Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

Des protocoles détaillés pour introduire une enzyme machiné split-TET2 (cidre) dans des cellules de mammifères pour hydroxymethylation chimique d’ADN inductible et remodelage épigénétique sont présentés.

L’objectif global de cette série d’expériences est d’introduire une enzyme TET2 divisée appelée CiDER dans des cellules de mammifères pour la modification inductible de l’ADN telle que l’hydroxyméthylation ainsi que le remodelage épigénétique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, telles que : Le principal avantage de cette technique est que l’enzyme TET2 divisée modifiée permet un contrôle temporel de l’oxydation de la 5-méthylcytosine et du remodelage ultérieur des états épigénétiques dans les cellules de mammifères avec des additifs chimiques. Pour commencer cette procédure, cultivez une lignée cellulaire adhérente dans du DMEM complétée par 10 % de FBS inactivé par la chaleur ainsi que 100 unités par millilitre de pénicilline et de streptomycine.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Transfectez les cellules avec le plasmide CiDER comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, remplacez le milieu contenant du réactif de transfection par du DMEM complet frais. Pour induire chimiquement les cellules, ajoutez 20 microlitres de rapamycine diluée aux cellules transfectées maintenues dans deux millilitres de milieu pour atteindre une concentration finale de 200 nanomolaires. Pour effectuer une cytométrie en flux, réintroduisez les cellules transfectées et induites par la rapamycine dans le tampon FACS.

Pour le groupe témoin, utilisez des cellules exprimant CiDER sans traitement par Rapamycin. Fixez et perméabilisez les cellules comme décrit dans le protocole texte. Ajoutez ensuite deux acides chlorhydriques normaux aux cellules pour dénaturer l’ADN pendant 10 minutes.

Après avoir neutralisé et bloqué les cellules comme décrit dans le protocole textuel, ajoutez l’anticorps anti-5hmC dilué aux cellules. Incuber les cellules pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, laver les cellules avec le tampon FACS trois fois.

Retirez complètement la mémoire tampon FACS. Ajouter un anticorps secondaire conjugué au fluorophore dilué pour l’analyse FACS et incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez trois fois les cellules avec un tampon FACS.

Après le lavage, les échantillons sont prêts pour l’analyse FACS. Isolez l’ADN génomique de cellules transfectées et induites par la rapamycine à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial. Pour le groupe témoin, utilisez des cellules transfectées CiDER sans traitement à la rapamycine.

Chauffez le four sous vide à 80 degrés Celsius. Pré-trempez la membrane de nitrocellulose dans de l’eau distillée doublement, puis dans un tampon SSC 6X pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 60 microlitres de quantités égales d’ADN sur une plaque PCR à 96 puits.

Ajoutez 30 microlitres de tampon TE dans les puits restants. Faites des dilutions en série doubles verticalement sur la plaque de 96 puits en transférant 30 microlitres de solution dans la première rangée vers la même position de colonne dans la deuxième rangée. Mélangez à nouveau et transférez 30 microlitres de solution dans les puits de la rangée suivante jusqu’à ce que la limite soit atteinte.

Retirez ensuite les 30 derniers microlitres du puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’hydroxyde de sodium molaire et 10 millimolaires d’EDTA dans chaque puits. Fermez la plaque et chauffez le mélange pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius pour dénaturer complètement l’ADN duplex.

Refroidissez immédiatement les échantillons sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres d’acétate d’ammonium glacé à deux molaires dans chaque puits et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Pendant ce temps, assemblez l’appareil dot-blot avec la membrane pré-trempée.

Retirez le tampon résiduel à l’aide d’un vide complet. Lavez la membrane en ajoutant 200 microlitres de tampon TE dans chaque puits de l’appareil dot-blot. Allumez l’aspirateur pour retirer la mémoire tampon TE.

Ensuite, chargez l’ADN dénaturé dans chaque puits de l’appareil dot-blot. Allumez l’aspirateur pour retirer la solution. Lavez la membrane en ajoutant 200 microlitres de 2X SSC et éliminez complètement les solutions résiduelles à l’aide d’un aspirateur.

Démontez l’appareil dot-blot. Retirez ensuite la membrane et rincez toute la membrane avec 20 millilitres de 2X SSC. Faites sécher la membrane à l’air libre pendant 20 minutes.

Pour sécher davantage la membrane, faites-la cuire à 80 degrés sous vide pendant deux heures. Ajouter la solution de blocage à la membrane et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir jeté la solution de blocage, ajoutez les anticorps 5-hmC ou 5-mC dilués dans la membrane et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Lavez la membrane avec du TBST trois fois pendant 10 minutes pour éliminer les anticorps résiduels. Après avoir soigneusement retiré le TBST, ajoutez un anticorps secondaire conjugué HRP à la membrane. Incuber la membrane pendant une heure à température ambiante.

Lavez la membrane avec du TBST trois fois pendant 10 minutes. Enfin, ajoutez un substrat de western blot ECL à la membrane pour visualiser les signaux 5-hmC à l’aide d’un détecteur de chimiluminescence. Un résultat de quantification représentatif de la production de 5-hmC médiée par CiDER par cytométrie en flux est présenté ici.

Seules les cellules exprimant CiDER dans des conditions traitées à la rapamycine montrent une augmentation significative des niveaux de 5-hmC. Un résultat représentatif de la variation globale du niveau de 5-hmC dans l’ensemble de la population cellulaire par dosage par transfert de points est présenté ici. Le contrôle de la charge est visualisé par coloration au bleu d’éthylène des quantités totales d’ADN d’entrée.

Les résultats démontrent que le traitement à la rapamycine induit une production robuste de 5-hmC dans les cellules HEK293T exprimant CiDER avec une activité de fond négligeable. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique pour explorer la fonction cellulaire sans altérer le code génétique et pour sonder les relations entre l’épigénotype et le phénotype dans divers systèmes biologiques.