>
	<li>Localiser le nerf péronier commun.<ol>
<li>Roll animal sur son flanc droit et faire un ~ 2-3 cm-coupe longue dans la peau de la patte gauche. Cibler la zone d’incision autour des groupes de muscles de cuisse qui est classée entre la cavité de l’articulation du genou et le dos à proximité de l’origine de la queue. Remarque : Veillez à ne pas contaminer la première zone d’incision lors du changement de la position du corps.</li>
		<li>À l’aide de pointe blunt curved ciseaux chirurgicaux, disséquer la zone sous-cutanée largement ~3.5 - 4 cm, séparant la peau du muscle sous-jacent afin de faire une poche entre la peau ouverte et les muscles sous-jacents. Ouvrir la peau du tissu sous-jacent sur toute la circonférence de l’incision (~1.5 cm2).</li>
		<li>Faire une petite incision (moins de 0,5 cm) sur le muscle biceps fémoral avec des ciseaux chirurgicaux, veiller à ce que les pointes des ciseaux coupez directement vers le bas à travers le muscle.</li>
		<li>Ouvrir délicatement la zone coupée jusqu'à ce que les groupes de muscles internes et le nerf péronier commun sont visibles (la profondeur des tissus musculaires externes (c.-à-d., biceps femoris) avoisine ~0.5 cm). Avec une pincette, doucement touch/pincer le nerf visible et observer les réactions des groupes de muscles de cible (par exemple, TA musculaire) et des orteils (dorsiflexion visible) pour confirmer que le nerf péronier commun est isolé. Remarque : Cette étape doit être faite avec une extrême prudence pour éviter de couper ou d’endommager le nerf.</li>
		<li>Fixer la fenêtre en tirant dessus ouvert avec des écarteurs métalliques tels que la taille de la fenêtre soit ~1.5 cm2 avec le nerf péronier, située dans le centre de la fenêtre. Utiliser des petits crochets métalliques attachés à des sangles ou des bandes de caoutchouc qui sont fixées à la surface de la table (ou jury de chirurgie) (Figure 2 a).</li>
	</ol></li>
	<li>Fixer le fil sur les deux côtés du nerf.<ol>
<li>Préparer ~ 50-60 cm de polytétrafluoroéthylène (PTFE)-enduit métallique inox fine et pliez-la en deux. Remarque : Il peut être utile PFTA-enduit de câble sous la lumière UV avant la chirurgie exposer.</li>
		<li>Accrochez la partie pliée du fil dans la fente d’une tige d’inox 30 cm de long. Passez la tige, ainsi que le fil, par voie sous-cutanée de la poche ouverte des membres postérieurs vers la zone de la petite incision dans la nuque, un motif de forme en L vers le haut de la jambe et le long du centre du dos.</li>
		<li>Trouver les deux extrémités du fil à la patte. Dénudez les fils étant donné que tous les fils sont isolés PTFE. À l’aide d’un scalpel, soigneusement Dénudez les extrémités du fil par ~1.5 cm. Si les fils sont effilochent, découpez-les et re-bande. Recouvrez l’extrémité de fil dénudé autour d’une aiguille de 21 G atténuée (5 fois), faire une bobine. Une fois les bobines sont correctement effectués, libérer l’aiguille de leur part.</li>
		<li>En utilisant une taille de soie chirurgicale 6-0, fixez chacune des bobines de chaque côté du nerf péronier commun (Figure 2 a).<ol>
<li>Faire un nœud à la fin de la bobine et il suture sur le côté gauche du nerf. S’assurer que la bobine est 1,5 à 2,5 mm du nerf.</li>
			<li>Pour fixer la bobine, appliquer deux ou trois sutures supplémentaires le long de la bobine.</li>
			<li>Répétez ces étapes sur le côté droit du nerf.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Appliquer 2 à 3 gouttes de solution d’antibiotiques (ampicilline dans une solution saline ; 132 mg/mL) et puis de suture soigneusement la fenêtre (par exemple, le tissu musculaire biceps femoris) à l’aide de soie de taille 5-0.</li>
	</ol></li>
	<li>Sans serrer le vent le mou restant de fil (environ le diamètre de l’index) et le pousser dans la poche sous-cutanée au-dessus de l’incision suturée du muscle biceps fémoral (environ au-dessus de la hanche).</li>
	<li>Appliquer 2 à 3 gouttes d’une solution antibiotique nouveau (ampicilline dans une solution saline ; 132 mg/mL). Fermer la peau ouverte par agrafage.</li>
	<li>Brancher les fils (sortant de la zone de l’incision du cou) pour le stimulateur de la CCA.<ol>
<li>Reliez goupille prises avec les fils.<ol>
<li>Couper la boucle du fil sortant de l’incision dans la partie supérieure du cou pour créer les 2 extrémités de fils (ces amènent à des bobines suturé de part et d’autre du nerf péronier).</li>
			<li>À l’aide d’un scalpel, dénudez les extrémités des fils par ~0.5 cm. Cut off fils effilochés, le cas échéant.</li>
			<li>Doucement pousser les parties dénudées des fils dans le trou des prises pin et à l’aide d’un fer à souder, souder les fils sur les prises de la broche.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Éventuellement, vérifiez le branchement des fils.<ol>
<li>Connecter les broches à une unité de stimulateur de benchtop grand via des pinces crocodiles.</li>
			<li>Fournir une impulsion unique de 9 V (0,1 ms, 10 Hz) pour confirmer que les contrats de muscle TA et la gauche pieds dorsiflexion.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Passer les extrémités de fils connectés de broche dans le tampon de gaze stérile qui est ~ 4 cm x 4 cm.</li>
		<li>Connecter les broches à l’unité de stimulateur CCA.<ol>
<li>Faire passer les fils par le trou dans la base de la boîte de stimulateur. Remarque : Cette boîte est une chambre artisanale pour l’unité de stimulateur CCA et 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13.</li>
			<li>Insérer les goupilles dans les douilles de raccordement sur l’unité de la CCA. Mettre délicatement l’unité CCA dans la chambre. Utilisez un collant amure pour garantir l’unité de la CCA au fond de la chambre.</li>
		</ol>
</li>
		<li>À l’aide d’un ruban d’athlétisme ou du ruban chirurgical poreux, fixer la chambre avec du ruban autour du torse rasé. Fermer la partie supérieure de la chambre avec trois couches de ruban adhésif et terminer en enroulant une bande autour des côtés de la boîte de stimulateur pour sécuriser la zone (Figure 2 b).</li>
	</ol></li>
	<li>Vérifier si la CCA s’emploie en exposant l’unité à une seule impulsion de lumière infrarouge (spectre de longueur d’onde > 770 nm) qui est émis par une lampe infrarouge portative de stroboscope. Remarque : Si la DPA fonctionne correctement, chercheurs seront en mesure de voir que les muscles postérieurs (c.-à-d., TA) êtes lié contractuellement en réponse à la lumière infrarouge.</li>
	<li>Observer le rat et surveiller sa température jusqu'à ce qu’il a entièrement repris connaissance. Abritera dans une cage de passager unique afin d’éviter tout dommage provenant d’autres animaux et ne laissez pas les tunnels ou les objets en plastique dans la cage pour le reste de l’étude pour limiter les risques d’endommagement de l’appareil stimulateur ou des blessures à l’animal. D’alimentation avec une bouteille d’eau inclus-amoxicilline (0,5 mg/mL).</li>
	<li>Appliquer la dose de 1 mg/kg du Meloxicam par voie sous-cutanée toutes les 24 h suivant la chirurgie, qui se poursuit au moins pendant 72 h.</li>
</ol>3. chronique activité Contractile
<ol><li>Après la chirurgie, laisser au moins 5-7 jours pour un rétablissement complet de l’incision et les zones de suture dans/autour des muscles squelettiques. Remarque : Pendant et après la procédure CCA, inspecter attentivement condition de chaque animal en observant leurs comportements (par exemple, manger, boire ou se déplaçant). En outre, déterminer des stress sévère ou les effets indésirables en vérifiant un changement de poids de corps avant et après l’intervention de la CCA.</li>
	<li>Le jour de la stimulation de la CCA, allumez le CCA en exposant l’appareil stimulateur à une seule impulsion de lumière infrarouge (longueurs d’onde > 770 nm) par une lumière de stroboscope infrarouge portable.</li>
	<li>Appliquer 3 ou 6 h de stimulation CCA 10 Hz. NOTE : Les délais pour la stimulation appartient au chercheur. La fréquence de stimulation n’a jamais été altérée lors de ces expériences et des améliorations très modestes dans l’adaptation mitochondriale ont été observées en étendant la stimulation de 3 à 6 heures par jour, dans notre expérience. Si possible, vérifier la stimulation et l’animal toutes les 30-60 min.</li>
	<li>Suite à la période désirée de la CCA, éteindre l’unité de la CCA par exposition à la lumière infrarouge (même procédure que celle de la mise en marche de l’appareil).</li>
	<li>Si une demande plusieurs jours, répétez l’étape 3.2. 3.4.</li>
	<li>Déterminer le moment de prélèvement tissulaire. Par exemple, recueillir des tissus 24 h après le début de l’assaut final du bilan commun de pays (soit18 h après la dernière stimulation CCA de 6 h), qui est mené sous l’anesthésie fait durant l’intervention chirurgicale de la CCA. Immédiatement après avoir recueilli tous les tissus, euthanasier les animaux en excisant le cœur alors que l’animal est toujours sous anesthésie.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le modèle de l’activité contractile chronique (CCA) de l’exercice, à travers la stimulation basse fréquence musculaire in vivo, est un excellent modèle pour étudier les adaptations phénotypique de muscle pour exercer13,24,25 , 26. comme indiqué dans précédentes études20,27, le CCA est un moyen efficace par lequel chercheurs peu...

Le muscle squelettique peut s’adapter à l’exercice de formation par le biais de changements dans ses bioénergétique et de la structure physique1. Un des changements majeurs induits par l’entraînement en endurance est la biogenèse mitochondriale, qui peut être évaluée par une augmentation de l’expression des composantes mitochondriales (p. ex., sous-unités de la cytochrome c oxydase [COX]), ainsi que l’expression de le co-activateur transcriptionnel, PGC-1α2. Un nombre croissant d’études ont indiqué que nombreux autres facteurs, y compris mitochondrial chiffre d’affaires et mitophagy, sont également importantes pour les adaptations musculaires. Cependant, les mécanismes par lequel exercice aiguë ou chronique réglementent ces processus dans le muscle squelettique sont encore peu clairs.
Pour délimiter les voies qui réglementent des adaptations induites par l’exercice musculaire, différents modèles d’exercice ont été couramment utilisés dans les études sur les rongeurs, y compris les tapis de course, roue en cours d’exécution et exercice de natation. Toutefois, ces protocoles ont certaines limites à cet ~ 4 à 12 semaines sont nécessaires pour observer ces changements phénotypiques3,4,5. Comme une autre méthode expérimentale, basse fréquence induite par une stimulation chronique activité contractile (CCA) a été effectivement utilisée, car elle peut conduire à des adaptations musculaires dans une période beaucoup plus courte (i.e., jusqu'à 7 jours) et ses effets semblent être comparables, ou même plus grande que les autres protocoles d’exercice. En outre, la présence de hormonal6température7et effets neurologiques8 peut rendre difficile de comprendre les réponses spécifiques du muscle à l’exercice chronique. Par exemple, les hormones thyroïdiennes9,10 et insuline-like growth factor (IGF) -111 ont été identifiés comme médiateur des adaptations induites par l’entraînement musculaire, qui peuvent également réglementer les autres voies de signalisation dans le squelette muscle. Notamment, les effets induits par le CCA minimalement relèvent de facteurs systémiques, ce qui permet de se concentrer sur la réponse directe du muscle squelettique à l’activité contractile.
La plaque de rue pour la DPA a été introduite par Tyler et Wright12et a été développée avec modifications12. En bref, l’unité se compose de trois parties principales : un détecteur infrarouge qui peut être activé ou désactivée par l’exposition à la lumière infrarouge, un générateur d’impulsions et un indicateur de pouls (Figure 1). La conception de circuit détaillé de l’appareil stimulateur a été décrit plus haut13. Les caractéristiques détaillées et précises du CCA se trouvent dans une plus grande profondeur dans un numéro de revue articles14,15,16,17. En bref, le protocole de stimulation est conçu pour activer le nerf péronier commun à basse fréquence (c.-à-d. 10 Hz), et les muscles innervés (tibialis anterior [TA] et dans le muscle d’extensor digitorum longus [Eco]) sont forcés à se contracter pour un durée prédéterminée (p. ex., 3-6 h). Au fil du temps, cela déplace les muscles susmentionnés à un phénotype plus aérobie, démontré par une augmentation en densité capillaire18 et mitochondrial contenu19,20,21. Cette méthode est donc un modèle éprouvé pour imiter certains de l’adaptation de la formation endurance majeure dans le muscle squelettique des rats.
Cet article présente une procédure détaillée de la chirurgie d’implantation électrode pour induire la CCA afin que les chercheurs peuvent appliquer ce modèle dans les études de leur exercice. L’ACC est un excellent modèle pour étudier l’évolution temporelle des adaptations musculaires, fournissant ainsi un outil efficace pour l’étude des divers événements moléculaires et de signalisation aux deux périodes au début et plus tard après le début de l’exercice.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River</td><td>Souche 400</td><td></td></tr><tr><td>Unité d’activité contractile chronique</td> Fait <td>maison</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Unité CCA boîte de protection (3,5 x 3,5 x 2,5 cm)</td><td>Fait maison</td><td>n/a</td><td>La boîte doit être faite d’un matériau opaque ou recouverte d’un ruban adhésif</td></tr><tr><td>Piles bouton lithium-ion (3V)</td><td>Panasonic</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>Leico Industries</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>Broche à souder (socket)</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>Ruban poreux</td><td>Zonas Johnson & Johnson</td><td>5104</td><td></td></tr><tr><td>Soie de suture (Taille 5)</td><td>Ethicon</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>Soie de suture (Taille 6)</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux émoussés incurvés (11,5 cm de longueur)</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux émoussés courbés (longueur 15 cm)</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>Pince hémostatique délicate (16 cm de longueur)</td><td>Lawton</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>Pince courbe</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Tige en acier inoxydable (30 cm ; 7 mm de diamètre)</td><td>Fait maison</td><td>n/a</td><td>La tige doit avoir une fente de 5 mm à une extrémité pour maintenir le fil pour le creusement d’un tunnel sous la peau</td></tr><tr><td>Pince à pince</td><td>KLS Martin</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>Agrafes (clips)</td><td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>Crochets/écarteurs en métal</td><td>Fait maison</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iode (500 mL)</td><td>Rougier</td><td>#NPN00172944</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sodique</td><td>Novopharm</td><td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer</td><td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>Multimètre numérique (voltmètre)</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>Stroboscope numérique LED</td><td>Lutron Electronic Enterprise</td><td>DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

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Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Le muscle squelettique est un tissu hautement adaptable, comme ses propriétés biochimiques et physiologiques sont considérablement modifiées en réponse à exercice chronique. Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents qui provoquent diverses adaptations musculaires, un certain nombre de protocoles d’exercice tels que tapis de course, course de la roue et exercice de natation ont été utilisé dans les études chez l’animal. Toutefois, ceux-ci exercent modèles exigent une longue période de temps pour obtenir des adaptations musculaires, qui peuvent être également réglementées par des facteurs humoraux ou neurologiques, limitant ainsi leurs applications dans l’étude des adaptations d’induite par la contraction musculaire spécifique. Stimulation indirecte basse fréquence (10 Hz) pour induire une activité contractile chronique (CCA) a servi comme un modèle alternatif pour l’entraînement, car elle peut conduire avec succès à des adaptations mitochondriale de muscle dans les 7 jours, indépendants des facteurs systémiques. Ce livre présente en détail les techniques chirurgicales nécessaires pour appliquer le traitement de la DPA au muscle squelettique des rats, pour une application généralisée à l’avenir des études.

Nous avons montré que l’activité contractile chronique (CCA) est un outil efficace pour induire des adaptations favorables mitochondriales dans les muscles squelettiques. Rats soumis à 7 jours de la DPA (6 h par jour) d’affichage amélioré de la biogenèse mitochondriale dans le muscle stimulé par rapport aux membres postérieurs non stimulées controlatérale (contrôle). Cette augmentation dans la biogenèse mitochondriale est indiquée par l’expression de la protéine accrue de PGC-1α (<strong ...

Ce protocole décrit l’utilisation du modèle de l’activité contractile chronique d’exercice pour observer des adaptations induites par la stimulation des muscles squelettiques dans le postérieur de rat.

Application d’une Stimulation chronique pour étudier les Rat d’induite par l’activité Contractile du Muscle squelettique phénotypique Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Le modèle d’activité contractile chronique de l’exercice est utile pour étudier les adaptations des muscles squelettiques aux stimuli d’entraînement à l’exercice in vivo. En particulier, ce modèle suscite les adaptations phénotypiques d’un protocole d’entraînement de six semaines en sept jours. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie musculaire comme la biogenèse mitochondriale, l’autophagie et de nombreuses autres adaptations cellulaires associées à l’exercice.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’observer des adaptations musculaires spécifiques sur une courte période de sept jours par rapport à d’autres protocoles d’entraînement physique qui nécessitent plusieurs mois. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’atrophie musculaire, car il a été démontré que la stimulation musculaire chronique a un effet sur l’amélioration de la faiblesse musculaire liée au vieillissement. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal en raison de la difficulté à marquer le nerf péronier commun et à fixer des bobines électriques à chaque extrémité, car cela nécessite de la prati

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Découvrez le modèle d'activité contractile chronique pour étudier les adaptations du muscle squelettique chez le rat. Cette méthode permet d'observer la biogenèse mitochondriale et l'autophagie en seulement sept jours.

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