Name: CRISPR/Cas9-médiation ciblée Integration In Vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Découvrez la stratégie HMEJ pour l'intégration ciblée de transgènes in vivo avec CRISPR/Cas9. Cette méthode améliore l'efficacité de la correction des mutations géniques pour des applications thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par CAS priorité stratégique Research Programme (XDB02050007, XDA01010409), le National Hightech R & D Program (programme 863 ; 2015AA020307), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC accorde 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Chine programme jeunes – mille Talents (HY), Break par le biais de projet de l’Académie des Sciences de Chine, Shanghai ville Comité des sciences et techniques du projet (16JC1420202 à HY), le ministère des sciences et technologies de Chine (la plupart ; 2016YFA0100500).

Toutes les procédures, y compris les sujets animaux ont été approuvés par le Comité d’éthique de recherche biomédicale dans les instituts de Shanghai pour les sciences biologiques (CAS).
1. conception des plasmides de donateurs
<ol><li>
Sélection de sgRNA
	<ol>
<li>Utiliser des outils de conception en ligne CRISPR pour prédire les sgRNAs sur la cible région11,12,13,14,15. Design pour le locus Cdx2 , six différents sgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) autour de l’arrêt codon avec potentiel plus élevé de rang inférieur et le hors-cibles (Figure 1A)16.</li>
		<li>Linéariser 2 µg de vecteurs d’expression Cas9-CMV-EGFP et sgRNA par digestion BbsI (1 µL de BbsI pendant 2 h à 37 ° C, à une concentration finale de 1 U/µL dans un volume de 20 µL). Alors purifier le produit en kit de purification du gel avec un gel d’agarose de 1 % dans un tampon TAE × 1.</li>
		<li>Mélanger une paire des oligonucléotides sgRNA dans 10 µL de tampon de ligase de 1 × T4 ADN à une concentration finale de 50 µM. Incuber la solution oligo en utilisant un gradient de température de 95 ° C à 25 ° C avec un taux de variation de température de 5 ° C/5 min (95 ° C pendant 5 min puis à 90 ° C pendant 5 min, 85 ° C pendant 5 min, etc..), qui va recuire les oligos.</li>
		<li>Mix 4 µL de produit, 2 µL du vecteur linéarisé avec 1 µL de T4 DNA ligase en 10 µL de tampon de 1 × T4 DNA ligase, de recuit et ligaturer puis à 22 ° C pendant 1 à 2 h (Figure 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosage de nucléase arpenteur de sgRNA Remarque : L’efficacité de ciblage de le sgRNA utilisé pour l’expérience de knock-in est évaluée par dosage nucléase arpenteur (également connu sous le nom T7 endonucléase j’ai (T7EI) dosage)17. Sélectionnez le sgRNA avec la haute efficacité de clivage de l’ADN et une faible distance entre le site de découpe de sgRNA et le codon stop.<ol>
<li>Transfecter vecteurs d’expression Cas9-sgRNA-EGFP dans les lignées cellulaires N2a cultivées en DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 1 % PSG et acide aminés non-essentiels à 1 % par la transfection nécessaire (voir la Table des matières). Incuber les cellules transfectées à 37 ° C à 5 % de CO2.</li>
		<li>Après 48 h d’incubation, recueillir 5 000 cellules transfectées (GFP+) par cellule activée par fluorescence triant (FACS) à l’aide de cellules non transfectées comme un contrôle.</li>
		<li>Digérer les cellules recueillies dans 2 à 5 µL oflysis un tampon (0,1 % X-100 Triton, 0,1 % Tween 20 et 100 µg/mL protéinase K) à 56 ° C pendant 30 min, et puis la chaleur inactiver protéinase K à 95 ° C pendant 10 min.</li>
		<li>Amplifier l’échantillon par PCR nichée (tableau 1) à l’aide du protocole par le fabricant. La taille des produits PCR est définie à 300-500 PB.<ol>
<li>Mélanger 1 µL de produit de lyse avec ADN polymérase et une paire d’amorces externes reconnaissant la séquence autour du site de cible sgRNA (0,1 µM, concentration finale) (tableau 1) et réaliser la PCR primaire dans un volume de 20 µL.</li>
			<li>Activer l’ADN polymérase à 95 ° C pendant 5 min et effectuer le PCR primaire pour cycles de 30 à 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 24 s (1 min/1KO), avec une extension finale à 72 ° C pendant 5 min.</li>
			<li>Effectuer la PCR secondaire à l’aide de 1 µL de produit PCR primaire et une paire d’amorces internes imbriqués.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dénaturer et re-recuire 300-600 ng du produit PCR purifié dans 20 µL de 1 tampon de réaction T7EI × (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7,9) utilisant un gradient de température de 95 ° C à 25 ° C avec un taux de 5 ° C/5 min.</li>
		<li>Ajouter 1 µL d’enzyme T7EI aux produits PCR recuits et digérer à 37 ° C pendant 2 h. Avant d’exécuter le produit de digestion sur gel d’agarose 2 % dans un tampon TAE 1 × à 120 V pendant 40 min jusqu'à ce que les fragments sont séparés (voir Table des matières).</li>
		<li>ImageJ permet de déterminer les intensités de bande de coupe et d’ADN non circonci. Calculer la fréquence indel utilisant les méthodes tel que déjà signalé9 (Figure 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construction du vecteur de donateurs NOTE : Pour générer des vecteurs donneur HMEJ Cdx2 gène, construire un donneur de l’ADN (bp HAL-p2A-mCherry-800 800 bp HAR) flanqué de 23 nt Cdx2-sgRNAs ciblage séquence aux deux extrémités (Figure 1D etEde la Figure 1). La PAM de la séquence cible était adjacente à l’extrémité du bras homologue. Assemblée de Gibson est recommandée pour les donateurs HMEJ clonage.<ol>
<li>Amplifier le bras gauche une homologie de 800 bp (HAL) avec apprêt avant-1F (contenant 15-20 nt chevauchement des séquences du vecteur, 23 nt Cdx2-sgRNA séquence de ciblage et environ 20 séquence nt de HAL) et reverse primer-1R (contenant la séquence de chevauchement de Pb de 15-20 de p2A-mCherry et environ 20 séquence nt de HAL) à la concentration finale de 0,1 µM à l’aide de l’ADN génomique de souris à 200 ng/µL (Figure 1D, tableau 1).</li>
		<li>Amplifier le fragment d’insertion p2A-mCherry avec avant apprêt-2F (contenant la séquence de chevauchement de nt de 15-20 de HAL et environ 20 séquence nt de fragment d’insertion) et reverse primer-2R (contenant la séquence de chevauchement de nt de 15-20 de HAR et environ 20 séquence nt de le fragment d’insertion) à la concentration finale de 0,1 µM en utilisant l’ADN génomique ou plasmide avec des séquences de journaliste à 100 ng/µL ou 30 ng/µL (Figure 1D, tableau 1).</li>
		<li>Amplifier le bras de droite homologie bp 800 (HAR) avec apprêt avant-3F (contenant 15-20 nt chevauchement des séquences du vecteur, 23 nt Cdx2-sgRNA séquence de ciblage et environ 20 séquence nt de HAR) et reverse primer-3R (contenant la séquence de chevauchement de nt de 15-20 de p2A-mCherry et environ 20 séquence nt de HAR) à la concentration finale de 0,1 µM à l’aide de l’ADN génomique de souris à 200 ng/µL (Figure 1D, tableau 1).</li>
		<li>Exécutez tous les produits PCR sur gel d’agarose à 1 % dans 1 × un tampon TAE et purifier les produits PCR de taille attendue par gel kit d’extraction, conformément aux instructions du fabricant (tableau 1).</li>
		<li>Digérer les 50-100 ng d’un vecteur de construction avec KpnI et XbaI. Mix 2 µL du vecteur linéarisé à 30-40 ng/µL avec trois PCR amplification fragments (1 µL de chaque, 100-200 ng/µL) dans 2 x mix Gibson. Ajouter H2O pour ajuster le volume final à 10 µL.Incubate le mélange à 50 ° C pendant 60 min.</li>
		<li>Compétentes d' Escherichia coli de transformer les cellules avec tous les produits assemblés et extrait le plasmide construit par kit d’extraction d’ADN selon les instructions du fabricant. Vérifiez le donateur HMEJ par séquençage de l’ADN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. génome édition dans des embryons de souris à l’aide de la méthode axée sur les HMEJ
<ol><li>
Production d’ARNm Cas9
	<ol>
<li>Pour la préparation de l’ARNm de Cas9, ajouter la séquence du promoteur T7 à la Cas9 région codante de l’amplification par PCR à l’aide de la paire d’amorces appropriés énumérée au tableau 1. Ajouter l’apprêt Cas9 F/R à une concentration finale de 0,1 µM et 20 ng de Cas9 exprimant vector à 1 × haute fidélité mélange de l’ADN polymérase. Ajuster le volume final à 50 µL avec H2O.</li>
		<li>Activer l’ADN polymérase à 95 ° C pendant 5 min et effectuer le PCR pour 36 cycles à 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 4 min (1 min/1KO), avec une extension finale à 68 ° C pendant 10 min.</li>
		<li>Purifier le produit PCR de T7-Cas9 pour la transcription in vitro (IVT) et ensuite transcrire 0,5 à 1 µg ADN par kit de transcription ARNm à 37 ° C pendant 8 h dans un volume total de 20 µL, selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
		<li>Ajouter 1 µL de DNase dans le mélange pour supprimer la matrice d’ADN à 37 ° C pendant 15 min. Ajouter une queue poly-A 45 min à 37 ° C et récupérer l’ARNm Cas9 par kit de purification d’ARN, selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Production de sgRNA
	<ol>
<li>Générer le modèle de sgRNA moteur par un promoteur T7 avec haute fidélité ADN polymérase comme ci-dessus. Choisissez un échafaudage sgRNA contenant le vecteur comme modèle. Les amorces utilisées sont énumérés au tableau 1.</li>
		<li>Purifier le produit PCR de T7-sgRNA et l’utilisation de 0,5 à 1 µg ADN comme modèle pour la transcription in vitro de sgRNA à l’aide d’un kit de transcription d’ARN court à 37 ° C pendant 6 h dans un volume total de 20 µL, selon les instructions du fabricant (voir Table des matières < / c11 >).</li>
		<li>Ajouter 1 µL de DNase dans le mélange et continuer de l’incubation à 37 ° C pendant 15 min enlever la matrice d’ADN. Purifier le sgRNAs en kit de purification d’ARN, comme indiqué ci-dessus (voir Table des matières).</li>
		<li>Diluer le sgRNA à 500 ng/µL dans de l’eau exempte de RNase et stocker les échantillons à −80 ° C pendant 3 mois. NOTE : Ribonucléoprotéines CRISPR (RNP) sont une alternative substitution avec un découpage meilleure efficacité18,19,20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Culture collection, microinjection et in vitro d’embryons
	<ol>
<li>Superovulate B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) des souris femelles (7-8 semaines) de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG), suivies par la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) 48 h plus tard. Après l’injection d’hCG, maison les femelles avec les mâles B6D2F1 pendant la nuit.</li>
		<li>Sacrifier les femelles en CO2 anesthésie, 24 h après l’injection d’hCG. Recueillir les embryons fécondés de leurs oviductes (avec des embryons de 30 à 50 pour chaque femelle) dans un milieu M2.</li>
		<li>Place les embryons fécondés (environ 300 oeufs pour une journée injection) dans un milieu HLGHW (5,55 g/L de NaCl, 0,19 g/L de KCl, 0,05 g/L KH2PO4, 0,05 g/L MgSO4•7H2O, 0,04 g/L de Glucose, 1,12 g/L Sodium lactate, 2,1 g/L NaHCO3 , pyruvate de Sodium 0,02 g/L, 0,25 g/L CaCl2•2H2O, 0,004 g/L d’EDTA, 0,146 g/L, L-glutamine et 1 g/L d’albumine sérique Bovine) à 37 ° C dans un incubateur avec 5 % de CO2.</li>
		<li>Mix Cas9 ARNm (100 ng/µL), sgRNA (50 ng/µL) et donateurs HMEJ vector (100 ng/µL) et ajouter H2O pour ajuster le volume final à 10 µL. mettre le mélange sur la glace.</li>
		<li>Tirer les aiguilles capillaires (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,78 mm avec filament) à l’aide d’une Micropipette extracteur (paramètres : chaleur, pression, 300 ; vitesse, 80, 74 ; temporisation/200 ; traction, 60. Voir Table des matières). Les aiguilles commerciales serait une substitution alternative pour la microinjection.</li>
		<li>Injecter un volume probable du mélange dans le cytoplasme des zygotes pronucléus bien définies dans une goutte de milieu HEPES-CZB contenant 5 µg/mL cytochalasine B à l’aide d’un microinjector avec la constante de débit de paramètres (Figure 2A) (voir Table des matières)21. Remarque : Chaque groupe de zygotes doit être injecté dans les 20-30 min. cytochalasine B pourrait augmenter la viabilité du zygote de souris après injection. Par ailleurs, microinjection peut fonctionner avec le système piezo, comme décrit plus haut22.</li>
		<li>Culture les zygotes injectés dans un milieu HLGHW à 37 ° C, moins de 5 % de CO2 jusqu'à ce que le blastocyste étape après 3,5 jours pour observation de fluorescence (Figures 2 b et 2C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfert d’embryons et de génération de souris
	<ol>
<li>S’accouplent œstrus souris femelles ICR avec vasectomisés souris mâles ICR sur le même jour que l’injection.</li>
		<li>Culture les zygotes injectées dans l’étape 2 cellules à 37 ° C sous 5 % CO2et des embryons de 2 cellules de transfert 25-30 dans les oviductes des femelles pseudo-gravides de l’IC à 0,5 jour post coitum (dpc). Mères bénéficiaires fournissent des chiots à 19,5 dpc.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Génotypage de souris
	<ol>
<li>Extraire l’ADN génomique de souris d’orteil ou queue des échantillons à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN, selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
		<li>Identifier la jonction 5' et 3' de knock-in les événements à l’aide de 200 à 400 ng d’ADN génomique mesurée par spectrométrie UV/vis en tant que modèle pour effectuer l’ampliﬁcation PCR.<ol>
<li>Activer l’ADN polymérase à 95 ° C pendant 5 min et effectuer le PCR pour 38 cycles à 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 minute (1 min/1KO), avec une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. Pour la jonction 5', utiliser l’apprêt avant à l’amont de la HAL, avec la marche arrière sur le fragment de knock-in (p2A-mCherry). Quant à 3' junction, utiliser l’apprêt avant sur le fragment de knock-in (p2A-mCherry), avec celui inverse sur l’aval de l’HAR (tableau 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Courir 6 µL du produit PCR sur gel d’agarose de 1 % à 1 tampon TAE × et vérifier la taille des fragments attendus. Puis vérifier leur ADN ordonnançant (Figure 2D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. base HMEJ In Vivo génome d’édition dans les hépatocytes
<ol><li>Placer la souris C57BL/6J bénéficiaire (8 semaines) dans un dispositif de retenue et de mettre la queue dans la fente.</li>
	<li>Mélanger HMEJ donneur vecteurs (30 µg) et des vecteurs d’expression spCas9 (30 µg) dans 2 mL de solution saline. Pour l’expérience de contrôle, suspendre les vecteurs de donateurs HMEJ (30 µg) dans 2 mL de solution saline (Figure 3A).</li>
	<li>Nettoyer la queue de la souris avec l’éthanol à 70 %. Insérer l’aiguille dans la queue de la veine et injecter la solution d’ADN de plasmide visé par l’article 5-7, retirer l’aiguille et relâchez le bouton de la souris depuis le dispositif de retenue.</li>
	<li>Sacrifier les souris en CO2 anesthésie après 5 à 9 jours après l’injection. Perfuse le transcardially de la souris avec la solution saline à 0,9 %, suivie de paraformaldéhyde à 4 % à l’aide d’une pompe péristaltique et fixer le foie pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Déshydrater le tissu à l’aide de 30 % de saccharose du jour au lendemain, jusqu'à ce qu’il coule au fond du tube.</li>
	<li>Section du tissu congelé sur une épaisseur de 10 µm pour les échantillons de foie.</li>
	<li>Rincez les sections trois fois en 0,1 M tamponnée au phosphate (PB) et leur incubation avec l’anticorps primaire : anti-mCherry de lapin (dilué à 5 % NGS) durant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver les sections trois fois dans PB et puis les incuber avec anticorps secondaire : Cy3-AffiniPure chèvre anti-lapin IgG pendant 2 h à température ambiante dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Contre-coloration les sections au DAPI pendant 20 min et monter avec de la glycérine sur lames de verre pour une observation de fluorescence (Figure 3B) supplémentaires.</li>
</ol>

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<li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR%2FCas+Ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li>
<li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li>
<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes plus critiques dans la construction des plasmides de donateurs HMEJ sont : (1) sélection de la sgRNA avec la haute efficacité de clivage de l’ADN et de la faible distance entre site de coupe sgRNA et codon stop (2) bonne interprétation du donneur HMEJ. CRISPR/Cas9-mediated clivage sur les deux vecteurs de donneur transgène (contenant des sites cibles sgRNA et armes de l’homologie ~ 800 bp) et le génome ciblée est nécessaire pour l’intégration ciblée efficace et précise in vivo. Les étapes plus critiqu...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Montage précis et ciblé du génome est souvent requis pour produire des modèles animaux génétiquement modifiés et thérapies cliniques. Beaucoup s’est efforcé de développer diverses stratégies pour génome ciblé efficace, édition, comme la nucléase de doigt de zinc (ZFN), nucléases effecteur comme activateur de transcription (TAPS) et les systèmes CRISPR/Cas9. Ces stratégies de créer des cassures double brin de l’ADN (DSB) dans le génome et tirent parti des systèmes de réparation de l’ADN intrinsèques, tels que la recombinaison (HR)1,2, microhomology-mediated fin rejoindre (MMEJ)3 , 4 , 5et à la fin non homologue rejoindre (NHEJ)6,7,8 pour provoquer l’intégration ciblée des transgènes1,9. La stratégie axée sur les ressources humaines est actuellement le plus utilisé du génome édition approche, qui est très efficace dans les lignées cellulaires, mais pas facilement accessible aux non-diviser des cellules en raison de son occurrence limitée à la fin de la phase S/G2. Ainsi, la stratégie axée sur les ressources humaines n’est pas applicable pour l’édition de génome en vivo . Récemment, la stratégie axée sur la NHEJ a été développée pour le gène efficace knock-in dans la souris tissus8. Néanmoins, la méthode de NHEJ introduit généralement indels au niveau des jonctions, rendant difficile générer l’édition génome précis, surtout lorsque vous essayez de construire dans le cadre de fusion de gènes8. MMEJ l’intégration ciblée est capable de génome précis édition. Toutefois, elle n'augmente que modestement l’efficacité de l’intégration ciblée dans les précédents rapports5. Par conséquent, l’amélioration de l’intégration ciblée précise en vivo est absolument nécessaire pour des applications thérapeutiques large3.
Dans un ouvrage récemment publié, nous avons démontré une fin médiée par homologie rejoindre (HMEJ)-basé de stratégie, qui a montré la plus grande efficacité de l’intégration ciblée dans des stratégies signalés tous les deux in vitro et in vivo10. Ici, les auteurs décrivent un protocole portant création du système HMEJ, et aussi la construction des vecteurs RNA (sgRNA) single-guide ciblant le gène d’intérêt et le donateur vecteurs hébergeant sites de cibles sgRNA et ~ 800 bp d’armes homologie (Figure 1) . Dans ce protocole, nous décrivons également les étapes détaillées pour la génération de souris knock-in DNA et brèves étapes pour une intégration ciblée dans les tissus en vivo. Par ailleurs, une étude de validation de la stratégie axée sur les HMEJ a démontré sa capacité à corriger la mutation Fah et sauvetage Fah- / - foie échec souris, qui de plus a révélé son potentiel thérapeutique.

<table><tbody><tr><td>vecteur pAAV pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Addgene</td><td></td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td><td>Vecteur AAV pour l’encodage d’un SpCas9 optimisé pour les codons humains piloté par le promoteur</td></tr><tr><td>EFs AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td><td>Addgene</td><td>97308</td><td>Donateur HMEJ pour la fusion d’un rapporteur p2A-mCherry à la souris Actb. EGFP piloté par le promoteur EF1a et les ARNsg pilotés par U6 ciblant Actb. Épine dorsale AAV.</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 donneur HMEJ</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>donneur HMEJ pour la fusion d’un rapporteur p2A-mCherry avec le souris Cdx2.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Technologie</td><td>de vie</td> du réactif de transfection <td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Technologies de vie</td><td>de l’eau sans nucléases</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonucléase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid EndoFree-Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Extracteur de micropipette</td><td>Sutter</td><td>Instrument P-97</td><td>&nbsp ; Extracteur de micropipette (paramètres : chaleur, 74 ; tirage, 60 ; vélocité, 80 ; temps/délai, 200 ; pression, 300)</td></tr><tr><td>Instrument Sutter en</td> <td>verre borosilicaté</td><td>B100-78-10</td><td>type de capillaires (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,78 mm avec filament)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micro-injecteur FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome de congélation</td><td>Leica</td><td>CM1950-Cryostat</td><td>epaisseur&nbsp ; de&nbsp ; 40&nbsp ; &mu ; m&nbsp ; pour&nbsp ; cerveau,&nbsp ; 10 &mu ; m&nbsp ; pour&nbsp ; foie</td></tr><tr><td>Lapin anti-mCherry</td><td>GeneTex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Chèvre Anti-Lapin IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen,Strep,Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’Extraction de Gel</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Ningbo Sansheng Medicine</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Ningbo Sansheng Medicine</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>CAT#C6762</td><td></td></tr><tr><td>KSOM+AA avec D-Glucose et Phenol</td><td>Red Millipore</td><td>CAT#MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium avec Phenol Red</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9-médiation ciblée integration in vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Comme une plateforme de montage prometteurs du génome, le système CRISPR/Cas9 a un grand potentiel pour des manipulations génétiques efficace, surtout pour l’intégration ciblée des transgènes. Cependant, en raison de la faible efficacité de la recombinaison (HR) et différentes mutations indel de fin non homologue rejoindre (NHEJ)-base de stratégies dans les cellules non-divisant, in vivo du génome édition reste un grand défi. Nous décrivons ici une fin médiée par homologie rejoindre (HMEJ)-CRISPR/Cas9 système d’intégration ciblées précis efficace in vivo . Dans ce système, le génome ciblé et le donateur vecteur contenant armes d’homologie (~ 800 bp) flanqué de cible de RNA (sgRNA) guide unique séquences sont clivés par CRISPR/Cas9. Cette stratégie axée sur les HMEJ réalise intégration du transgène efficace zygotes de souris, ainsi que dans les hépatocytes in vivo. En outre, une stratégie HMEJ propose une approche efficace pour la correction de la fumarylacétoacétate hydrolase (Fah) mutation dans les hépatocytes et sauve Fah-carence induite par souris d’insuffisance hépatique. Pris ensemble, en se concentrant sur ciblé intégration, cette stratégie HMEJ fournit un outil prometteur pour une variété d’applications, y compris la génération de modèles animaux génétiquement modifiés et les thérapies géniques ciblées.

Base HMEJ génome d’édition dans des embryons de souris : Pour définir la knock-in l’efficacité de la méthode axée sur les HMEJ zygotes de souris, nous avons livré Cas9 ARNm, sgRNA ciblant le gène Cdx2 et le donateur HMEJ en zygotes de souris, qui a été conçu pour fusionner un gène rapporteur de p2A-mCherry pour le dernier codon de le Cdx2 gène (Figure 2A). Les zygotes injectés est devenue blastocystes dans l...

Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système fournit un outil prometteur pour le génie génétique et ouvre la possibilité d’une intégration ciblée des transgènes. Nous décrivons une fin médiée par homologie rejoindre (HMEJ)-basé de stratégie pour ADN efficace visant l’intégration en vivo et ciblé des thérapies géniques en utilisant CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-médiation ciblée Integration In Vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

L’objectif global de cette stratégie HMEJ est de fournir un outil génétique prometteur pour une variété d’applications, y compris la génération de modèles animaux génétiquement modifiés et les thérapies géniques ciblées. Ce HMEJ a adopté la mesure. Peut également avoir des questions clés dans le domaine génétique et neurologique.Par exemple, comment améliorer l’efficacité de l’intégration ciblée précise des transgènes in vivo. Le principal avantage de cette stratégie basée sur HMEJ est la capacité à corriger les mutations génétiques avec une grande efficacité in vivo. Ce qui a suivi a un potentiel thérapeutique.Xing Wang, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer le protocole, collectez 5000 cellules N2a, préalablement transfectées avec des vecteurs d’expression de l’ARNg Cas9 EGFP par tri cellulaire activé par fluorescence ou FACS, en utilisant des cellules non transfectées comme contrôle. Digérer les cellules collectées dans 2 à 5 microlitres de tampon de lyse à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, chauffez et activez la protéinase K à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Amplifiez l’échantillon par PCR imbriquée à l’a

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Dans cette vidéo, nous démontrons l’édition du génome tout-en-un basée sur CRISPR-Cas9 dans des cellules en culture où Cas9 et l’ARNsg sont fournis en tant que construction plasmidique unique aux cellules. Le système CRISPR-Cas9 et le gène souhaité à insérer ont été introduits dans les cellules par technique d’électroporation pour faciliter l’édition de gènes.

Édition du génome CRISPR tout-en-un : une méthode d’inhibition de gènes basée sur la réparation dirigée par homologie dans des cellules cultivées à l’aide du système CRISPR-Cas9

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Ce protocole décrit le flux de travail d’un gène CRISPR/Cas9-base de montage pour la réparation des mutations ponctuelles dans les cellules de mammifères. Ici, nous utilisons une approche combinatoire de gène avec une stratégie expérimentale suivie détaillée pour mesurer la formation indel au site cible — analyse essentiellement, mutagenèse sur place.

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

Décrite ici, c’est un protocole pour le marquage de façon endogène des protéines avec des étiquettes fluorescentes dans les cellules souches humaines pluripotentes induites à l’aide de CRISPR/Cas9 exprimées. Cellules putativement édités sont enrichis en triant les cellules fluorescence activé et lignées clonales sont générées.

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Cette étude fournit une procédure systématiquement optimisée de construction à base de ribonucléase CRISPR/Cas9 de mutants homozygotes ainsi qu’une méthode détaillée de cryoconservation et de réanimation des œufs de criquets.

Construction de mutants homozygotes du criquet migrateur à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9

Un obstacle important aux technologies comme CRISPR est les événements hors cible qui peuvent perturber les gènes vitaux. La « circularisation pour la notification in vitro des effets de clivage par séquençage » (CIRCLE-seq) est une technique conçue pour identifier les sites de clivage non intentionnels. Cette méthode cartographie l’activité à l’échelle du génome de CRISPR-Cas9 avec une sensibilité élevée et sans biais.

CIRCLE-Seq pour l’interrogation de l’édition de gènes hors cible

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Découvrez la stratégie HMEJ pour l'intégration ciblée de transgènes in vivo avec CRISPR/Cas9. Cette méthode améliore l'efficacité de la correction des mutations géniques pour des applications thérapeutiques.

CRISPR/Cas9-médiation ciblée Integration In Vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie

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