Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage

L’objectif global de ce séquençage d’amplicon ARNr 16S à haut débit est de caractériser la composition globale du microbiome à partir d’échantillons fécaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la composition microbienne globale associée à de nombreux domaines d’intérêt tels que le métabolisme, la digestion et l’inflammation intestinale et systémique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de recenser les communautés microbiennes aérobies et anaérobies présentes dans l’échantillon fécal, y compris les bactéries difficiles à cultiver.

Cette méthode permet de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons fécaux grâce à une ligne de pompage de traitement rapide sans côlon et a permis d’obtenir un séquençage d’amplicon 16S rRNA-S, robuste et reproductible. Pour ce protocole, ayez des échantillons d’excréments congelés qui ont à peu près la taille d’une gomme à crayon. Les échantillons doivent être conservés dans des tubes de deux millilitres avec l’extrémité coupée de l’écouvillon de prélèvement.

Inclure des témoins négatifs composés d’écouvillons sans matières fécales et de contrôles internes en double, et avoir des copies d’échantillon des selles d’origine pour servir de contrôle interne. Commencez par décongeler les solutions d’extraction et de dilution à température ambiante avec les échantillons fécaux et les échantillons témoins. Une fois décongelé, ajoutez 250 microlitres de solution d’extraction dans chaque tube d’échantillon et mélangez les matières fécales dans la solution à l’aide d’un vortex.

À ce stade, introduisez des contrôles négatifs de tampon uniquement. Ensuite, chauffez les échantillons pendant 10 minutes dans un bain d’eau bouillante. Après l’incubation dans de l’eau bouillante, ajoutez 250 microlitres de solution de dilution à chaque échantillon et vortex les échantillons à mélanger.

Stockez ensuite les tubes d’échantillon à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que la PCR puisse être effectuée. Installez les PCR sur un poste de travail pré-PCR qui a été nettoyé des contaminants potentiels de l’ADN tels que les matrices et les amplicons. Étiquetez les apprêts selon leur code-barres et diluez-les dans de l’eau distillée deux fois jusqu’à une concentration de 50 micromolaires.

Conservez les stocks d’apprêt dilué à moins 20 degrés Celsius et décongelez-les complètement avant utilisation. Pour chaque échantillon, préparez une plaque de 96 puits pour 32 réactions en trois exemplaires. Après le réchauffement à température ambiante, diluez les aliquotes de l’amorce directe et des 32 amorces inverses à cinq micromolaires pour la PCR.

Préparez ensuite suffisamment de mélange PCR de base pour 100 réactions. Combinez 100 microlitres d’amorce avant à cinq micromolaires avec un millilitre de master mix PCR 2X et 400 microlitres d’eau distillée doublement. Vortex ce mélange, puis chargez 15 microlitres de ce mélange dans chacun des 96 puits.

Ensuite, chargez des ensembles de trois puits chacun avec un microlitre d’amorce inverse de cinq micromolaires. Ainsi, chargez les 32 index inverses différents dans la plaque. Ensuite, dans chaque puits de plaque, ajoutez quatre microlitres de l’échantillon d’ADN extrait.

Cela se fait sur un banc propre. Exécutez maintenant la PCR avec une dénaturation initiale de trois minutes suivie de 35 cycles avec une minute de dénaturation et un agenouillement à 55 degrés Celsius et une minute d’extension. Terminez par une dernière prolongation de 10 minutes.

Une fois la réaction terminée, travaillez dans un atelier dédié post-PCR. Là, combinez chaque ensemble de produits PCR triples dans un seul tube pour 60 microlitres par échantillon. Ensuite, analysez quatre microlitres de chaque échantillon sur un gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium.

Les Amplicons positifs apparaîtront entre 375 et 425 paires de bases. Les contrôles négatifs sont montrés et sont traités avec les amplicons positifs de l’étude. Quantifier les concentrations d’ADN des produits de réaction positifs selon les instructions du fabricant.

Combinez ensuite 500 nanogrammes d’ADN de chacun des produits dans un seul tube. Vortex ce mélange puis épuisez 200 microlitres sur un gel à 1 % comme précédemment. Extrayez maintenant les bandes du gel entre 375 et 425 paires de bases.

Ensuite, préparez la bibliothèque pour le séquençage. Mesurer la concentration à l’aide d’un kit de détection d’ADN double brin très sensible selon les instructions du fabricant, suivi de l’utilisation d’un kit de séparation et d’analyse très sensible. Ensuite, diluez la bibliothèque à sept picomolaires et combinez-la quatre pour un avec une bibliothèque de contrôle.

Maintenant que l’échantillon est prêt pour le séquençage, transférez-le vers la machine de séquençage. La méthode décrite pour la préparation d’une banque à partir d’échantillons de selles a été utilisée pour analyser le microbiome de patients hospitalisés présentant une diarrhée infectieuse suspectée. En parallèle, des échantillons de selles ont également été soumis à une culture traditionnelle dans un laboratoire de microbiologie.

Des échantillons de selles d’adultes en bonne santé ont été séquencés à des fins de comparaison. Plusieurs échantillons témoins négatifs ont été inclus, la PCR sans modèle, la PCR sur écouvillons propres et stériles dans une solution d’extraction et de dilution et la PCR sur des solutions mixtes d’extraction et de dilution. Chacun d’entre eux avait moins de 118 lectures totales qui étaient principalement des taxons de mycoplasmes.

Les échantillons standard ont donné en moyenne plus de 10 000 lectures sans identification de mycoplasme après le contrôle de la qualité. La cohérence et la variabilité des échantillons ont été mesurées à l’aide de 16 échantillons de selles préparés avec deux amorces à code-barres différentes afin de construire deux banques différentes à partir de chaque échantillon. La moitié des échantillons étaient positifs pour Campylobacter salmonella ou Shigella dans la technique de culture traditionnelle.

À l’aide des résultats du séquençage 16S, un graphique en aires au niveau de l’embranchement montre la cohérence entre les banques fabriquées à partir des mêmes échantillons, indépendamment des résultats de culture traditionnels. À partir de ce groupe de 16 échantillons appariés, l’analyse des coordonnées principales a révélé que les paires d’échantillons sont étroitement alignées et que les échantillons de culture positifs avaient une valeur PC1 significativement différente de celle des échantillons de culture négative. Une analyse plus approfondie des échantillons a révélé que des niveaux élevés de protéobactéries n’ont été trouvés que chez les patients hospitalisés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons fécaux à l’aide d’une extraction d’ADN sans côlon et d’une PCR pour générer des banques de séquençage à code-barres de la variable microbienne V4. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans un environnement organisé et propre, en particulier lors de la préparation des bibliothèques. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de selles humaines est dangereux et qu’un équipement de protection individuelle doit toujours être porté lors de cette procédure.