Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

L’objectif global de ce protocole est d’augmenter la quantité d’ADN double brin isolé et les banques de séquençage à haut débit ultérieures à partir de spécimens d’herbier, maximisant ainsi leur utilité dans les études phylogénomiques. Cette méthode libère le potentiel des spécimens d’herbier qui ne seraient autrement pas utiles pour les projets de séquençage en tant que séquences génomiques en raison de la dégradation importante des échantillons. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est suffisamment robuste pour que des spécimens d’herbier rares et historiquement importants puissent être utilisés sans qu’il soit nécessaire de procéder à un échantillonnage destructeur approfondi.

Cette technique permet d’étendre la profondeur de l’échantillonnage des taxons dans le cadre de projets espacés systématiques. L’acquisition d’espèces est une étape limitative, mais avec ce protocole, les collections historiques peuvent être facilement utilisées dans ces études. Ajoutez de l’azote liquide et 30 à 50 milligrammes de sable stérilisé pour broyer un centimètre carré de tissu d’herbier présélectionné en poudre fine dans un mortier et un pilon pré-refroidis.

Un broyage adéquat est essentiel pour une isolation réussie de l’ADN. Et il faut veiller à ce que l’échantillon soit complètement pulvérisé. Ensuite, ajoutez la poudre congelée dans deux tubes de deux millilitres, en ne remplissant pas plus de la moitié du volume du tube.

Ajoutez ensuite 600 microlitres de solution CTAB chaude dans chaque tube. Mélangez soigneusement la poudre en l’inversant et en tourbillonnant. Ensuite, incubez les échantillons dans un bain-marie maintenu à 65 degrés Celsius pendant une à 1,5 heure.

Pendant ce temps, faites un vortex toutes les 15 minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, transférez environ 500 microlitres de surnageant dans un nouvel ensemble de tubes étiquetés.

Au surnageant, ajoutez quatre microlitres de 10 milligrammes par millilitre de RNase A à chaque morceau. Mélangez ensuite le contenu du tube par inversion ou pipetage. Incuber les échantillons dans un bloc de chaleur ou un bain-marie maintenu à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Une fois que les tubes ont atteint la température ambiante, ajoutez environ 500 microlitres de phénol, de chloroforme et d’alcool isoamylique 25:24:1 aux échantillons. Mélangez ensuite le contenu des tubes par pipetage inverseur ou répété. Ensuite, centrifugez les échantillons à 12 000 g pendant 15 minutes à température ambiante.

Transférez la couche aqueuse supérieure, qui est d’environ 400 microlitres, dans un nouvel ensemble de tubes étiquetés. À la couche aqueuse de chaque tube, ajoutez environ 400 microlitres de chloroforme 24:1, mélange d’alcool isoamylique. Mélangez soigneusement l’échantillon par pipetage ou inversion répétée.

Ensuite, centrifugez les tubes à 12 000 g pendant cinq minutes et transférez environ 300 microlitres de couche aqueuse supérieure dans des tubes pré-refroidis et étiquetés. Ensuite, ajoutez 300 microlitres d’isopropanol pré-réfrigéré et 12 microlitres d’acétate de sodium 2,5 molaires. Ensuite, incubez les tubes à moins 20 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes.

Après l’incubation, sortez les échantillons du congélateur. Ensuite, centrifugez les échantillons à 12 000 g pendant 15 minutes à température ambiante. Après centrifugation, lavez le granulé avec environ 300 à 500 microlitres d’éthanol à 70 %.

Encore une fois, centrifugez les tubes à 12 000 g pendant 10 minutes. Ensuite, sans déranger le granulé, retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, faites sécher les granulés à l’air libre et dissolvez l’ADN dans 50 microlitres de tampon 1X Tris-EDTA.

Ajoutez un à 16 microlitres d’ADN isolé et deux microlitres de tampon de réaction de fragmentation dans un tube de réaction en chaîne par polymérase de 0,2 millilitre. Ajustez le volume final à 18 microlitres avec de l’eau sans nucléases. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’enzyme de fragmentation de l’ADN double brin et vortex brièvement le mélange pendant quelques secondes.

Ensuite, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 8,5 minutes dans le thermocycleur. Après l’incubation, ajoutez cinq microlitres d’EDTA 0,5 molaire dans les tubes. Ajoutez 25 microlitres d’eau sans nucléase pour ajuster le volume total de l’ADN cisaillé à 50 microlitres.

Ajoutez ensuite 45 microlitres de billes SPRI maintenues à température ambiante à 50 microlitres d’ADN cisaillé et mélangez soigneusement les deux en le pipetant de haut en bas. Laissez l’échantillon contenant les tubes pendant cinq minutes. Transférez ensuite les tubes sur une plaque magnétique et attendez encore cinq minutes.

Expulsez soigneusement le surnageant. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’éthanol frais à 80 % dans les tubes sur le support magnétique et attendez encore 30 secondes à température ambiante. Après 30 secondes, retirez délicatement le surnageant.

Laissez le couvercle du tube ouvert pour faire sécher les billes à l’air libre pendant cinq minutes sur le support magnétique. Retirez ensuite les tubes du support magnétique et éluez l’ADN des billes dans 55 microlitres de tampon Tris-EDTA 0,1X. Mélangez soigneusement l’ADN par pipetage répété.

Ensuite, incubez l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Encore une fois, placez le tube sur le support magnétique et attendez que la solution se dissipe au bout de deux minutes environ. Retirez 52 microlitres de surnageant, puis effectuez une analyse de quantification de l’ADN comme indiqué dans le protocole textuel.

À 50 microlitres d’ADN nettoyé et cisaillé, ajoutez trois microlitres d’endonucléase, d’enzymes de résidus de phosphate et sept microlitres de tampon de réaction. Mélangez soigneusement l’ADN et les autres composants en pipetant de haut en bas. Faites ensuite tourner les tubes pour éliminer les bulles.

Après l’essorage, transférez les échantillons dans un thermocycleur et réglez le programme. Diluez l’adaptateur 25 à 50 fois pour obtenir une concentration de travail de 0,6 à 0,3 micromolaire. Pour un séquençage à lecture courte à haut débit, ajoutez 30 microlitres de mélange maître de ligature, un microlitre d’amplificateur de ligature et 2,5 microlitres d’adaptateur aux tubes.

Mélangez soigneusement le contenu des tubes en pipetant de haut en bas. Encore une fois, faites tourner les tubes pour éliminer les bulles. Ensuite, incubez le tube à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ajouter trois microlitres de mélange commercial d’uracile-ADN glycosylase et d’ADN glycosylase lyase endonucléase VIII dans les tubes. Ajustez le volume total à 96,5 microlitres. Mélangez soigneusement les composants et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans le thermocycleur.

Dans le tube, préparez le mélange de réaction en chaîne par polymérase en ajoutant tous les réactifs à de l’ADN nettoyé et ligaturé par un adaptateur. Ensuite, mélangez bien la réaction en vortexant. Une fois le vortex terminé, placez les échantillons dans le thermocycleur et démarrez le réglage d’amplification du thermocycleur.

Ajouter environ 25 microlitres de billes magnétiques maintenues à température ambiante à l’échantillon et mélanger par pipetage répété. Incuber l’échantillon pendant cinq minutes. Transférez ensuite les tubes sur un support magnétique et attendez encore cinq minutes.

Au bout de cinq minutes, retirez le surnageant dans un nouvel ensemble de tubes étiquetés. Ensuite, au surnageant, ajoutez six microlitres de billes SPRI maintenues à température ambiante et mélangez soigneusement. Après avoir incubé les échantillons pendant cinq minutes, transférez les tubes sur la plaque magnétique et attendez encore cinq minutes.

Retirez et jetez le surnageant. Ajoutez ensuite 200 microlitres d’éthanol frais à 80 % dans les tubes sur le support magnétique. Ensuite, incubez les tubes à température ambiante pendant 30 secondes.

Après 30 secondes, retirez délicatement le surnageant et faites sécher les billes à l’air libre pendant cinq minutes avec le couvercle du tube ouvert tout en restant sur le support magnétique. Retirez maintenant les tubes de l’aimant. Éluer l’ADN cible des billes en 33 microlitres de tampon Tris-EDTA 0,1X et le soumettre à un mélange minutieux.

Après un bon mélange, incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Transférez ensuite les tubes sur le support magnétique et attendez environ deux minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire. Pipette de 30 microlitres du surnageant dans des tubes de deux millilitres pour le stockage.

Pour montrer l’isolement de l’ADN d’herbier, un gel d’agarose a été analysé avec de l’ADN double brin isolé de différents spécimens d’herbier. En utilisant 10 milligrammes de tissu foliaire, près de 3,56 à 2 610 nanogrammes d’ADN double brin isolé ont été chargés sur le gel d’agarose. Le gel présente de l’ADN d’herbier dégradé sous forme de frottis dans toutes les voies.

Ensuite, afin de montrer la récupération d’une bibliothèque de séquençage de haute qualité à partir d’ADN isolé de 10 spécimens d’herbier, un gel d’agarose a été analysé. Avant le chargement sur le gel d’agarose, environ 1,26 à 464 nanogrammes de l’ADN isolé de l’herbier ont été soumis à un cisaillement enzymatique et à un nettoyage avec un volume de billes de 90 %. Le gel d’agarose montre la récupération d’une bibliothèque de séquençage de haute qualité à partir de l’ADN de 10 spécimens d’herbier.

Les bibliothèques de séquençage finales montrent une bande primaire entre 300 et 500 paires de bases. Ensuite, pour montrer la séquence canon de l’ADN dérivé de l’herbier, un graphique circulaire du génome du chloroplaste TK 686 a été obtenu. La séquence montre la longueur totale de l’ADN, la région de répétition inversée et la présence de grandes et petites régions à copie unique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée sur 24 échantillons en moins de 13 heures avec seulement environ huit heures de temps de manipulation actif. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que la capture de séquences, peuvent être effectuées sur les bibliothèques résultantes pour générer des données nucléaires pour des études phylogénétiques.