Name: Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez l'enzyme CiDER pour l'hydroxyméthylation de l'ADN induite chimiquement et le remodelage épigénétique dans les cellules mammifères. Cette méthode offre un contrôle temporel précis des modifications épigénétiques.

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Nous remercions le financier prend en charge de la National Institutes of Health accorde (R01GM112003 à YZ), la Fondation Welch (BE-1913 à YZ), l’American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE à YZ), la prévention du Cancer et Research Institute of Texas (RR140053 à YH, RP170660 à YZ), l’American Heart Association (16IRG27250155 à YH) et le programme de prix de recherche en collaboration de fondation de John S. Dunn.

1. Culture, Transfection de plasmide et Induction chimique des cellules
<ol>
	<li>Culture d’une lignée de cellules adhérentes (p. ex., l’embryonnaire rein humain cellules HEK293T) au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), additionnée de 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Transfecter les cellules avec le plasmide de cidre.
	<ol>
		<li>Au moins 18 heures avant la transfection, semences 0,3 x 106 cellules à 2,5 mL de DMEM approprié par bien dans une plaque 6 puits et incuber à 37 ° C pendant la nuit pour atteindre 60 à 80 % confluence des cellules.</li>
		<li>Réchauffez le réactif de transfection à température ambiante avant utilisation.</li>
		<li>Place 250 µL de milieu sans sérum dans un tube stérile. Remarque : Ce montant est adapté pour une plaque 6 puits avec confluence de 80 %. Le cas échéant, proportionnellement ajuster les quantités moyennes selon les tailles de plaques ou le nombre de cellules.</li>
		<li>Ajouter 2,5 µg du plasmide codant cidre18 ou le domaine catalytique de TET2 (TET2CD comme témoin positif)12,13 dans le milieu sans sérum et doucement de la composition de pipetage.</li>
		<li>Ajouter 7,5 µL de réactif de transfection pour le mélange de l’ADN dilué et mélanger doucement en pipettant également.</li>
		<li>Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 à 30 min.</li>
		<li>Changer les médias préchauffé et ajouter le mélange de goutte-à-goutte dans les puits et secouez légèrement la plaque de culture cellulaire pour répartir uniformément le mélange de l’ADN et de réactif de transfection de.</li>
		<li>Incuber les cellules et le mélange jusqu’au lendemain et puis remplacez le réactif de transfection contenant des médias avec 2ml de frais DMEM complet.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Induction chimique
	<ol>
		<li>Diluée à 2 mM du stock de la rapamycine (dissoute dans le DMSO) à une concentration de 20 µM en milieu complet approprié.</li>
		<li>Ajouter 20 µL de la rapamycine diluée aux cellules transfectées maintenues dans un milieu de 2 mL pour atteindre une concentration finale de 200 nM. NOTE : Après incubation pendant 48 h, les cellules sont prêtes pour la quantification de la génération de 5hmC ou d’autres applications en aval. Si nécessaire, l’efficacité de l’induction peut être surveillée en ôtant les cellules toutes les 3 h pour plus 5hmC quantification tel que décrit ci-dessous et illustrée à la Figure 1.</li>
		<li>Pour une meilleure quantification de l’efficacité de l’induction 5hmC, semences différents puits pour surveiller des cellules toutes les 3 heures.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. quantification de la Production induite par la rapamycine 5hmC par immunomarquage
<ol>
	<li>5hmC immunofluorescence souillant NOTE : Ajouter une quantité suffisante de la solution de fixation, composé de paraformaldéhyde à 4 %, 0,2 % agent tensio-actif (par exemple X-100 Triton) dans du PBS avec 3 N HCl, pour couvrir toutes les cellules de la plaque. Par exemple, 500 µL de solution serait suffisant pour un puits dans une plaque 6 puits. Effectuez toutes les opérations à température ambiante.<ol>
		<li>Pour corriger les cellules, ajoutez paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS à cellules traitées à la rapamycine pendant 15 min à température ambiante. Pour le groupe témoin, utiliser les cellules exprimant mCherry-cidre sans traitement de la rapamycine. Ne pas agiter. ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique. Porter une protection appropriée.</li>
		<li>Jeter la solution fixateur. Incuber les cellules fixes avec 0,2 % tensioactif dans du PBS pendant 30 min pour permeabilize la membrane cellulaire.</li>
		<li>Jeter la solution perméabilisation. Ajouter 3 N HCl dans les cellules perméabilisées et incuber pendant 15 min dénaturer l’ADN.</li>
		<li>Jetez HCl. Ajouter un tampon Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) aux cellules pendant 10 min pour la neutralisation du pH.</li>
		<li>Jeter toute la solution. Laver les cellules soigneusement avec du PBS pour 3 - 5 fois. Enlevez complètement les PBS. NOTE : Ajouter des quantités suffisantes de PBS pour chaque étape de lavage. Par exemple, 1 mL de PBS est suffisant pour une plaque 6 puits.</li>
		<li>Bloquer des cellules en ajoutant le tampon de blocage comprenant BSA 1 % et 0,05 % d’agent tensio-actif (par exemple de Tween 20) dans du PBS pendant 1 h avec agitant doucement.</li>
		<li>Jeter la solution de blocage. Ajouter l’anticorps 5hmC dilué (1 : 200) aux cellules et incuber pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Laver les cellules avec du PBS trois fois pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter un fluorophore dilué (FITC)-conjugués anticorps secondaire (1 : 200) aux cellules et incuber pendant 1 heure.</li>
		<li>Laver les cellules avec du PBS trois fois abondamment pour éliminer les anticorps résiduels.</li>
		<li>Ajouter 250 ng/mL de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour colorer le noyau pendant 5 min. Retirer la solution colorante.</li>
		<li>Monter la boîte de Petri de diapositive ou de fond en verre avec immunomarquage des cellules pour l’imagerie confocale. Un résultat représentatif a été montré dans la Figure 1 b.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytométrie en flux Remarque : Utilisez une plaque de 96 puits rond fond pour la procédure de marquage suivante. Normalement, 150 µL de réactifs est suffisant pour chaque puits.<ol>
		<li>Remettre en suspension les cellules transfectées et induite par la rapamycine dans le tampon de FACS (PBS avec 1 % de BSA, 2 mM EDTA). Pour le groupe témoin, utiliser des cellules exprimant le cidre sans traitement de la rapamycine.</li>
		<li>Difficulté et permeabilize des cellules, comme décrit au point 2.1.</li>
		<li>Ajouter 2 N HCl aux cellules pour dénaturer l’ADN pendant 10 min.</li>
		<li>Jetez HCl. neutraliser et bloquer les cellules comme décrit au point 2.1.</li>
		<li>Ajouter un anticorps anti-5hmC dilué (1 : 200) aux cellules et incuber pendant 1 heure à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Laver les cellules avec du tampon de FACS trois fois. Enlevez complètement le tampon de FACS.</li>
		<li>Ajouter un fluorophore dilué (FITC)-conjugués anticorps secondaire (1 : 400) pour la cellule activée par fluorescence tri analyse (FACS) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
		<li>Laver les cellules avec du tampon de FACS trois fois.</li>
		<li>Les échantillons sont prêts pour l’analyse des FACS. Un résultat représentatif a été montré dans la Figure 1-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. dot-blot Assay pour quantifier la 5hmC et la 5-méthylcytosine (5mC) s’élève
<ol>
	<li>Isoler l’ADN génomique des cellules transfectées et induite par la rapamycine en utilisant un kit commercial d’extraction d’ADN. Pour le groupe témoin, utiliser les cellules transfectées cidre sans traitement de la rapamycine.</li>
	<li>Chauffer le four sous vide à 80 ° C et trempage une membrane de nitrocellulose en bidistillée H2O et puis 6 x tampon citrate de solution saline-sodium (SSC) pendant 10 min.</li>
	<li>Charger 60 µL de quantités égales de l’ADN (total 2 µg dans un tampon TE) sur une plaque PCR 96 puits. Ajouter 30 µL de tampon TE (EDTA 1 mM, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) dans les puits de repos.</li>
	<li>Faire des dilutions successives double verticalement sur la plaque à 96 puits en transférant 30 µL de solution de 1er rang à la même position de la colonne sur la ligne 2. Mélangez à nouveau et 30 µL de solution de transfert aux puits de la nouvelle ligne jusqu'à atteindre la limite.</li></ol>Supprimer la dernière 30 µL.
	<li>Ajouter 20 µL de NaOH et 10 mM EDTA de 1 M dans chaque puits, sceller la plaque et chauffer le mélange pendant 10 min à 95 ° C pour dénaturer complètement le duplex d’ADN.</li>
	<li>Immédiatement, refroidir les échantillons sur la glace et ajouter 50 µL de glacé d’acétate d’ammonium 2 M (pH 7,0) et incuber sur glace pendant 10 min. NOTE : Étapes 3,7-3.10 implique l’utilisation du vide.</li>
	<li>Assembler l’appareil point de tache avec membrane préalablement trempé et enlever tampon résiduel en utilisant le vide total.</li>
	<li>Laver la membrane en ajoutant 200 µL de tampon TE à chaque puits de l’appareil de dot blot. Allumez le vide pour éliminer le tampon TE.</li>
	<li>Charger l’ADN dénaturé (préparé dans les étapes précédentes 3,1 à 3,6) dans chaque puits de l’appareil de dot blot. Allumez le vide pour éliminer la solution.</li>
	<li>Laver la membrane en ajoutant 200 µL de 2 x solutions résiduaires SSC et supprimer complètement utilisant le vide.</li>
	<li>Démonter l’appareil de dot blot, retirer la membrane et rincez l’ensemble membrane avec 20 mL de 2 x SSC.</li>
	<li>Sécher la membrane pendant 20 min.</li>
	<li>Cuire au four de la membrane à 80 ° C sous vide pendant 2 h.</li>
	<li>Ajoutez la solution de blocage (5 % du lait écrémé dans un mélange TBST) à la membrane et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Jeter la solution de blocage. Ajouter un 5hmC dilué (1:5 000) ou 5mC (1:1, 000) anticorps dirigés contre la membrane et incuber une nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Nettoyer la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 10 min pour éliminer les anticorps résiduels. Enlevez un mélange TBST complètement.</li>
	<li>Ajouter un anticorps secondaire conjugué HRP (01:10, 000 de anti-lapin HRP(5hmC) ou 1:3,000 de anti-souris HRP(5mC)) à la membrane et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Nettoyer la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter ECL western blotting substrat à la membrane pour la visualisation des signaux de 5hmC à l’aide d’un détecteur à chimiluminescence. Un résultat représentatif a été montré dans la Figure 1E.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Ici, nous avons illustré l’utilisation d’une enzyme machiné split-TET2 pour obtenir un contrôle temporel des hydroxymethylation de l’ADN. Après la découverte de la famille TET de 5-methycytosine dioxygénase, de nombreuses études ont été réalisées à déchiffrer la fonction biologique des protéines TET et leur principal produit catalytique 5hmC1,2,3, 4,5,</...

Méthylation de l’ADN, pour la plupart fait référence à l’ajout d’un groupe de méthyle à la position du carbone 5 de cytosine pour former 5-méthylcytosine (5mC), est catalysée par l’ADN méthyl-transférase (DNMTs). 5MC agit comme une marque épigénétique majeure dans le génome de mammifères qui signale souvent pour répression transcriptionnelle, inactivation du chromosome x et transposon silencieux1. Le renversement de la méthylation de l’ADN est médié par la famille de protéine de translocation (TET) dix-elven. Enzymes de TET appartiennent au fer (II) et 2-oxoglutarate dioxygénases dépendants qui catalysent l’oxydation successifs de 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxycytosine (5caC). TET-mediated 5mC oxydation impose une couche supplémentaire de contrôle épigénétique sur le génome des mammifères. La découverte de TET a suscité l’intérêt intense dans le domaine épigénétique pour dévoiler les fonctions biologiques des protéines TET et leur principal produit catalytique 5hmC. 5hmC n’est pas seulement un intermédiaire durant la médiation TET active ADN déméthylation2,3,4, mais aussi agit comme une écurie épigénétique marque5,6,7,8 . ADN hydroxymethylation est fortement corrélé avec l’expression des gènes et aberrante dans ADN hydroxymethylation est associée à certaines maladies humaines9,10,11, les relations de cause à effet entre des modifications épigénétiques sur l’ADN et les phénotypes restent souvent difficiles à établir, qui peut être partiellement attribué à l’absence d’outil fiable pour ajouter ou supprimer des modifications de l’ADN dans le génome à adéquatement défini temporelle et spatiale résolution.
Nous rapportons ici l’utilisation d’un chimique-inducible épigénome remodelage outil (cidre) à surmonter l’obstacle face à des études de relations causales entre hydroxymethylation et gène transcription de l’ADN. La conception est basée sur l’hypothèse que le domaine catalytique de TET2 (TET2CD) peut se scinder en deux fragments inactifs lorsqu’elle est exprimée dans les cellules de mammifères et sa fonction enzymatique peut être reconstituée en adoptant une approche de dimérisation chimiquement inductible ( Figure 1 a). Pour mettre en place un système de split-TET2CD, nous avons sélectionné six sites dans TET2CD, composé d’une région riche en Cys et un pli double brin β-hélice (DSBH), sur la base d’une structure en cristal rapportés du complexe ADN-TET2 qui ne dispose pas d’une région de faible complexité12. Un gène synthétique codant la protéine inductible par la rapamycine dimérisation module FK506 12 (FKBP12) et domaine de liaison de la rapamycine FKBP (FRB) de la cible mammalienne de rapamycine14,15, ainsi que d’un peptide Self clivage T2A polypeptide séquence16,17, a été individuellement insérés dans les sites sélectionnés split dans TET2CD. La sélection de TET2 que notre objectif de génie est basée sur les considérations suivantes. Premières mutations somatiques dans TET2 avec réduction concomitante dans hydroxymethylation de l’ADN sont fréquemment observées dans les maladies humaines, y compris les troubles myéloïdes et cancer10, qui fournit des informations utiles sur les sites sensibles à éviter pour insertion. Deuxièmement, une fraction importante du domaine catalytique TET2, plus particulièrement la région de faible complexité, est indispensable pour la fonction enzymatique12, afin que nous puissions concevoir un split-TET2 réduite pour les modifications épigénétiques inductibles. Après le dépistage des constructions de plus de 15, une construction qui expose plus haute restauration rapamycine inductible de l’activité enzymatique dans le système des mammifères a été choisie et désignée comme cidre18. Nous décrivons ici l’usage du cidre mCherry-tag pour atteindre inductible ADN hydroxymethylation et remodelage épigénétique avec la rapamycine et présenter trois méthodes pour valider la production induite par le cidre 5hmC dans un système cellulaire de modèle HEK293T.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, solution à 16 %</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumine, Bovin</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps 5-Hydroxyméthylcytosine (5-hmC) (pAb)</td><td>Motif actif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phénylindolde (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Four sous vide économique, 0,6 pi³ (17 L)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-5-méthylcytosine (5mC), clone 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr>IgG anti-souris, <td>Technologie de signalisation cellulaire d’anticorps</td><td>liée à HRP</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin, </td><td>Technologie de signalisation cellulaire d’anticorps liée à la</td> HRP <td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

une enzyme machiné split-tet2 pour hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’adn et le remodelage épigénétique

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Méthylation de l’ADN est une modification épigénétique stable et héréditaire dans le génome de mammifères et est impliquée dans la régulation de l’expression des gènes pour contrôler les fonctions cellulaires. Le renversement de la méthylation de l’ADN, ou la déméthylation de l’ADN, est véhiculé par la famille de protéine de translocation (TET) de dix-onze de dioxygénases. Bien qu’il a été largement rapporté qu’aberrante de méthylation de l’ADN et de déméthylation sont associés à des anomalies du développement et cancer, comment ces changements épigénétiques contribuent directement à l’altération ultérieure dans la progression expression ou d’une maladie génétique reste floue, en grande partie en raison du manque d’outils fiables pour ajouter ou supprimer les modifications de l’ADN dans le génome à une résolution spatiale et temporelle définie adéquatement. Pour surmonter cet obstacle, nous avons conçu une enzyme split-TET2 pour permettre le contrôle temporel de l’oxydation de la 5-méthylcytosine (5mC) et retouche ultérieure des États épigénétiques dans les cellules de mammifères en ajoutant simplement des produits chimiques. Nous décrivons ici les méthodes pour introduire un outil de retouche épigénome chimique-inductible (cidre), basé sur une enzyme machiné split-TET2, dans les cellules de mammifères et de quantifier la production inductible chimique de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) avec immunomarquage, cytométrie en flux ou un dosage de dot-blot. Cet outil de retouche épigénome chimique-inducible trouverez large utilisation en interrogeant les systèmes cellulaires sans modifier le code génétique, ainsi que dans la détection des relations epigenotype−phenotype dans les systèmes biologiques différents.

Conversion chimique de 5mC-à-5hmC inductible peut être validée par immunohistochimie au niveau de single-cell, analyse en cytométrie en flux sur les populations de cellules transfectées de (mCherry-positif) ou une épreuve plus quantitative de buvardage tel qu’illustré à la Figure 1. Le domaine catalytique de la TET2, ou TET2CD, ont été utilisés tout au long de l’étude comme témoin positif. Voir les références 18-20 pour plus amples renseignements sur la carto...

Des protocoles détaillés pour introduire une enzyme machiné split-TET2 (cidre) dans des cellules de mammifères pour hydroxymethylation chimique d’ADN inductible et remodelage épigénétique sont présentés.

Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

L’objectif global de cette série d’expériences est d’introduire une enzyme TET2 divisée appelée CiDER dans des cellules de mammifères pour la modification inductible de l’ADN telle que l’hydroxyméthylation ainsi que le remodelage épigénétique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, telles que : Le principal avantage de cette technique est que l’enzyme TET2 divisée modifiée permet un contrôle temporel de l’oxydation de la 5-méthylcytosine et du remodelage ultérieur des états épigénétiques dans les cellules de mammifères avec des additifs chimiques. Pour commencer cette procédure, cultivez une lignée cellulaire adhérente dans du DMEM complétée par 10 % de FBS inactivé par la chaleur ainsi que 100 unités par millilitre de pénicilline et de streptomycine.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Transfectez les cellules avec le plasmide CiDER comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, remplacez le milieu contenant du réactif de transfection par du DMEM complet frais. Pour induire chimiquement les cellules, ajoutez 20 microlitres de rapamycine diluée aux cellules transfectées maintenues dans deux millilitres de milieu pour atteindre une concentration finale de 200 nanomolaires. Pour effectuer une cytométrie en flux, réintroduisez les cellules transfectées et induites par la rapamycine dans le tampon FACS.Pour le groupe témoin, utilisez des cellules exprimant CiDER sans traitement par Rapamycin. Fixez et perméabilisez les cellules comme décrit dans le protocole texte. Ajoutez ensuite deux acides chlorhydriques normaux aux cellules pour dénaturer l’ADN pendant 10 minutes.Après avoir neutralisé et bloqué les cellules comme décrit dans le protocole textuel, ajoutez l’anticorps anti-5hmC dilué aux cellules. Incuber les cellules pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, laver les cellules avec le tampon FACS trois fois.Retirez complètement la mémoire tampon FACS. Ajouter un anticorps secondaire conjugué au fluorophore dilué pour l’analyse FACS et incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez trois fois les cellules avec un tampon FACS.Après le lavage, les échantillons sont prêts pour l’analyse FACS. Isolez l’ADN génomique de cellules transfectées et induites par la rapamycine à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial. Pour le groupe témoin, utilisez des cellules transfectées CiDER sans traitement à la rapamycine.Chauffez le four sous vide à 80 degrés Celsius. Pré-trempez la membrane de nitrocellulose dans de l’eau distillée doublement, puis dans un tampon SSC 6X pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 60 microlitres de quantités égales d’ADN sur une plaque PCR à 96 puits.Ajoutez 30 microlitres de tampon TE dans les puits restants. Faites des dilutions en série doubles verticalement sur la plaque de 96 puits en transférant 30 microlitres de solution dans la première rangée vers la même position de colonne dans la deuxième rangée. Mélangez à nouveau et transférez 30 microlitres de solution dans les puits de la rangée suivante jusqu’à ce que la limite soit atteinte.Retirez ensuite les 30 derniers microlitres du puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’hydroxyde de sodium molaire et 10 millimolaires d’EDTA dans chaque puits. Fermez la plaque et chauffez le mélange pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius pour dénaturer complètement l’ADN duplex.Refroidissez immédiatement les échantillons sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres d’acétate d’ammonium glacé à deux molaires dans chaque puits et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Pendant ce temps, assemblez l’appareil dot-blot avec la membrane pré-trempée.Retirez le tampon résiduel à l’aide d’un vide complet. Lavez la membrane en ajoutant 200 microlitres de tampon TE dans chaque puits de l’appareil dot-blot. Allumez l’aspirateur pour retirer la mémoire tampon TE.Ensuite, chargez l’ADN dénaturé dans chaque puits de l’appareil dot-blot. Allumez l’aspirateur pour retirer la solution. Lavez la membrane en ajoutant 200 microlitres de 2X SSC et éliminez complètement les solutions résiduelles à l’aide d’un aspirateur.Démontez l’appareil dot-blot. Retirez ensuite la membrane et rincez toute la membrane avec 20 millilitres de 2X SSC. Faites sécher la membrane à l’air libre pendant 20 minutes.Pour sécher davantage la membrane, faites-la cuire à 80 degrés sous vide pendant deux heures. Ajouter la solution de blocage à la membrane et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir jeté la solution de blocage, ajoutez les anticorps 5-hmC ou 5-mC dilués dans la membrane et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.Lavez la membrane avec du TBST trois fois pendant 10 minutes pour éliminer les anticorps résiduels. Après avoir soigneusement retiré le TBST, ajoutez un anticorps secondaire conjugué HRP à la membrane. Incuber la membrane pendant une heure à température ambiante.Lavez la membrane avec du TBST trois fois pendant 10 minutes. Enfin, ajoutez un substrat de western blot ECL à la membrane pour visualiser les signaux 5-hmC à l’aide d’un détecteur de chimiluminescence. Un résultat de quantification représentatif de la production de 5-hmC médiée par CiDER par cytométrie en flux est présenté ici.Seules les cellules exprimant CiDER dans des conditions traitées à la rapamycine montrent une augmentation significative des niveaux de 5-hmC. Un résultat représentatif de la variation globale du niveau de 5-hmC dans l’ensemble de la population cellulaire par dosage par transfert de points est présenté ici. Le contrôle de la charge est visualisé par coloration au bleu d’éthylène des quantités totales d’ADN d’entrée.Les résultats démontrent que le traitement à la rapamycine induit une production robuste de 5-hmC dans les cellules HEK293T exprimant CiDER avec une activité de fond négligeable. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique pour explorer la fonction cellulaire sans altérer le code génétique et pour sonder les relations entre l’épigénotype et le phénotype dans divers systèmes biologiques.

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JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l'aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l'enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d'étiquetage efficace et spécifique permet l'enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

ADN et les protéines sont-séquence spécifiquement étiquetés avec une affinité ou groupes rapporteurs fluorescents à l'aide ADN ou de protéines méthyltransférases et analogues de cofacteur synthétiques. En fonction de la spécificité du cofacteur des enzymes, aziridine ou doubles analogues de cofacteurs activés sont utilisés pour l'étiquetage d'une ou deux étapes.

Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

Nous présentons ici un protocole pour une purification efficace seule étape de l’humain sans balise active dix-onze translocation-2 (TET2) 5-méthylcytosine dioxygénase utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et son dosage à l’aide d’une masse en tandem par chromatographie liquide spectrométrie (LC-MS/MS)-approche de base.

Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

Des endonucleases de restriction avec une nouvelle spécificité de séquence peuvent être développées à partir d’enzymes reconnaissant une séquence partiellement dégénérée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé que nous avons utilisé avec succès pour modifier la spécificité de la séquence de l’enzyme NlaIV. Les ingrédients clés du protocole sont la compartimentation in vitro de la réaction de transcription/traduction et la sélection de variantes avec de nouvelles spécificités séquences.

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Les ADN méthyltransférases sont des cibles potentielles de médicaments anticancéreux. Ici, un protocole est présenté pour évaluer les petites molécules pour l’inhibition de l’ADN méthyltransférase. Ce test utilise une endonucléase pour coupler la méthylation de l’ADN à la génération de fluorescence et permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel.

Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Nous présentons ici un protocole pour la sélection in vitro de répresseurs transcriptionnels modifiés (ETR) avec une efficacité de silençage élevée, à long terme, stable et sur cible et une faible activité hors cible à l’échelle du génome. Ce flux de travail permet de réduire un répertoire initial et complexe de RTE candidats à une liste restreinte, adaptée à une évaluation plus approfondie dans des contextes thérapeutiquement pertinents.

In vitro Sélection de répresseurs transcriptionnels modifiés pour le silençage épigénétique ciblé

Ici, nous présentons un protocole pour réduire les modifications de l’ADN dans les bactériophages à l’aide de l’enzyme NgTET, permettant une mutagenèse CRISPR-Cas efficace et sans cicatrice. Cette méthode facilite le génie génétique des phages pour des applications en biotechnologie et en phagothérapie.

Mutagénèse précise des phages avec des systèmes CRISPR-Cas assistés par NgTET

Ce protocole décrit un système non intégratif, épisomal, basé sur CRISPR/dCas9 pour l’édition épigénétique ciblée dans les cellules K562, combinant des effecteurs dCas9-DNMT3A et dCas9-HDAC1 avec des sgRNA spécifiques pour induire une méthylation de l’ADN spécifique au locus avec précision et des effets hors cible réduits.

Génie épigénétique des cellules K562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’ADN à l’aide des protéines de fusion dCas9-DNMT3A et -HDAC1

Découvrez l'enzyme CiDER pour l'hydroxyméthylation de l'ADN induite chimiquement et le remodelage épigénétique dans les cellules mammifères. Cette méthode offre un contrôle temporel précis des modifications épigénétiques.

Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

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