Name: Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Apprenez un protocole de Western blotting optimisé pour analyser seulement 500 cellules souches hématopoïétiques. Cette méthode permet la détection fiable de protéines spécifiques tout en réduisant l'utilisation animale.

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National Institutes of Health accorder R01 CA149976 (Nada) prise en charge de ce travail.

Toutes les opérations doivent être exécutées conformément aux directives de soins et de l’utilisation institutionnelle des animaux. La procédure a été développée pour l’analyse de des cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (CSH et HPs), mais peut être adaptée pour l’analyse des autres populations de cellules.
1. écoulement Cytometry isolement d’autorenouveler murin et HPs
<ol><li>Récolter les murins de la moelle osseuse des cellules comme décrit dans la littérature6. Remarque : Dans les données présentées au tableau 1 et Figure 2, la moelle osseuse a été récoltée de souris C57BL/6J.</li>
	<li>Effectuer l’appauvrissement de la lignée de cellules de moelle osseuse à l’aide d’un kit souris de lignée épuisement, suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Incuber les cellules avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface de cellules d’intérêt comme décrit7. Dans les expériences illustrés à la Figure 1 et Figure 2, anticorps anti-Sca-1, Kit, Flt3 et marqueurs de la lignée (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 et Ter119 est utilisées.</li>
	<li>Trier 2 000-20 000 Sca1 de Lin– +Kit+ Flt3 cellules– (CSH) ou Lin–Sca1–cellules Kit+ (HPs) dans des tubes Eppendorf 1,5 mL contenant 0,1 mL de phosphate buffered saline (PBS) avec 2 % fœtale bovine sérum (FBS). Remarque : Pour les données indiquées dans la Figure 1 et Figure 2, cellules étaient triés à l’aide d’un cytomètre de flux avec un gicleur de 70 µM. Le volume de la collection maximale est de 1,4 mL.</li>
</ol>2. préparation de l’échantillon
Remarque : Cette étape est critique. Traiter l’échantillon très soigneusement. Lorsque vous retirez le surnageant, faites très attention à ne pas déranger le culot cellulaire.
<ol><li>Centrifuger le 1.5 mL tubes contenant des cellules triées dans un rotor oscillant de seau à 4 ° C, 500 g, pendant 5 min. retirer tout sauf environ 100 µL de surnageant de la cellule a granulé très délicatement à l’aide d’une pipette et une pointe de pipette 20 µL. Ne pas déranger le culot.<ol>
<li>Si l’échantillon contient moins de 5 000 cellules, et le volume total de l’échantillon trié est inférieur à 0,2 mL, transférer les cellules tout d’abord à tubes PCR de 0,2 mL de liaison faible avant la centrifugation.</li>
		<li>Si l’échantillon contient moins de 5 000 cellules et le volume est de plus de 0,2 mL, tourner les cellules vers le bas avec une centrifugeuse à 4 ° C, 500 x g, pendant 5 min et supprimer tout sauf 200 µL du liquide surnageant. Remettre en suspension les cellules granulés dans le restant de 200 µL de surnageant, puis transférer les cellules dans les tubes PCR de 0,2 mL et tourner de nouveau vers le bas. Retirer la pastille, mais tous les 20-30 µL après le deuxième tour et remettre en suspension les cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans la gauche surnageante dans le tube. Si nécessaire, ajouter PBS supplémentaires chez 2 % FBS/PBS (vous pouvez également utiliser 2 % d’albumine sérique bovine (BSA) / PBS, ou PBS seul) pour obtenir une concentration de 5 x104 à 5 x 105 cellules/mL. NOTE : Utiliser la numération des lymphocytes collectés par cytométrie de flux pour estimer le volume utilisé pour suspendre des cellules.</li>
	<li>2 à 5 µL de cellules remises en suspension permet de déterminer une concentration de cellules précises à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (suivant les instructions du fabricant) ou un hémocytomètre9.</li>
	<li>Transférer un volume de cellules remises en suspension contenant le nombre de cellules dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Pour l’expérience à la Figure 1, 500, 1 000 ou 2 000 csh ou HPs ont été transférés. Le nombre de cellules dépend de la puissance du signal obtenu par Western blot et est déterminé empiriquement. Effectuer le transfert à l’aide d’un 20 µL ou pointe de pipette 100 µL Eppendorf.</li>
	<li>Centrifuger les cellules dans un rotor oscillant de seau à 4 ° C, 500 x g, pendant 5 min.</li>
	<li>Pour générer 100 x solutions courantes, dissoudre les inhibiteurs du protéasome et phosphatase dans le DMSO selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Préparer 2 x Laemmli solution tampon en diluant la 4 x Laemmli solution tampon fourni par le fabricant avec une quantité équivalente d’eau distillée. Ajouter une quantité appropriée de l’encours de 100 x des inhibiteurs du protéasome et phosphatase pour obtenir une concentration finale de 2 inhibiteurs de x à 2 x Laemmli solution tampon. Remarque : La x Laemmli solution tampon 2 peut être faite à l’avance, mais les inhibiteurs du protéasome et phosphatase devraient être ajoutés immédiatement avant d’ajouter le 2 x Laemmli solution tampon (plus inhibiteurs) pour le culot cellulaire pour lyser les cellules, comme décrit dans l’étape suivante.</li>
	<li>Soigneusement, enlever une partie du liquide surnageant du culot cellulaire et le surnageant restant dans le tube avec le culot cellulaire, ajouter un volume égal de 2 x Laemmli solution tampon plus inhibiteurs du protéasome et phosphatase pour obtenir une concentration finale de 500 cellules/µL dans 1 x Laemmli solution tampon. NOTE : par exemple, si vous passez 2 000 cellules dans un volume total de 20 µL à un tube en étape 2.5, après centrifugation des cellules (étape 2.6), vous devez supprimer 18 µL de surnageant de la pastille et à la 2 µL de liquide surnageant qui est restant ajouter un volume égal (2 µL) de 2 x Laemmli solution tampon pour obtenir une concentration finale de 500 cellules/µL dans 1 x Laemmli solution tampon.</li>
	<li>Resuspendre le culot pour générer le lysat dès que possible. À ce stade, les échantillons peuvent être immédiatement PST1 par des gels SDS-PAGE, ou peut être snap figé dans le liquide N2 et stockée à-80 ° C pour une utilisation future.</li>
</ol>3. électrophorèse
<ol><li>Faire chauffer les lysats dans un bloc chauffant à 95 ° C ou dans l’eau bouillante pendant 5 min.</li>
	<li>ELECTROPHORESE 1-40 µL des lysats (contenant de 500 jusqu'à 20 000 équivalents de cellule) par des gels SDS-PAGE à 100V à l’aide de protocoles standard10. Remarque : Le volume du lysat chargé dans le gel est déterminé par le nombre de cellules nécessaires pour générer le signal souhaitable et dépendra de l’abondance de la protéine d’intérêt et la qualité de l’anticorps. Les données à la Figure 1 ont été obtenues avec 500 équivalents de cellule de lysat, 1 000 et 2 000. La largeur du puits sont de l’ordre de 3 mm à 1,5 mm. 1,5 mm dents peuvent être coupée dans un peigne disponible dans le commerce avec des dents plus larges à l’aide de ciseaux.</li>
</ol>4. transfert et bloquer
Remarque : Effectuez une suite de protocoles standard11la tache occidentale. Les étapes sont brièvement décrites ici :
<ol><li>Pré-traiter une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane avec du méthanol pendant 10 s, puis laver la membrane brièvement avec d’eau distillée.</li>
	<li>La protéine de transfert du gel SDS-PAGE à la membrane en suivant les instructions dans le manuel fourni par le fabricant de l’appareil de transfert.</li>
	<li>Après transfert, bloquer la membrane avec 2 mL de 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBST (PBS avec 0,1 % Tween) durant la nuit à 4 ° C à la suite de protocoles standard11.</li>
</ol>5. anticorps étiquetage
<ol><li>Incuber la membrane avec des anticorps sur un agitateur pendant une nuit à 4 ° C, en utilisant des dilutions d’anticorps recommandées par le vendeur. NOTE : Dans la Table des matières, des anticorps, qui nous avons validé pour CSH et HPs et les dilutions d’anticorps correspondants, sont montrées. Effectuer l’étiquetage d’anticorps à l’aide de procédures standard8.</li>
</ol>6. détection
<ol><li>Laver la membrane 3 fois, 5 min pour chaque lavage dans le PBST à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la membrane avec 2 mL de tampon de chimiluminescence améliorée pendant 1 min à température ambiante. Détecter les signaux à l’aide d’un système d’imagerie, les instructions, ou film d’autoradiographie et processeur de film du fabricant.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Western Blot est une technique courante pour détecter les protéines spécifiques et l’activation des voies de signalisation dans les tissus ou cellules. Par l’introduction de petits ajustements à une procédure couramment utilisée, nous avons pu détecter systématiquement 15 différentes protéines (Table des matières) dans 15 000 GPX et dans certains cas en aussi peu que 500 CSH. The Most des étapes cruciales dans le présent protocole sont : 1) exactement compter les cellules 2) minimiser le nombre de transf...

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont autorenouvellement des cellules qui peuvent donner lieu à toutes les lignées de sang. Ils sont relativement rares cellules dans la moelle osseuse, analyses biochimiques de rendu difficile. Approprié pour l’analyse des cellules rares, comme la cytométrie en flux, des approches ont été très utiles pour quantifier les quantités relatives des marqueurs de surface de cellules et de protéines intracellulaires. Cependant, l’analyse des protéines intracellulaires nécessite l’utilisation de procédures de perméabilisation de cellules pour permettre l’accès d’anticorps, et pas tous les épitopes de surface survivent ces procédures1,2. En outre, les anticorps qui établissent une discrimination entre les produits de différentes protéines isoformes ou de clivage ne sont pas souvent disponibles pour cytométrie en flux, et donc enquêteurs comptent encore sur les transferts Western pour certains types d’analyses.
Analyse par Western blot des lysats cellulaires est une procédure de routine dans la plupart des laboratoires. Cellules peuvent être épurées dans des conditions natives qui préservent les épitopes de molécules de surface de cellules, et par la suite, lysats cellulaires peuvent être préparés et analysés. Cependant, l’analyse des protéines dans des cellules primaires rares populations par Western blot peut exiger euthanasier un grand nombre d’animaux pour obtenir suffisamment de cellules. En faisant de petits ajustements à plusieurs étapes, un protocole épongeant occidental conventionnel a été en mesure de détecter les protéines dans un relativement petit nombre de CSH (500-15 000, selon la protéine d’intérêt). Les réglages comprennent exactement compter les cellules, manipuler avec précaution le culot cellulaire, réduisant les transferts de cellules entre tubes pour minimiser la perte de cellules, et lyse un nombre défini de cellules avec une charge concentrée de la mémoire tampon contenant du protéasome et inhibiteurs de la phosphatase. Plusieurs rapports publiés incluent des Western blots obtenus avec 20 000 ou plusieurs CSS3,4,5,6,7; Cette procédure très simple permettra de réduire le nombre de cellules et les animaux de laboratoire nécessaires pour produire les données équivalentes d’entre 4 et 40 fois. Le protocole vise à normaliser les résultats sur une base par cellule, plutôt qu’à un contrôle interne. Cela permet de détecter une réduction globale des taux de protéines qui peut être négligée si les données sont normalisées à un contrôle interne. L’importance de la normalisation sur une base par cellule a été décrit pour l’analyse du gène expression données8, et le même principe s’applique à la quantification des protéines par Western blot. Ce protocole optimisé devrait être utile pour tous ceux qui ont besoin d’analyser un petit nombre de cellules.

<table><tbody><tr><td>dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30 % Acrylamidel Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>mini-protéiforme 3 peigne</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Système de transfert</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>transfert</td></tr><tr><td>PowerPac HC Alimentation</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>électrophorèse</td></tr><tr><td>Système d’imagerie</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>détection de signal</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU préparation d’échantillons</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Tampon d’électrophorèse</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>Electrophorèse</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU Préparation d’échantillons</td><td></td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF Transfer Kit, pour 40 blots</td><td>Bio-Rad</td><td>1704272</td><td>transfert</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>préparation d’échantillon</td></tr><tr><td>Inhibiteur de phosphatase Cocktailrs</td><td>Gold Biotechnology</td><td>GB-450-1</td><td>Préparation</td></tr><tr><td>d’échantillon</td><td>EIF4G</td> Signalisation cellulaire <td>2469</td><td>Anticorps WB, validé dans 1000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : Fig2</td></tr><tr><td>Signalisation cellulaire</td> <td>p-Rps6</td><td>Anticorps 4858</td><td>WB, validé dans 1000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : Fig2</td></tr><tr><td>actine (HRP conjuguée)</td><td>abcam</td><td>ab49900</td><td>Anticorps WB, validé dans 500 cellules concentration d’anticorps : 1:5000 référence(figure) : Fig1, Fig2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : Référence 1:1000 (figure) : ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>Anticorps TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>Anticorps 4877</td><td>WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>Signalisation cellulaire</td> <td>mTOR</td><td>2983</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>Anticorps WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : Référence 1:1000 (figure) : ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-WB p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td>, <td>validé dans 15000 cellules Concentration d’anticorps : 1:1000 référence(figure) : ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>anticorps anti-actine</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB, validé dans 15000 cellules concentration d’anticorps : 1:3000 référence(figure) : ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>Kit de déplétion de lignée (souris)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>purification de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques</td></tr><tr><td>Colonnes LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>purification de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>stimulation par phosphorylation</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit anticorps</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>tri cellulaire</td></tr><tr><td>anti-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>tri</td></tr> cellulaire <tr><td>anti-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>tri cellulaire</td></tr><tr><td>anti-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>tri cellulaire</td></tr><tr><td>anti-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>tri cellulaire</td></tr><tr><td>anti-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td></td></tr> tri cellulaire <tr><td>Plaques d’espacement avec 1,0 mm intégré Espaceurs</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International</td><td>A30075</td> sérum <td>bloquant la membrane</td></tr><tr><td></td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>moyen supplément compteur</td></tr> de <tr><td>cellules</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>hémocytomètre de comptage de cellules</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp ; S17040</td><td>comptage de cellules</td></tr><tr><td>flim</td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td>détection de</td></tr><tr><td>signal processeur de film médical</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>détection de signal</td></tr><tr><td>Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrat</td><td>Therom Scientific</td><td>34096</td><td>détection de signal</td></tr><tr><td>Allegra X-15R Centrifugeuse (Rotor SX4750A)</td><td>Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td>échantillon préparation</td></tr><tr><td>BLUEstain échelle protéique</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P007-500</td><td>trieur de cellules d’électrophorèse</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>électrophorèse</td></tr></tbody></table>

un western blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules rares, avec la moelle osseuse de souris contenant seulement ~ 25 000 phénotypique long terme autorenouveler repopulation. Un protocole Western Blot a été optimisé et adapté à l’analyse d’un petit nombre de CSH (500-15 000 cellules). Autorenouveler phénotypiques ont été purifiés, compté avec précision et lysées directement dans la mémoire tampon de Laemmli témoin. Lysats contenant un nombre égal de cellules ont été analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE), et la tache a été préparée et traitées suite à la série Western blotting protocoles. Utilisant ce protocole, 2 000-5 000 CSH peut être systématiquement analysée, et dans certains cas peuvent être tirées d’aussi peu que 500 cellules, par rapport à des cellules de 20 000 à 40 000 rapportés dans la plupart des publications. Ce protocole devrait être généralement applicable à d’autres cellules hématopoïétiques et permet l’analyse de routine d’un petit nombre de cellules à l’aide de procédures standard de laboratoire.

Des résultats représentatifs de 500-2 000 purifiée autorenouveler et HPs sont indiquées dans la Figure 1 et Figure 2. Le signal de β-actine dans la Figure 1 peut être détecté aussi peu que 500 autorenouveler et HPs purifiée à partir de la moelle osseuse de souris. Notez que les lysats de chargement dans les puits de 1,5 mm produit un signal beaucoup plus fort de 500 HPs chargement dans les puits de 3...

Un standard Western blotting protocole a été optimisé pour analyser aussi peu que 500 souches hématopoïétiques ou de cellules progénitrices. Optimisation implique attention manipulation de l’échantillon cellulaire, limiter les transferts entre les tubes et lyse directement les cellules de la mémoire tampon de Laemmli témoin.

Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

L’objectif principal de ce protocole de transfert Western est d’effectuer des transferts Western sur un petit nombre de cellules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches hématopoïétiques, telles que la présence ou l’abondance de protéines spécifiques ou l’activation des voies de signalisation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nécessite moins de 20 000 cellules, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour analyser des populations rares de cellules primaires.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous essayions de trouver des moyens de réduire le nombre de souris que nous devions utiliser pour les analyses de cellules souches hématopoïétiques. La démonstration de la procédure sera faite par Xiongwei Cai, un post-doctorant de mon laboratoire. À l’aide d’un rotor à godets oscillants, centrifuger des tubes de 1,5 millilitre contenant des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices triées à 500 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Une fois la centrifugation terminée, jetez tout sauf 100 microlitres de surnageant, sans déranger la pastille cellulaire

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Cette vidéo présente une technique de génération de souris du système immunitaire humain (HIS). Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+ sont isolées à partir de cellules leucocytaires du sang de cordon ombilical humain à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’anticorps. Les CSH CD34+ sont développées dans un milieu de croissance enrichi en cytokines et cryoconservées. Enfin, les CSH décongelées sont injectées dans un chiot de souris immunodéficient pour établir le modèle de souris...

Isolement de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon ombilical pour générer des souris du système immunitaire humain

Ici, nous présentons un protocole pour préparer des échantillons avec un faible nombre de cellules pour l’analyse en microscopie électronique à transmission (MET).

Une approche alternative pour la préparation de l&#39;échantillon avec une faible Nombre de cellules d&#39;analyse TEM

Les cellules progénitrices de tige hématopoïétiques (HSPc) transition d'un état quiescent à un état de différenciation dû à leur plasticité métabolique pendant la formation de sang. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la respiration mitochondriale et la glycolyse des HSPC.

Analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices

Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

Ce protocole permet le maintien des cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes in vitro en imitant le microenvironnement de moelle en utilisant des acides gras abondants, le cholestérol, des concentrations plus faibles de cytokines, et l’hypoxie.

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.

Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC) et des CSH à court terme (ST-HSC) à l’aide du système rapporteur Hoxb5.

PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME

Présenté ici est une technique basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer simultanément le nombre de divisions cellulaires, le phénotype des cellules de surface et la parenté cellulaire. Ces propriétés peuvent être testées statistiquement à l’aide d’un framework basé sur la permutation.

Évaluation simultanée de la parenté, du numéro de division et du phénotype par cytométrie en flux pour les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices

Ici, nous avons établi in vivo des ostéo-organoïdes déclenchés par des échafaudages de gélatine chargés de protéine 2 morphogénétique osseuse pour récolter des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques pour la reconstruction d’un système hématopoïétique et immunitaire endommagé. Dans l’ensemble, cette approche peut fournir une source cellulaire prometteuse pour les thérapies cellulaires.

Approche ostéo-organoïde in vivo pour la récolte de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques

Apprenez un protocole de Western blotting optimisé pour analyser seulement 500 cellules souches hématopoïétiques. Cette méthode permet la détection fiable de protéines spécifiques tout en réduisant l'utilisation animale.

Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

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