Name: Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Découvrez l'isolement d'ADN robuste et la construction de bibliothèques de séquençage haut-débit à partir de spécimens d'herbier dégradés. Cette méthode maximise l'utilisation des collections historiques en phylogénomique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher et Kristina Zudock d’assistance dans les herbiers d’échantillonnage et le jardin botanique du Missouri pour l’accès aux spécimens d’herbier pour échantillonnage destructeur. Ce travail a été prise en charge par une subvention de la Fondation nationale des sciences (DEB-1457748).

<ol><li>Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00984634">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li>
<li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12509/abstract">Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico.</a> Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).</li>
<li>Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyly+of+Arundinoideae+%28Poaceae%29+and+Evolution+of+the+Twisted+Geniculate+Lemma+Awn%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn.</a> Ann Bot. , (2017).</li>
<li>Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10592-006-9209-7">Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris.</a> Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).</li>
<li>Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+museum+specimens+in+population+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Tre+Eco+%26+Evo%22%5BJournal%5D)">Back to the future: museum specimens in population genetics.</a> Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).</li>
<li>Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006320711002679">How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?</a> Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).</li>
<li>Saltonstall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+invasion+by+a+non-native+genotype+of+the+common+reed%2C+Phragmites+australis%2C+into+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America.</a> PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).</li>
<li>Besnard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+museums+to+genomics%3A+old+herbarium+specimens+shed+light+on+a+C3+to+C4+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).</li>
<li>Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+open+the+treasure+chest%3F+Optimising+DNA+extraction+from+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).</li>
<li>Harris, S. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00937835">DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods.</a> Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+plant+herbarium+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA damage in plant herbarium tissue.</a> PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).</li>
<li>Bakker, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12642/abstract">Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline.</a> Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).</li>
<li>Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-294X.1997.00266.x/full">Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA.</a> Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).</li>
<li>Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequences+from+multiple+amplifications+reveal+artifacts+induced+by+cytosine+deamination+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA.</a> Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+treasure+troves%3A+Complete+genome+sequencing+of+herbarium+and+insect+museum+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens.</a> PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).</li>
<li>Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/00837792.2017.1313383">Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens.</a> Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).</li>
<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.citeulike.org/user/echinotrix/article/678648">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406474">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide.</a> Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).</li>
<li>Twyford, A. D., Ness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+complete+plastid+genome+seqeuncing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Eco+Resour%22%5BJournal%5D)">Strategies for complete plastid genome seqeuncing.</a> Mol Eco Resour. , (2016).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Bio%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Bio. 12 (2), R18(2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).</li>
<li>Grigoriev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MycoCosm+portal%3A+gearing+up+for+1000+fungal+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes.</a> Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+%28Asparagaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li>
<li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verdant%3A+automated+annotation%2C+alignment%2C+and+phylogenetic+analysis+of+whole+chloroplast+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes.</a> Bioinf. , (2016).</li>
<li>Staton, S. E., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposome%3A+A+toolkit+for+annotation+of+transposable+element+families+from+unassembled+sequence+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads.</a> Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).</li>
<li>Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repbase+Update%2C+a+database+of+repetitive+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes.</a> Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).</li>
<li>McKain, M. R. Transposons. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>Weiß, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+damage+and+decay+kinetics+of+DNA+retrieved+from+plant+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).</li>
<li>Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+nucleotide+misincorporations+and+DNA+fragmentation+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequence+capture+as+a+powerful+tool+for+evolutionary+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis.</a> Am J Bot. 99, 312-319 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrentes.

Le protocole présenté ici est une méthode complète et robuste pour l’isolement de l’ADN et le séquençage de préparation de la bibliothèque de spécimens de plantes séchées. La cohérence de la méthode et de la nécessité minimale de l’altérer basé sur spécimen qualité fais il évolutive pour les projets de grand séquençage axée sur l’herbier. L’inclusion d’une étape de reamplification en option pour les bibliothèques de faible rendement permet l’inclusion de basse qualité, faible quantité, rare ou des échantillons historique...

Collections de l’herbier sont une source potentiellement utile des deux espèces et la diversité génomique d’études y compris phylogénétique1,2,3, génétique des populations,4,5, conservation biologie6espèces envahissantes biologie7et trait evolution8. La possibilité d’obtenir une riche diversité d’espèces, populations, lieux géographiques et points dans le temps met en lumière le « treasure chest »9 qui est de l’herbier. Historiquement, la nature dégradée de l’ADN dérivé herbier a entravé les projets axés sur la PCR, reléguant souvent les chercheurs à utiliser uniquement les marqueurs trouvés à élevé de copies, comme les régions du génome chloroplastique ou l’espaceur interne transcrit (ITS) de le ribosomique ARN. Qualité des spécimens et ADN varient largement basé sur les méthodes de préservation9,10, avec des cassures double-brin et la fragmentation de la chaleur utilisée dans le processus de séchage étant les formes les plus courantes des dommages, la création du ce que l'on appelle 90 % ADN de lock-up qui a grevé les études basées sur la PCR11. En dehors de la fragmentation, deuxième plus répandu en génomique de l’herbier s’agit de contamination, telles que cette dérivée de champignons endophytes13 ou champignons acquis post mortem après la collecte mais avant de monter dans l’herbier12, bien que ce problème peut être résolu bioinformatically compte tenu de la base de données droit fongique (voir ci-dessous). Un troisième problème, moins fréquents, est la modification de séquence par le biais de cytosine désamination (C/G→T/A)14, bien qu’on estime être faible (~ 0,03 %) à l’herbier spécimens11. Avec l’avènement de séquençage haut débit (HTS), la question de la fragmentation peut être surmontée avec quelques lectures et séquençage profondeur12,15, permettant l’acquisition des données génomiques des nombreux spécimens de faible qualité L’ADN et parfois même permettre de séquençage du génome entier15.
Des échantillons d’herbier sont devenant plus fréquemment utilisés et sont une plus grande partie des projets phylogénétique16. Un défi actuel de l’utilisation de spécimens d’herbier pour HTS est systématiquement obtenir suffisamment ADN bicaténaire, indispensable pour les protocoles de séquençage, de nombreuses espèces dans un délai raisonnable, sans avoir besoin d’optimiser des méthodes pour l’individu spécimens. Dans cet article, un protocole d’extraction d’ADN et préparation de la bibliothèque de spécimens d’herbier démontre qui tire profit des méthodes existantes et modifie leur permettant des résultats rapides et reproductibles. Cette méthode permet complète transformation du spécimen dans une bibliothèque de 24 échantillons à 13 h, avec temps de pratique 8 h, ou 16 h, avec le temps de pratique 9 h, quand l’étape facultative reamplification est nécessaire. Traitement simultané de plusieurs échantillons est réalisable, même si le facteur limitant est la capacité de centrifugeuse et de compétences techniques. Le protocole vise à exiger uniquement matériel de laboratoire typique (thermocycleur, centrifugeuse et supports magnétiques) au lieu de l’équipement spécialisé, comme un nébuliseur ou un sonicateur, pour la tonte de l’ADN.
Qualité de l’ADN, taille du fragment et la quantité sont des facteurs d’utilisation des spécimens d’herbier dans les expériences de séquençage haut débit limitant. Autres méthodes pour isoler l’ADN de l’herbier et création de bibliothèques de séquençage haut débit ont démontré l’utilité d’utiliser aussi peu que 10 ng d’ADN16; Cependant ils ont besoin de déterminer expérimentalement le nombre optimal de PCR cycles requis pour la préparation de la bibliothèque. Cela devient impraticable lorsque traitant de très petites quantités de double viable stranded DNA (ADN double brin), car certains spécimens d’herbier produisent seulement assez ADN pour une préparation de bibliothèque unique. La méthode présentée ici utilise un numéro unique de cycles indépendamment de la qualité de l’échantillon, donc aucun ADN ne se perd dans les étapes d’optimisation de bibliothèque. Au lieu de cela, une étape de reamplification est appelée lorsque les bibliothèques ne respectent pas les montants minimums nécessaires pour l’ordonnancement. De nombreux échantillons d’herbier sont rares et possèdent peu de matériel rendant difficile de justifier l’échantillonnage destructeur dans de nombreux cas. Pour contrer cela, le protocole présenté permet de dsDNA entrée tailles moins de 1,25 ng dans le processus de préparation de bibliothèque, élargit la portée des échantillons viables pour haut débit séquençage et réduisant au minimum la nécessité d’échantillonnage destructeur des spécimens.
Le protocole suivant a été optimisé pour les graminées et testé sur des centaines d’espèces différentes des échantillons d’herbier, même si nous attendons que le protocole peut être appliqué à beaucoup d’autres groupes de plantes. Il comprend une étape de récupération en option qui peut être utilisée pour enregistrer la basse qualité et/ou des spécimens rares. Après plus de deux cents spécimens d’herbier testés, ce protocole fonctionne sur des spécimens avec faible tissu d’entrée et de qualité, permettant la préservation des spécimens rares par échantillonnage destructeur minime. Ici, il est démontré que ce protocole peut fournir des bibliothèques de haute qualité qui peuvent être séquencés pour projets axés sur la phylogénomique.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermocycleur</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Bain sec numérique</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Eau ultra pure)</td><td>ELGA&nbsp ;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>Tube LoBind d’ADN²</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini centrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortier</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>porcelaine</td></tr><tr><td>Pestle</td><td>fisher</td><td>Scientific S02595</td><td></td></tr><tr><td>porcelaine Tubes à centrifuger</td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Tube de bandelette et capuchon pour PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Azote liquide Stockage</td> <td>à court termeNalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Support à anneau magnétique&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>AM10050</td><td>96 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Agitateurs à plaque chauffante</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 x TE Buffer</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml solution</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase Eau</td><td>libre bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamylique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE</td><td>Agarose GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS Échelle d’ADN</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Sel disodique</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dosage</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>colorant de</td></tr><tr><td>chargement de gel ultra pur violet (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNuivant dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit pour Illumina&nbsp ;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNuix Oligos multiplex pour Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Solution phénolique</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Sable de silice</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Amorces de réamplification Technologies</td><td>d’ADN intégrées</td><td>voir texte</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>Codes</td><td></td><td></td> génétiques</tr></tbody></table>

isolement d’adn robuste et construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Les herbiers sont une source inestimable de matériel végétal qui peut être utilisé dans une variété d’études biologiques. L’utilisation de spécimens d’herbier est associé liée un certain nombre de défis, y compris la qualité de conservation des échantillons ADN dégradé et échantillonnage destructif des spécimens rares. Afin d’utiliser plus efficacement le matériel d’herbier dans les projets de séquençage de grand, il faut une méthode fiable et évolutive de préparation d’ADN d’isolement et de la bibliothèque. Cet article démontre un protocole robuste, début à la fin pour ADN isolement et haut débit bibliothèque construction de spécimens d’herbier qui ne nécessite pas de modification pour des échantillons individuels. Ce protocole est adapté pour la plante basse qualité séchée matériel et prend l’avantage des méthodes existantes en optimisant les tissus meulage, modification de sélection de la taille de bibliothèque et en introduisant une étape facultative de reamplification pour les bibliothèques de faible rendement. Reamplification de bibliothèques d’ADN avec un faible rendement peut sauver des échantillons provenant de spécimens d’herbier potentiellement précieux et irremplaçable, niant la nécessité pour un échantillonnage destructeur additionnel et sans introduire un biais de séquençage discernable pour common applications de la phylogénétiques. Le protocole a été testé sur des centaines d’espèces de graminées, mais devrait être adaptable pour utilisation dans les autres lignées de plantes après vérification. Ce protocole peut être limité par l’ADN extrêmement dégradé, où des fragments n’existent pas dans la gamme de taille désirée, et de métabolites secondaires présents dans une substance végétale qui inhibent l’isolement d’ADN propre. Dans l’ensemble, ce protocole présente une méthode complète et rapide qui permet l’isolement d’ADN et préparation de la bibliothèque des 24 échantillons en moins de 13 h, avec seulement 8 h de la période de pratique active avec des modifications minimes.

Isolement d’ADN et le rendement Final de bibliothèque Dans cette étude, l’efficacité du protocole pour l’isolement de l’ADN de l’herbier et la récupération des bibliothèques de séquençage de haute qualité a été démontrée à l’aide de cinquante différents échantillons avec la plus ancienne de 1920 et le plus jeune de 2012 (tableau 2). Pour chaque échantillon, environ 10 mg de tissus foliaires a été utilisé pour l’isolement de l’ADN. Les tissus foliaires ...

Cet article illustre un protocole détaillé pour l’isolement de l’ADN et construction de bibliothèque de séquençage haut-débit de matériel d’herbier dont le sauvetage de l’ADN de très mauvaise qualité.

Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

L’objectif global de ce protocole est d’augmenter la quantité d’ADN double brin isolé et les banques de séquençage à haut débit ultérieures à partir de spécimens d’herbier, maximisant ainsi leur utilité dans les études phylogénomiques. Cette méthode libère le potentiel des spécimens d’herbier qui ne seraient autrement pas utiles pour les projets de séquençage en tant que séquences génomiques en raison de la dégradation importante des échantillons. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est suffisamment robuste pour que des spécimens d’herbier rares et historiquement importants puissent être utilisés sans qu’il soit nécessaire de procéder à un échantillonnage destructeur approfondi.Cette technique permet d’étendre la profondeur de l’échantillonnage des taxons dans le cadre de projets espacés systématiques. L’acquisition d’espèces est une étape limitative, mais avec ce protocole, les collections historiques peuvent être facilement utilisées dans ces études. Ajoutez de l’azote liquide et 30 à 50 milligrammes de sable stérilisé pour broyer un centimètre carré de tissu d’herbier présélectionné en poudre fine dans un mortier et un pilon pré-refroidis.Un broyage adéquat est

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

La méthode Salut-C permet l'identification sans parti pris, l'ensemble du génome des interactions chromatine (1). Salut-C couples ligature de proximité et le séquençage massivement parallèle. Les données obtenues peuvent être utilisées pour étudier l'architecture génomique à plusieurs échelles: premiers résultats identifié des caractéristiques telles que les territoires chromosomiques, la ségrégation de la chromatine ouverte et fermée, et la structure de la chromatine à l'échelle mégabase.

Salut-C: une méthode d&#39;étude de l&#39;architecture tridimensionnelle des génomes.

Ce manuscrit décrit une approche automatisée de sélection de la taille du gel pour purifier les fragments d’ADN pour le séquençage de nouvelle génération. La technologie Ranger permet une automatisation complète de l’ensemble du processus de chargement de gel d’agarose, d’analyse électrophorétique et de récupération de fragments d’ADN ciblés, ce qui permet d’obtenir des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération à haut débit et de haute qualité.

Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d&#39;échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement

Nous décrivons une méthode efficace, robuste et rentable pour extraire l'acide nucléique à partir des prélèvements pour la caractérisation des communautés bactériennes en utilisant ARNr 16S séquençage de l'amplicon du gène. La méthode permet une approche de traitement commun pour les types d'échantillons multiples et peut accueillir un certain nombre de processus d'analyse en aval.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

La comparaison et l'optimisation de deux méthodes d'enrichissement d'ADN organellaire végétal sont présentées: centrifugation différentielle traditionnelle et fractionnement de l'ADNc total basé sur l'état de méthylation. Nous évaluons la quantité et la qualité d'ADN qui en résultent, démontrons la performance dans le séquençage de prochaine génération de lecture courte et discutons le potentiel d'utilisation dans le séquençage à une seule molécule à longue lecture.

Optimisation et analyse comparative des méthodes d&#39;enrichissement de l&#39;ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Gel-seq permet aux chercheurs de préparer simultanément les bibliothèques pour les deux ADN - et RNA-seq au surcoût négligeable à partir de 100-1000 cellules à l’aide d’un dispositif simple hydrogel. Cet article présente une approche détaillée pour la fabrication de l’appareil ainsi que le protocole biologiques pour générer des bibliothèques appariés.

Gel-seq : PROCEDE de Preparation de bibliothèque simultanée de séquençage de l’ADN et l’ARN à l’aide de Matrices d’Hydrogel

Contamination pendant le séquençage génomique des organismes microscopiques demeure un grand problème. Ici, nous montrons une méthode pour séquencer le génome d’un tardigrade un seul spécimen avec aussi peu que 50 pg d’ADN génomique sans amplification du génome entier pour minimiser le risque de contamination.

Ultra basse génome d’entrée séquençage bibliothèque préparation à partir d’un seul spécimen Tardigrade

Long-lire des séquences facilitent considérablement l’assemblage des génomes complexes et caractérisation de variation structurale. Les auteurs décrivent une méthode pour générer des séquences ultra longues de plateformes de séquençage nanopore-basé. L’approche adopte une extraction d’ADN optimisée suivie de préparations de bibliothèque modifiée pour générer des centaines de kilobases se lit avec une couverture modérée à partir des cellules humaines.

Séquençage de l’ultra longue lecture pour l’analyse de l’ADN génomique ensemble

Ce protocole détaille une approche globale pour la culture, le séquençage et l’assemblage hybride de novo du génome des bactéries urinaires. Il fournit une procédure reproductible pour la génération de séquences génomiques complètes et circulaires utiles pour étudier les éléments génétiques chromosomiques et extrachromosomiques contribuant à la colonisation urinaire, à la pathogenèse et à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens.

Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

La faisabilité et l’efficacité des méthodes de séquençage de l’ARNc à haut débit annoncent une ère unicellulaire dans la recherche sur les plantes. La présente ici est une procédure robuste et complète pour isoler des types spécifiques de cellules racinaires d’Arabidopsis thaliana et la construction et l’analyse ultérieures de la bibliothèque de transcriptomes.

Isolement et analyse transcriptome de types de cellules végétales

Le présent article vise à fournir des protocoles détaillés et adéquats pour l’isolement des champignons endophytes associés aux plantes, la conservation à long terme des isolats, la caractérisation morphologique et l’extraction totale de l’ADN pour l’identification moléculaire ultérieure et les analyses métagénomiques.

Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes

Le présent protocole décrit l’utilisation de la technologie de codage à barres de l’ADN pour authentifier les matériaux médicinaux à base de plantes et la plante médicinale Angelica sinensis (Oliv.) Diels a été cité en exemple.

Application du code-barres ADN pour identifier les plantes médicinales

Découvrez l'isolement d'ADN robuste et la construction de bibliothèques de séquençage haut-débit à partir de spécimens d'herbier dégradés. Cette méthode maximise l'utilisation des collections historiques en phylogénomique.

Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Explorer plus de vidéos