Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation des Lipopeptides N-terminal pour la détermination de structure par spectrométrie de masse

L’enrichissement des lipoprotéines bactériennes à l’aide d’une phase de surfactant non ionique, méthode de partitionnement est décrite pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou d’autres applications. D’autres mesures sont détaillées pour préparer des N-terminal lipopeptides tryptique pour la caractérisation structurale par spectrométrie de masse.

L’objectif global de cette procédure est d’extraire des lipoprotéines de cellules bactériennes pour des applications directes et de préparer davantage les lipopeptides N-terminaux pour l’analyse structurale par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, car la structure N-terminale des lipoprotéines influence la reconnaissance et la signalisation des récepteurs de type Toll, ce qui a un impact sur la réponse immunitaire de l’hôte. L’avantage unique de cette technique est la formation facultative mais intentionnelle d’adduits sodiques, ce qui favorise la fragmentation vers l’ion déhydroalanyl diagnostique, aidant à l’attribution structurelle de l’état d’acylation de la lipoprotéine.

Cultivez des bactéries dans 15 millilitres de bouillon de soja tryptique ou un milieu riche similaire jusqu’à la fin de la phase exponentielle. Récoltez les cellules par centrifugation avant de les laver une fois avec de l’EDTA ou du TBSE salin tamponné au Tris. remettre en suspension les cellules dans 800 microlitres de TBSE avec un PMSF millimolaire et 0,5 milligramme par millilitre de lysozyme.

Transférez la solution dans un tube de microcentrifugation fileté de 2,0 millilitres avec bouchon à vis et joint torique avant d’incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Ajoutez environ 800 microlitres de billes de silice de zircone de 0,1 millimètre dans le tube, puis perturbez les cellules en les secouant à vitesse maximale sur un homogénéisateur pendant cinq cycles de 30 secondes chacun avec un repos de deux minutes sur de la glace entre chaque cycle. Centrifugez l’échantillon à 3 000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir des billes de pastilles et des cellules intactes.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 millilitres, puis conservez-le sur de la glace. Ajoutez 200 microlitres de TBSE au granulé restant et retournez-le à l’homogénéisateur pour un cycle supplémentaire. Centrifugez comme précédemment et combinez le surnageant avec le surnageant précédent.

Compléter le surnageant avec le tensioactif TX-114 jusqu’à une concentration finale de 2 % en ajoutant un volume égal de tensioactif à 4 % dans du TBSE glacé. Incuber le surnageant supplémenté sur de la glace pendant une heure, en le mélangeant par inversion toutes les 15 minutes. Transférez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant 10 minutes pour induire la séparation de phase.

Centrifuger l’échantillon à 10 000 fois g pendant 10 minutes à température ambiante pour maintenir la séparation biphasique. Pipetez doucement la phase aqueuse supérieure et jetez-la. Ajoutez du TBSE glacé à la phase tensioactive inférieure pour remplir le tube à son volume d’origine et retournez pour mélanger.

Incuber sur glace pendant 10 minutes. Après l’incubation, transférez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant 10 minutes pour induire la séparation de phase, puis centrifugez à 10 000 fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir répété ces étapes une fois de plus pour un total de trois séparations, retirez la phase aqueuse supérieure et jetez-la.

Retirez la pastille de protéines précipitées qui s’est formée au cours des extractions en ajoutant un volume de TBSE glacé à la phase tensioactive. Centrifugez à quatre degrés Celsius et 16 000 fois g pendant deux minutes pour granuler la protéine insoluble. Transférez immédiatement le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2,0 millilitres contenant 1 250 microlitres d’acétone à 100 %.

Mélangez l’échantillon par inversion et incubez pendant une nuit à moins 20 degrés Celsius pour précipiter la protéine. Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g pendant 20 minutes à température ambiante pour granuler les lipoprotéines en faisant attention à l’orientation du tube. Lavez le granulé deux fois avec de l’acétone à 100 % avant de décanter l’acétone et de laisser l’échantillon sécher à l’air.

Ensuite, ajoutez 20 à 40 microlitres de Tris-HCL de 10 millimolaires, pH 8,0, et remettez complètement la pastille en suspension en pipetant de haut en bas contre la paroi avec les lipoprotéines précipitées. Séparez les lipoprotéines par SDS-PAGE en utilisant des méthodes standard. Transférez les lipoprotéines dans une membrane de transfert de nitrocellulose à l’aide d’une procédure standard d’électro-transfert.

Transférez la membrane de nitrocellulose dans un récipient et recouvrez avec la solution Ponceau S. Balancez-vous doucement pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que des bandes rouge-rose soient visibles. Versez la solution de Ponceau S et rincez soigneusement la membrane de nitrocellulose avec de l’eau distillée pour éliminer l’excès de tache.

Avec une lame de rasoir propre, excisez la bande souhaitée et transférez-la dans un tube de microcentrifugation. Lavez la membrane trois fois avec un millilitre d’eau distillée pour détacher complètement la bande. Après avoir transféré la section sur une surface propre, utilisez une lame de rasoir propre pour couper la bande de nitrocellulose en petits morceaux d’environ un millimètre sur un millimètre.

Rassemblez les morceaux dans un tube de microcentrifugation à faible teneur en protéines de 0,5 millilitre. Enfin, lavez les pièces deux fois avec 500 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires fraîchement préparé, pH 7,8, dans une eau de qualité HPLC. Remettre en suspension les morceaux de nitrocellulose dans 20 microlitres d’une solution de 20 microgrammes par millilitre de trypsine dans du bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires.

Vortex les morceaux de nitrocellulose remis en suspension à mélanger. Ensuite, tournez brièvement le tube pour vous assurer que tous les morceaux sont entièrement recouverts par la solution de trypsine. Couvrez le couvercle du tube avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation et incubez le digestat pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Faites tourner l’échantillon à 16 000 fois g pendant 30 secondes et retirez le liquide par pipetage. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,5 % dans de l’eau de qualité HPLC. Après avoir tourbillonné pour mélanger, faites tourner l’échantillon brièvement pour vous assurer que tous les morceaux sont recouverts par la solution et incubez l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante.

Après l’élimination du liquide par pipetage, répétez cette étape avec 50 microlitres d’acétonitrile à 10 %, puis répétez à nouveau avec 50 microlitres d’acétonitrile à 20 %. Pour éluer les lipopeptides étroitement liés, ajoutez 15 microlitres de matrice CHCA de 10 milligrammes par millilitre fraîchement préparée dissoute dans du chloroforme-méthanol. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante avec vortex intermittent.

Pour favoriser la formation d’adduits sodiques, compléter la solution de CHCA dans du chloroforme-méthanol avec du bicarbonate de sodium aqueux jusqu’à une concentration finale d’un millimolaire. Après avoir fait tourner l’échantillon brièvement, à l’aide d’une pipette, transférez soigneusement le liquide dans un nouveau tube de microcentrifugation à faible teneur en protéines. Cette solution contiendra la majeure partie des lipopeptides N-terminaux.

Déposez un microlitre de lipopeptides élués avec CHCA sur une cible MALDI en acier poli. Passez immédiatement à la spectrométrie de masse. Des exemples de spectres de masse des solutions de lavage de nitrocellulose par étapes de la lipoprotéine PnrA d’Enterococcus faecalis sont présentés ici.

À chaque lavage ultérieur, des changements dans l’intensité du signal et une diminution des pics individuels sont observés, culminant avec l’ion lipopeptide N-terminal hautement enrichi dans la fraction d’élution finale. Le spectre MS/MS de l’ion lipopeptide parent révèle qu’il s’agit du lysoforme, avec des ions fragmentaires correspondant au peptide tryptique N-terminal PnrA doté d’une chaîne acyle liée à l’alpha-amino et d’une structure monoacylglycérol. L’ajout de bicarbonate de sodium à la fraction lipopeptidique éluée de la lipoprotéine Lpp d’Escherichia coli entraîne une augmentation de 22 Dalton par rapport à la masse N-terminale calculée.

L’analyse MS/MS de l’ion parent par rapport à son adduit sodique démontre une fragmentation préférentielle vers l’ion déhydroalanyle du parent sodié par élimination neutre de la fraction diaco thioglycéryle. Cela aide à la détermination structurelle de l’état d’acylation N-terminal. Lors de l’exécution de cette procédure, il convient de se rappeler que chaque fraction de lavage de nitrocellulose par étapes peut être analysée par spectrométrie de masse, ce qui permet à la fois l’identification des protéines et la caractérisation N-terminale du lipopeptide en une seule expérience.

Après l’extraction de lipoprotéines à partir de bactéries, d’autres expériences, telles que des tests cellulaires mesurant la signalisation du récepteur de type Toll, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’influence de l’état d’acylation des lipoprotéines sur la réponse immunitaire de l’hôte.