Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

L’objectif global de ce test est de dénombrer et d’examiner la différenciation des cellules progénitrices hématopoïétiques dans l’embryon de poisson-zèbre en développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions très importantes dans le domaine hématopoïétique, telles que le nombre de cellules souches et progénitrices présentes dans un embryon de poisson-zèbre en développement. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle est rapide, relativement peu coûteuse et facile à réaliser.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du nombre de progéniteurs présents chez le poisson-zèbre en développement, elle permet également aux chercheurs de mesurer l’effet fonctionnel d’un médicament ou d’une mutation génétique sur la formation des progéniteurs sanguins. Nous avons eu l’idée de cette méthode, alors que nous éliminions des gènes que nous supposions être cruciaux pour le développement du sang. Nous avons prédit que nous serions en mesure de mesurer la différence entre les embryons en développement normal et ceux qui étaient des morphants avec ce test.

Pour blanchir les embryons de poisson-zèbre, utilisez des récipients en plastique pour créer trois stations de lavage, l’une contenant un millilitre de cinq pour cent d’eau de Javel pour un litre d’E3 et deux stations contenant de l’E3 stérile. À l’aide d’une pipette de transfert, placez les embryons dans une passoire à thé et immergez-les dans la station de lavage numéro un pendant cinq minutes. Transférez ensuite la passoire à thé avec les embryons dans la station de lavage numéro deux pendant cinq minutes. Répétez l’opération pour la station de lavage numéro trois pendant cinq minutes finales.

Après le dernier lavage, retirez les embryons de la passoire à thé en la retournant au-dessus d’une boîte de Pétri propre de 10 centimètres et utilisez une pipette de transfert et un E3 stérile pour rincer doucement les embryons de la passoire. Pour déchorionner les embryons, utilisez une pipette de transfert pour retirer et jeter autant d’E3 que possible de la boîte de Pétri. Ajoutez ensuite 500 microlitres de produits de déchorionation aux embryons et incubez-les à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, tapotez doucement le côté de la boîte de Pétri pour retirer complètement les chorions. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, ajoutez 20 millilitres de E3 stérile pour diluer les prodeas. Laissez les embryons se déposer et utilisez une pipette pour retirer l’E3. Répétez cette étape de lavage trois fois pour éliminer toute trace de prodeas de déchorionation.

Pour préparer des échantillons d’embryons, utilisez une pipette pour placer 10 embryons dans un seul tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, pipetez soigneusement l’E3 et jetez-le. Transférez les échantillons dans une hotte à flux laminaire et lavez les embryons en ajoutant un millilitre d’E3 stérile, permettant aux embryons de se déposer au fond du tube.

Ensuite, utilisez une pipette P1000 pour retirer le surnageant. Répétez l’opération pour un total de trois lavages. Après le dernier lavage, retirez l’E3 et jetez-le.

Ajoutez ensuite un millilitre de DTT de 10 millimolaires dans E3 pour éliminer l’enrobage de mucus et toutes les spores, levures ou bactéries qui peuvent y être piégées autour des embryons. Maintenant, posez le tube de microcentrifugation horizontalement et incubez-le à température ambiante pendant 25 minutes. Pour dissocier les embryons, utilisez un millilitre de DPBS stérile pour laver l’échantillon trois fois.

Après le dernier lavage, ajoutez 500 microlitres de DPBS avec du calcium et du magnésium et cinq microlitres de cinq milligrammes par millilitre de prodeas de dissociation. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius sur un agitateur orbital horizontal à 180 tr/min pendant 60 minutes. Ensuite, placez les échantillons et la hotte à flux laminaire et utilisez un P1000 pour triturer les embryons jusqu’à ce que les échantillons soient complètement dissociés.

Soyez prudent et vérifiez périodiquement les embryons pour déterminer quand ils sont dissociés. Vous voulez qu’il y ait du tissu. Il est possible de trop digérer les embryons, ce qui détruira les cellules progénitrices.

Pipetez les 10 embryons dissociés dans le réservoir supérieur d’un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres avec un capuchon de crépine de 35 micromètres. À l’aide d’une pipette et d’un PBS stérile, rincez le tube embryonnaire et transférez la solution dans le tube en polystyrène de cinq millilitres contenant des cellules filtrées. Répétez le rinçage jusqu’à ce que quatre millilitres de liquide soient présents dans le tube.

Centrifugez les tubes à 300 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour palette l’échantillon de cellules homogénéisées. À l’aide d’une pipette, retirez et jetez le surnageant du tube à fond rond en prenant soin de ne pas perturber les cellules granulées au fond. Utilisez ensuite 100 microlitres de PBS pour remettre les cellules en suspension.

Préparez une solution mère de méthylcellulose X complète et utilisez des seringues de trois millilitres et des aiguilles de calibre 16 pour ajouter 2,5 millilitres de tubes stériles à fond rond de 14 millilitres. Utilisez un tube pour chaque condition testée. Pour la différenciation myéloïde, ajoutez 1 % de sérum de carpe et 0,3 milligramme par millilitre de facteur de stimulation des colonies de granulocytes de poisson-zèbre recombinant ou GCSF dans un milieu de méthylcellulose.

Pour la différenciation érythroïde, ajoutez 1 % de sérum de carpe et 0,1 milligramme par millilitre d’érythropoïétine ou d’EPO de poisson-zèbre recombinant au milieu de méthylcellulose. Pour examiner les progéniteurs multi-lignées, ajoutez EPO et GCSF. À l’aide d’une pipette, ajoutez 100 microlitres des 10 embryons dissociés à la surface de la méthylcellulose préparée avec les cytokines recombinantes dans le sérum de carpe.

Fermez le couvercle et agitez doucement pour homogénéiser complètement l’échantillon. Chaque tube doit maintenant contenir le tissu dissocié de 10 embryons. À l’aide de trois seringues d’un millilitre et d’aiguilles de 16 calibres, aliquote un millilitre d’échantillon dans deux boîtes de Pétri distinctes de 35 millimètres.

Assurez-vous que l’échantillon est complètement dispersé dans la boîte de Pétri. Répétez l’opération pour chaque échantillon. Placez les boîtes de Pétri de 35 millimètres avec des cellules et de la méthylcellulose dans une boîte de Pétri de 15 centimètres.

À chaque grande assiette, ajoutez une parabole de 35 millimètres avec cinq millilitres d’eau stérile pour humidifier les échantillons. Incuber les plats à 32 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant sept à 10 jours. Enfin, visualisez les unités formant colonie selon le protocole de texte.

Après sept jours de culture avec des facteurs de soutien hématopoïétiques, les progéniteurs de 48 poissons-zèbres embryonnaires HPF ont été comptés et imagés. Il est important de noter que la quantité de FK utilisée est directement corrélée au nombre d’embryons mis en boîte. Le placage de quatre ou huit embryons par millilitre, ce qui correspond au fait de commencer avec 10 ou 20 embryons, au début de l’expérience, donne respectivement environ 1200 ou 2400 UFC.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas trop digérer les embryons, car cela détruirait les cellules progénitrices. Avec cette procédure, vous pouvez comparer le nombre de progéniteurs présents à différents points temporels.

Vous pouvez comparer des animaux mutants avec des animaux de type sauvage, ainsi que tester l’effet des médicaments sur le développement du sang. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de méthylcellulose pour énumérer les progéniteurs hématopoïétiques du poisson-zèbre. Vous pouvez modifier cette procédure pour l’adapter à vos besoins expérimentaux spécifiques, tels que l’analyse de cytokines spécifiques.

N’oubliez pas que travailler avec du sang et des aiguilles de vertébrés peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de la réalisation de ce test.