Imagerie fonctionnelle des usines de Transcription virale à l’aide de la microscopie en Fluorescence 3D

L’objectif global de la combinaison de l’ARN-FISH naissant avec la coloration aminée des protéines latentes virales est de visualiser la transcription active couplée à la formation d’une usine de transcription virale. Cette méthode peut être utilisée pour aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la génétique, de la biologie cellulaire, de la virologie et de la virologie de la biologie cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise un modèle de mini-chromosome viral inductible pour étudier les détails moléculaires derrière les altérations architecturales génomiques.

Prélever les cellules dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugez les cellules pendant deux minutes à une gravité de 200 volts. Lavez les cellules trois fois avec un millilitre de DEPC PBS stérile.

Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 1,2 millilitre de DEPC PBS. Placez les glissières de couverture dans le fond d’une assiette à six puits. Pipeter 200 microlitres de la cellule DEPC PBS mélange sur chaque lamelle.

Une fois que les cellules se sont stabilisées pendant deux minutes, aspirez l’excès de DEPC PBS, ne laissant qu’une fine couche de cellules. Ajoutez soigneusement un millilitre de solution de fixation à chaque lamelle. Laissez les cellules se fixer pendant 10 minutes.

Lavez les lamelles trois fois avec DEPC PBS. Après le lavage, ajoutez soigneusement un millilitre de glycine DEPC PBS à une concentration finale de glycine de 100 millimolaires sur chaque lamelle. Laissez les cellules s’éteindre pendant cinq minutes.

Ajouter 1,5 millilitre de DEPC PBS et placer sur un shaker pendant cinq minutes, puis agiter fermement mais doucement dans la main pendant une minute. Aspirez l’excès de DEPC PBS et veillez à ne pas perturber les cellules. Ajoutez délicatement un millilitre de solution de perméabilisation à chaque lamelle.

Laissez les cellules perméabiliser pendant 15 minutes. Ajouter 1,5 millilitres de DEPC PBS. Placez les cellules sur un agitateur pendant cinq minutes et secouez fermement mais doucement dans la main pendant une minute.

Aspirez l’excès de DEPC PBS et veillez à ne pas perturber les cellules. Étiquetez les lames de microscope et humidifiez une serviette en papier, puis tapissez le fond d’un récipient en plastique refermable avec la serviette. Ensuite, préparez la solution d’anticorps primaire et multipliez la recette pour chaque lamelle présente.

Placez 30 microlitres de solution d’anticorps primaires sur chaque lame de microscope étiquetée. Assurez-vous que la concentration d’anticorps primaires est correcte en tenant le coin de la lamelle et en la tapotant doucement. De plus, le coin d’un mouchoir peut être utilisé pour évacuer l’excès d’humidité.

Placez ensuite la lamelle sur les lames de microscope étiquetées, en faisant attention de ne pas introduire de bulles. Couvrez l’extérieur du récipient d’une pellicule plastique. Placez le récipient dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pendant l’incubation, préparez les réactifs nécessaires. Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du DEPC PBS dans une plaque à six puits pendant cinq minutes chacune. Ensuite, lavez les cellules avec le tampon de lavage FISH trois fois pendant cinq minutes chacune.

Et conservez la lamelle dans le tampon de lavage FISH jusqu’à ce que l’anticorps secondaire, un mélange de sonde d’intron, ait été préparé. Ensuite, nettoyez les lames de verre pour l’incubation des anticorps primaires pour l’hybridation avec de l’eau savonneuse. Une fois qu’ils sont secs, nettoyez-les avec de l’éthanol et un mouchoir de laboratoire.

Placez 40 microlitres de l’anticorps secondaire et de la sonde d’intron FISH avec solution sur chaque lame de verre. Placez les lamelles de couverture avec les cellules sur les lames avec le côté des cellules vers le bas sur le dessus de la mémoire tampon. Et attention à ne pas introduire de bulles.

Placez les lames dans un récipient en plastique avec une serviette en papier humide au fond. Enveloppez le récipient en plastique dans une pellicule plastique d’abord, puis dans du papier d’aluminium. Et incubez le récipient avec les lames.

Après l’incubation, faites glisser délicatement la lamelle du bord de la lame de verre et remettez-la dans des plaques à six puits, vers le haut. Lavez les cellules avec le tampon de lavage FISH trois fois dans une plaque à six puits pendant cinq minutes chacune. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec deux SSC.

Ajoutez du DAPI à une concentration de un à 1000 dans le SSC double et laissez la solution reposer pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez les cellules deux fois avec un SSC double. Nettoyez les lames de verre utilisées pour l’hybridation et ajoutez 10 microlitres de solution de montage sur les lames de verre.

Placez les capots de recouvrement face vers le bas sur la solution de montage. Avec un mouchoir de laboratoire, retirez délicatement l’excès de solution de montage, en faisant attention de ne pas écraser les cellules. À l’aide de vernis à ongles, appliquez une couche suffisante sur le pourtour des lamelles et laissez le vernis sécher.

L’échantillon est maintenant prêt pour la microscopie à fluorescence. Les cellules BCBL-1 ont été colorées pour l’ARN LANA et K-Rta afin d’examiner où se trouvent les épisomes viraux transcrivant activement et l’hétérogénéité de la réponse aux stimuli de réactivation de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi, ou KSHV. La fluorescence distincte de K-Rta dans les régions qui correspondent étroitement à la distribution des épisomes viraux est la preuve que la transcription active a lieu à proximité des génomes du KSHV.

Dans le même échantillon, on peut observer des cellules qui présentent une fluorescence K-Rta beaucoup plus faible et diffuse qui ne chevauche pas significativement celle de LANA, illustrant la variation considérable et le degré de réponse aux stimuli de réactivation au sein d’une population de cellules. Ensuite, l’efficacité de la synchronisation de la thymidine a été examinée en visualisant l’expression de la protéine virale, ce qui a clairement démontré que les cellules synchronisées répondaient davantage aux stimuli de réactivation que la population non synchronisée. La coloration DAPI peut remplir plusieurs fonctions, cet exemple montre clairement qu’il y a trois cellules distinctes au lieu d’une.

La microscopie 3D associée à cette technique a révélé des structures PII d’ARN en forme d’anneau observées avec des génomes KSHV disséminés à la périphérie. Avec son développement, le mini chromosome viral fournirait aux chercheurs des outils uniques pour explorer l’organisation temporelle spéciale de l’expression des gènes et la régression du noyau cellulaire.