Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

L’objectif principal de ce protocole de transfert Western est d’effectuer des transferts Western sur un petit nombre de cellules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches hématopoïétiques, telles que la présence ou l’abondance de protéines spécifiques ou l’activation des voies de signalisation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nécessite moins de 20 000 cellules, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour analyser des populations rares de cellules primaires.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous essayions de trouver des moyens de réduire le nombre de souris que nous devions utiliser pour les analyses de cellules souches hématopoïétiques. La démonstration de la procédure sera faite par Xiongwei Cai, un post-doctorant de mon laboratoire. À l’aide d’un rotor à godets oscillants, centrifuger des tubes de 1,5 millilitre contenant des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices triées à 500 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Une fois la centrifugation terminée, jetez tout sauf 100 microlitres de surnageant, sans déranger la pastille cellulaire. S’il y a moins de 5 000 cellules et que le volume de l’échantillon trié est inférieur à 0,2 millilitre, transférez d’abord les cellules dans des tubes PCR de 0,2 millilitre à faible liaison avant la centrifugation. Cependant, s’il y a moins de 5 000 cellules, mais que le volume de l’échantillon trié est supérieur à 0,2 millilitre, centrifugez les cellules à 500 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, jeter tous les microlitres de surnageant sauf 200. Ensuite, mettez en suspension le granulé et les 200 microlitres restants de surnageant. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans des tubes PCR de 0,2 millilitre et à nouveau, centrifugez.

Ensuite, mettez le granulé en suspension dans 20 à 30 microlitres de surnageant et jetez le reste. Si nécessaire, ajouter une solution saline tamponnée au phosphate dans 2 % de sérum de veau fœtal ou 2 % d’albumine sérique bovine dans les cellules en suspension. Ensuite, utilisez un compteur de cellules automatisé pour déterminer la concentration cellulaire à l’aide de deux à cinq microlitres de cellules en suspension.

Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 20 ou 100 microlitres pour transférer un volume de 500, 1 000 et 2 000 cellules souches et progénitrices hématopoïétiques dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. À l’aide d’un rotor à godets oscillants, centrifuger les cellules à quatre degrés Celsius à 500 fois la gravité pendant cinq minutes. Suivez ensuite les instructions du fabricant pour dissoudre la phosphatase et l’inhibiteur de protéasome et le DMSO pour préparer une solution mère 100 fois.

Ensuite, diluez le tampon d’échantillon Laemmli à quatre plis avec des volumes équivalents d’eau distillée pour obtenir un tampon d’échantillon Laemmli à deux plis. Ajoutez ensuite des quantités appropriées de la solution mère 100 fois plus efficace de phosphatase et d’inhibiteur de protéasome pour ajuster la concentration finale à deux inhibiteurs et à deux tampons d’échantillon Laemmli. Ajustez le volume de surnageant résiduel dans le tube de sorte que l’ajout de volumes égaux de deux tampons Laemmli avec la phosphatase et l’inhibiteur de protéasome permettra d’obtenir une concentration finale de 500 cellules par microlitre et un tampon Laemmli plié.

Et puis resuspendre pour former le lysat. Avant de charger le gel, chauffez les lysats de l’échantillon à 95 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant cinq minutes. À l’aide de protocoles standard, l’électrophorèse d’un à 40 microlitres de lysat équivaut à 500 à 20 000 cellules à travers une page SDS à 100 volts.

Après avoir traité la membrane de polyvinylidène avec du méthanol, lavez brièvement la membrane avec de l’eau distillée. Transférez ensuite la protéine du gel à la membrane selon les instructions fournies par le fabricant de l’appareil de transfert. Après le transfert, bloquez la membrane avec deux millilitres d’albumine sérique bovine à 2 % et une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1 % d’entrejambe pendant la nuit à quatre degrés Celsius selon les protocoles standard.

Après avoir bloqué la membrane, incubez-la avec des anticorps dilués pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez la membrane trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1 % de Tween 20 pendant cinq minutes chacune à température ambiante. Ensuite, incubez la membrane avec deux millilitres de tampon de chimiluminescence amélioré pendant une minute à température ambiante.

Détectez les signaux à l’aide d’un système d’imagerie. Pour comparer les signaux de la bêta-actine, des lysats ont été préparés à partir de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices de l’urine et soumis à une analyse en parcelle de Western. Il est clair à partir de l’amino blot qu’il y a une diminution du signal d’actine bêta des lysats préparés à partir de 2 000 à 500 cellules progénitrices hématopoïétiques et souches chargées dans des puits de 1,5 millimètre sur un gel de page SDS à 12 %.

De plus, pour comparer les signaux d’actine bêta obtenus à partir de différentes tailles de puits coulés sur le gel. Les lysats ont été chargés dans des puits de 1,5 et trois millimètres sur le gel, puis soumis à une analyse par transfert Western. Le transfert montre que le signal de bêta-actine obtenu à partir du lysat préparé à partir de 500 progéniteurs hématopoïétiques chargés dans un puits de 1,5 millimètre est beaucoup plus fort que lorsqu’il est chargé dans un puits de trois millimètres.

Ensuite, pour comparer les signaux du facteur d’initiation eucaryote 4G, de l’actine et de la phosphorylation de la protéine ribosomique S6 en réponse à la stimulation du facteur de cellules souches cytokiniques, les lysats obtenus ont été analysés par amino blot. Le transfert montre la présence d’intensités de signal plus fortes pour les trois protéines dans les régéniteurs hématopoïétiques avec stimulation du facteur de cellules souches de cytokines. Par rapport au contrôle in vitro, il est également clair qu’il existe une intensité de signal croissante pour les trois protéines à partir de différents volumes de cellules souches hématopoïétiques.

Une fois maîtrisé, cela peut techniquement être fait en 48 heures. S’il est abordé correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de compter avec précision les cellules et de diriger les cellules de lysat avec un tampon de charge.

Après ce développement, il est techniquement mis à la disposition des chercheurs dans le domaine de la recherche sur les cellules souches pour explorer les voies de signalisation dans un petit nombre de cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire du traçage occidental avec un petit nombre de pièces d’adresse. Faites attention aux régions que vous utilisez pour la page SDS.

Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans vos expériences.