La cartographie métabolique : Cytochimie enzymatique Quantitative et histochimie pour déterminer l’activité des déshydrogénases dans les cellules et tissus
26 mai 2018
Nous présentons ici un protocole qui permet de visualiser et de quantifier l’activité des déshydrogénases dans les cellules et tissus et sa cinétique, la fonction et la localisation sous-cellulaire au microscope.
Cette vidéo montre comment effectuer une cartographie métabolique. Procédure permettant de quantifier l’activité d’enzymes spécifiques appelées déshydrogénases. Les cellules adhèrent à une lame de microscopie ou à un tissu congelé.
Il y a des décennies, nous avons développé toute une série de techniques de cartographie métabolique, alors appelées enzymistochimie, pour détecter l’activité des tissus et des cellules au microscope. Cependant, le métabolisme est devenu obsolète lors de la révolution génétique de la fin du siècle dernier. Mais maintenant, le métabolisme est à nouveau chaud.
Regardez, par exemple, les cellules cancéreuses. Le métabolisme est maintenant considéré comme une cible thérapeutique et, par conséquent, les déterminations de l’activité dans les cellules et les tissus sont à nouveau chaudes. Un composant clé du tampon de réaction est l’alcool polyvinylique, ou PVA.
Celui-ci est dissous dans un tampon phosphate à une concentration de 18 % Le PVA est poussiéreux et toxique lorsqu’il est inhalé, alors assurez-vous de peser le PVA sous une hotte. En raison de la forte concentration de PVA dans le tampon phosphate, chauffez la bouteille de tampon de réaction au bain-marie tout en remuant. Assurez-vous de visser le bouchon sans serrer sur la bouteille, sinon la bouteille pourrait exploser.
Il peut s’écouler jusqu’à 15 minutes avant que le PVA ne soit complètement dissous dans le tampon phosphate. Si c’est le cas, la solution doit être transparente avec de petites bulles d’air causées par l’agitation. La solution visqueuse de PVA peut être pipetée dans des tubes tampons de réaction à l’aide d’une pipette large.
Gardez les tubes à au moins 40 degrés centigrades ou plus pour éviter que le PVA ne se solidifie. Un millilitre de solution de PVA est bon pour environ quatre cytospins, ou deux préparations tissulaires. Pour les autres composants du tampon de réaction, le chlorure de tétrazolium nitroblue jaune, également appelé nitroBT, est dissous dans un mélange d’éthanol et de diméthylformamide, tout en le chauffant dans un flacon en verre dans le bec Bunsen.
La solution ne doit pas arriver à ébullition ou le volume diminuera trop. Ne laissez donc pas le flacon trop longtemps dans la flamme et secouez régulièrement. Gardez-le sur de la glace après avoir été dissous et passez rapidement à l’étape suivante car le nitroBT dissous périt rapidement.
NitroBT est une poudre jaune qui se trouve au fond du flacon en verre contenant de l’éthanol et du DMF lorsqu’elle n’est pas dissoute. Vous pouvez vérifier à quelques reprises si le nitroBT est dissous. La solution sera alors jaune transparente.
Une fois dissous, le nitroBT peut être pipeté dans les flacons contenant la solution de PVA. Remuez doucement à l’aide d’une cuillère fine ou d’une spatule fine pour mélanger le nitroBT et le tampon. Procédez ainsi pour tous les composants du tampon de réaction étape par étape qui sont répertoriés dans le tableau un du texte intégral.
Essayez de ne pas faire trop de bulles d’air pendant que vous mélangez les composants de la réaction dans la solution PVA. L’astuce consiste à remuer continuellement sans retirer la cuillère ou la spatule de la solution. Le vecteur d’électrons, le sulfate de méthyle de méthoxyphénazinium, doit être protégé de la lumière et dissous en dernier dans le tampon de réaction.
La couleur rouge du MPMS est pratique pour vérifier si tous les composants sont correctement dissous. Tout en préparant le tampon de réaction et en y remuant les composants, préchauffez les lames pendant 50 minutes dans un incubateur contenant de l’eau tiède. Gardez un faible niveau d’eau à l’intérieur de la chambre d’incubation.
Avec le couvercle fermé, cela maintiendra l’environnement de réaction humide. Avec le couvercle ouvert, l’eau maintiendra les toboggans à une température chaude. Appliquez le tampon de réaction sur les préparations cellulaires ou tissulaires à l’aide d’une pipette en verre.
Ne vous inquiétez pas des petites bulles d’air car celles-ci s’écouleront vers la surface et n’interféreront pas avec la réaction dans les cellules ou les tissus. Gardez le couvercle de la chambre d’incubation fermé pendant le temps d’incubation. Cela garantira que la réaction se produit dans un environnement humide pour éviter que le tampon PVA ne se dessèche.
La plupart des réactions de déshydrogénase dans les expériences de cartographie métabolique se produisent à 37 degrés centigrades. Incuber les lames dans le tampon de réaction pendant une durée prédéfinie, qui se trouve dans le tableau un de l’article en texte intégral. On peut facilement voir si la réaction a fonctionné ou non, car les cellules, ou les tissus, deviendront bleu foncé ou violet, en raison de l’activité des déshydrogénases.
Qui se transforme finalement en nitroBT incolore insoluble en formazol bleu foncé, qui précipite sur le site de l’activité de la déshydrogénase. La réaction enzymatique est stoppée en trois étapes. Tout d’abord, l’excès de milieu d’incubation doit être tapoté sur un tissu.
Deuxièmement, le milieu d’incubation doit être lavé des lames de microscopie à l’aide d’un lavage mécanique dans un tampon phosphate de PH de 5,3 à 60 degrés centigrades. Troisièmement, les lames de microscopie doivent être laissées dans un tampon de phosphate frais de PH 5,3 à 60 degrés centigrades pendant 20 minutes. Quatrièmement, le tampon phosphate peut être rincé à l’eau du robinet, puis distillé.
On peut facilement voir le tampon de réaction se détacher. Le faible PH du tampon d’arrêt aide à arrêter la réaction de déshydrogénase à l’intérieur des cellules. Placez les diapositives dans un nouveau tampon d’arrêt une ou deux fois en fonction de la quantité de diapositives que vous traitez à la fois.
Rincez également les lames à l’eau du robinet et terminez avec de l’eau distillée. Maintenant, les lames peuvent être séchées sur un chauffe-lames et enfermées. Séchez soigneusement l’arrière de la diapositive en l’essuyant et placez-le sur un chauffe-diapositive préchauffé à 50 à 60 degrés centigrades.
Lorsque les lames sont sèches, une solution de glycérine glycérol et des lamelles peuvent être utilisées pour enfermer et conserver les lames. Conservez les diapositives au réfrigérateur jusqu’à ce que vous procédiez à l’acquisition de l’image. Il s’agit d’une photomicrographie couleur d’une section de tissu représentative sur une lame de verre qui a été traitée dans l’expérience montrée dans cette vidéo.
Il s’agit d’une section de glioblastome et la lepto déshydrogénase est l’enzyme qui a été étudiée. Chaque déshydrogénase produit l’entité PH et chaque molécule d’entité PH convertit une molécule de nitroBT, le sel jaune de tétrazolium, en une molécule de formazol, le précipité violet montré sur cette image. On peut voir une activité élevée de la lactate déshydrogénase intracellulaire dans les cellules tumorales en violet foncé.
Les vaisseaux sanguins ont une activité plus faible et sont blancs. Il s’agit d’une image monochromatique de la même région de la diapositive. Ce qui peut être utilisé pour quantifier l’activité enzymatique telle que décrite dans le protocole.
Plus le formazan est produit, plus le pixel est foncé et plus l’absorbance est élevée. L’absorbance peut ensuite être convertie en picomoles de l’entité ph qui ont été générés. La cartographie métabolique est donc facile à faire.
C’est très rapide et c’est bon marché. Alors, utilisez-le dans vos recherches.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour la visualisation microscopique et la quantification de l'activité des déshydrogénases dans les cellules et les tissus. Il décrit la cinétique, la fonction et la localisation subcellulaire de ces enzymes, en soulignant leur pertinence dans les études métaboliques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Métabolisme
Contexte
- Les déshydrogénases sont des enzymes clés dans les voies métaboliques.
- Les techniques de cartographie métabolique ont évolué au fil des décennies.
- Un intérêt récent pour le métabolisme en tant que cible thérapeutique a relancé ces techniques.
- La compréhension de l'activité enzymatique est essentielle pour l'étude du métabolisme cellulaire.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour quantifier l'activité de la déshydrogénase.
- Mettre en évidence l'importance de la cartographie métabolique dans les recherches actuelles.
- Faciliter la visualisation de la cinétique enzymatique et de la localisation.
Méthodes utilisées
- Préparation de tampons de réaction contenant des composants spécifiques.
- Application des tampons sur des préparations cellulaires ou tissulaires.
- Incubation dans des conditions contrôlées pour permettre la survenue des réactions.
- Visualisation microscopique de l'activité enzymatique par des changements colorimétriques.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de l'activité des déshydrogénases dans divers échantillons.
- Des changements de couleur indiquant l'activité enzymatique ont été observés.
- Le protocole permet la quantification de la cinétique enzymatique.
- Application démontrée sur des coupes de tissu de glioblastome.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour l'étude des déshydrogénases.
- La cartographie métabolique est essentielle pour comprendre le métabolisme cellulaire.
- Les recherches futures peuvent s'appuyer sur ces techniques pour explorer des cibles thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La cartographie métabolique permet une quantification directe et in situ de l'activité des déshydrogénases, offrant des lectures fonctionnelles qui complètent les données génomiques et protéomiques dans la validation de cibles. Cela permet une détection mécanistique des risques en reliant la fonction enzymatique aux phénotypes de la maladie, renforçant ainsi la confiance prédictive en phase précoce de découverte. La compatibilité de cette technique avec les microscopes standards et les plateformes d'analyse d'images permet une intégration évolutive dans les flux de criblage et de recherche translationnelle.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Mesure l'activité enzymatique fonctionnelle dans le contexte cellulaire natif, précisant ainsi l'hypothèse thérapeutique et l'implication des voies métaboliques.
- Valeur opérationnelle : Permet une évaluation rapide de la modulation des déshydrogénases par des perturbations génétiques ou pharmacologiques.
Développement de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives d'activité résolues spatialement, adaptées à la confirmation des hits et au profilage de la réponse en fonction de la dose.
- Valeur opérationnelle : Utilise une lecture chromogénique compatible avec la microscopie monochrome et l'analyse automatisée d'images pour un criblage à débit moyen.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la localisation subcellulaire de l'activité, fournissant des informations sur la pertinence des biomarqueurs dans les tissus associés aux maladies, tels que les sections de tumeurs.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en fournissant des lectures fonctionnelles du métabolisme dans divers systèmes modèles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La cartographie métabolique s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'engagement ciblé à l'optimisation du composé précurseur, en fournissant une validation fonctionnelle qui fait le lien entre les tests biochimiques et les résultats phénotypiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant les variations de l'activité des déshydrogénases en réponse à des modulateurs de voies métaboliques.
- Écrantage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation de l'effet de composés sur des cellules ou tissus fixés.
- Analyse : Permet la comparaison statistique de l'absorbance du formazan comme indicateur du renouvellement enzymatique, facilitant l'analyse des relations structure-activité.
- Recherche translationnelle : Préserve l'architecture tissulaire et la localisation enzymatique, aidant à l'extrapolation vers des modèles précliniques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Nécessite uniquement du matériel de laboratoire standard (incubateur, microscope, pipettes), permettant une adoption généralisée dans différents départements sans infrastructure spécialisée.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en reliant l'activité enzymatique au phénotype cellulaire dans des conditions proches de la physiologie.
- Valeur opérationnelle : Un tampon de réaction standardisé et un protocole d'arrêt garantissent la reproductibilité entre utilisateurs et sites.
- Valeur stratégique : Guide les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant des données métaboliques fonctionnelles prédisant les effets des composés sur le flux des voies métaboliques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles, fondée sur une activité de déshydrogénase validée dans des modèles de maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Compétence technique dans la manipulation de solutions visqueuses de PVA et de transporteurs d'électrons sensibles à la lumière.
- Accès à une microscopie en lumière monochromatique et à un logiciel d'analyse d'images pour la quantification.
- Standardisation du temps d'incubation, de la température et du pH entre les expériences.
- Prise en compte des adaptations nécessaires selon les méthodes de fixation des tissus et les besoins en perméabilité.
- Limite : le format de dosage en point final exclut une surveillance cinétique en temps réel.
![Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie RMN hyperpolarisée [1-13 C]pyruvate et 13C/31P](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-09-01T19%253A57%253A02.000Z&w=384&q=75)
