Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les niveaux absolus de microARN plasmatiques à l’aide de la PCR quantitative de transcription inverse en temps réel. Cette méthode peut aider à évaluer la quantité de microARN plasmatiques, même si leur niveau d’expression est faible. Le principal avantage de cette technique est que les données mesurées peuvent être comparées à d’autres provenant d’études ou de laboratoires différents.

Les implications de cette technique s’étendent aux échantillons d’autres espèces, car une courbe standard peut être générée en utilisant l’ARN synthétique ou le nucléotide. Cette méthode peut donner un aperçu de la recherche translationnelle pour étudier des biomarqueurs d’innocuité prometteurs. Tout d’abord, décongelez les échantillons de plasma congelé obtenus dans la veine fémorale des singes Cynomolgus sur de la glace.

Transférez le réactif de lyse dans du chloroforme sur de la glace pour le refroidissement avant l’extraction de l’ARN. Ensuite, ajoutez 1 000 microlitres de réactif de lyse à 200 microlitres de l’échantillon. Et vortex pendant une minute pour assurer un bon mélange.

Ajoutez ensuite cinq microlitres de cinq microARN synthétiques nanomolaires de Caenorhabditis elegans et 200 microlitres de chloroforme à l’échantillon. Agitez l’échantillon pendant une minute pour qu’il se mélange correctement. Ensuite, placez l’échantillon sur de la glace pendant deux à trois minutes.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 12 000 G, pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez soigneusement 650 microlitres de la phase aqueuse dans un nouveau microtube. Ensuite, ajoutez 975 microlitres d’éthanol à la phase aqueuse et pipetez plusieurs fois pour assurer un mélange complet.

Transférez l’échantillon dans la colonne et l’adaptateur correspondants, puis séchez-le sous vide pendant trois minutes à l’aide de collecteurs à vide. Ajoutez ensuite 200 microlitres d’éthanol dans la colonne et faites sécher sous vide pendant une minute. Après le séchage sous vide, ajoutez 800 microlitres de RWT Buffer dans la colonne et, encore une fois, faites sécher sous vide pendant deux minutes.

Ajoutez ensuite 800 microlitres de tampon RPE dans la colonne et faites sécher sous vide pendant deux minutes. Ajoutez le tampon RPE deux fois, puis séchez sous vide. Ensuite, ajoutez 300 microlitres d’éthanol dans la colonne.

Après avoir ajouté de l’éthanol, séchez sous vide pendant une minute. Ensuite, transférez la colonne dans un nouveau microtube et centrifugez-le à 12 000 G à température ambiante pendant une minute. Après la centrifugation, transférez la colonne dans un nouveau microtube et ajoutez-y 50 microlitres d’eau sans nucléases.

Laissez reposer la colonne à température ambiante pendant trois minutes, puis centrifugez-la à 8 000 g à température ambiante pendant une minute. Enfin, conservez l’éluat à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour préparer une concentration d’oligonucléotides d’ARN synthétique qui correspond au microARN cible, diluez la solution mère 10 fois pour obtenir une solution de travail avec la concentration la plus élevée pour tracer les courbes standard.

Ensuite, pour constituer un pool multiplex d’amorces de transcription inverse, mélangez des volumes égaux d’amorces de force 20 pour les microARN cibles. Ensuite, préparez le mélange de réaction de transcription inverse. Ajoutez ensuite 10 microlitres de mélange de réaction de transcription inverse à cinq microlitres d’échantillon d’ARN.

Mélangez les deux en pipetant plusieurs fois. Ensuite, incubez le mélange sur de la glace pendant cinq minutes. Après avoir placé l’échantillon dans le thermocycleur, démarrez le cycle.

Une fois le programme terminé, stockez l’échantillon transcrit inversé à moins 80 degrés Celsius. Pour constituer le pool d’amorces de test multiplex, ajoutez des volumes égaux de cinq microlitres d’amorces de test correspondant à des microARN cibles dans le tube contenant le tampon Tris-EDTA dans le volume final de 1 000 microlitres. Ensuite, constituez le mélange de réaction de préamplification.

Une fois le mélange réactionnel terminé, transférez 22,5 microlitres de mélange réactionnel de préamplification dans deux virgule cinq microlitres d’échantillon transcrit inversé. Ensuite, pipetez pour mélanger l’échantillon et le master mix de préamplification à fond et incubez sur de la glace pendant cinq minutes, puis laissez les tubes PCR dans le thermocycleur et commencez le cycle. Une fois le programme terminé, transférez tous les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Après décongélation des échantillons pré-amplifiés ou non pré-amplifiés, diluez-les cinq fois avec de l’eau stérile. Pour générer la courbe standard, effectuez une dilution en série de 10 fois des échantillons dérivés d’oligonucléotides d’ARN synthétiques. Ensuite, constituez le mélange de réaction PCR quantitative dans un tube maintenu sur de la glace.

Ajoutez ensuite 18 microlitres du mélange de réaction PCR quantitative aux plaques de réaction optique rapide à 96 puits. Ajoutez ensuite deux microlitres d’échantillons dilués dans les puits. Après avoir scellé la plaque avec un film adhésif, centrifugez brièvement l’échantillon à 500 G pendant 15 secondes.

Démarrez ensuite le programme Thermocycleur en temps réel. Utilisez la version 2.4 d’un logiciel SDS qui fonctionne avec le thermocycleur en temps réel correspondant pour calculer le nombre de copies brutes de chaque échantillon. Calculez ensuite le nombre absolu de copies à partir du nombre de copies brutes à l’aide du logiciel Excel.

L’efficacité d’amplification de miR-122, miR-192 et miR-133a a été analysée en traçant des courbes standard, ce qui explique la relation entre la concentration logarithmique et le cycle de quantification pour les échantillons non préamplifiés. Les courbes standard pour miR-122, miR-192 et miR-133a montrent une relation linéaire entre les cycles de quantification et la concentration logarithmique des échantillons. Ensuite, l’efficacité d’amplification de miR-1, miR-499a et miR-206 a été analysée en traçant des courbes standard pour des échantillons préamplifiés.

Pour analyser l’efficacité de l’amplification, la pente a été calculée à l’aide d’une régression linéaire. La pente de la courbe standard A montre l’absence d’amplicons spécifiques à une concentration de 1 000 copies par microlitre pour miR-499a et miR-206. Cependant, les amplicons non spécifiques ont été obtenus à 1 000 exemplaires par microlitre pour miR-1.

Ici, des échantillons miR-206 non préamplifiés et préamplifiés ont été utilisés en double pour dériver les tracés d’amplification. Les valeurs du cycle de quantification pour miR-206 non préamplifié et préamplifié ont été estimées à 39,9, plus ou moins un virgule neuf et 27,0, plus ou moins deux virgule deux, respectivement, représentant des valeurs presque similaires entre les doublons, comme le montrent les graphiques. Ensuite, des microARN plasmatiques obtenus sur des singes Cynomolgus ont été soumis à un profilage pour calculer leurs valeurs absolues.

Les diagrammes à points, obtenus à partir du profilage des microARN représentant leurs niveaux d’expression, montrent que miR-122, miR-133a et miR-192 sont détectables sans préamplification. En revanche, miR-1, miR-206 et miR-499a nécessiteront une préamplification en raison de faibles niveaux d’expression. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les niveaux absolus de microARN plasmatiques, à l’aide de la RT-qPCR.

Et la pré-amplification ; il est utile d’améliorer la détection avec de petites quantités de microARN.