Imagerie 3D à haute résolution du réseau Neuro-insulaire pancréas humain

Nous présentons ici un passif de protocole aux sections pancréas humain image en trois dimensions (3D) à l’aide en optimisé méthodes de compensation. Ce manuscrit montre ces procédures de compensation optique passive, suivie par plusieurs immunofluorescence souillant pour identifier les éléments clés des réseaux neurones autonomes et sensitifs innervant les îlots humains.

L’objectif global de ce protocole est de démontrer une méthode optimisée, passive et de dégagement optique, adaptée à une utilisation avec du tissu pancréatique humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, liées au diabète, en fournissant des détails sur l’innervation des îlots. Le principal avantage de cette technique est que la méthode de clarification assure la transparence du tissu pancréatique humain pour une utilisation dans l’imagerie confocale à haute résolution.

Pour commencer, fixez un échantillon de pancréas en le plaçant dans du paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé, et incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 48 heures. Ensuite, refroidissez une fiole en la plaçant dans un seau avec de la glace. Et puis placez le seau sur une plaque d’agitation magnétique.

Assurez-vous que la fiole est bien à plat et ajoutez un barreau d’agitation magnétique. Versez 147,8 millilitres d’eau distillée déminéralisée glacée dans le ballon. Ajoutez ensuite 20 millilitres de PBS 0,1 molaire, 20 millilitres d’une solution d’acrylamide glacée à 40 %, 12,2 millilitres d’une solution de paraformaldéhyde à 16 % et 250 milligrammes d’initiateur VA-044.

Mélangez toute la solution d’hydrogel pendant au moins 10 minutes. Placez ensuite un tube conique de 15 millilitres dans la glace à côté du flacon contenant la solution d’hydrogel. Pipeter 14 millilitres de solution monomère dans le tube.

et ajoutez un morceau de l’échantillon de tissu fixé et sectionné. Ensuite, bouchez le tube. Incuber l’échantillon dans la solution monomère pendant 3 jours à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière.

Après l’incubation, placez l’échantillon sur de la glace. Ensuite, connectez le tube à un réservoir d’azote à travers un robinet d’arrêt. Tout en gardant l’échantillon sur de la glace, utilisez soigneusement une aiguille hypodermique de calibre 18 pour percer le capuchon d’un tube conique contenant l’échantillon d’un côté.

Insérez l’aiguille dans le tube jusqu’à ce qu’elle soit sous la surface de la solution de monomère liquide. Ensuite, utilisez une autre aiguille hypodermique de calibre 18 pour percer le côté opposé du capuchon, mais ne le laissez pas s’immerger dans la solution, afin qu’il puisse agir comme un évent. Connectez le tube du réservoir d’azote à l’aiguille hypodermique immergée sous l’hydrogel et allumez lentement l’azote, jusqu’à ce qu’il bouillonne régulièrement dans le liquide.

Une fois désoxygéné, retirez rapidement les deux aiguilles et couvrez le capuchon d’un film de paraffine, afin d’éviter tout échange supplémentaire de gaz entre le tube et l’environnement. Enfin, placez l’échantillon dans un incubateur à 37 degrés Celsius, pendant trois heures, pour polymériser l’hydrogel. Après la polymérisation, versez l’hydrogel restant.

Ensuite, lavez l’échantillon en 3 à 5 échanges de PBS 0,01 molaire pendant 15 minutes à chaque étape de lavage. Une fois lavé, transférez l’échantillon dans un tube conique de 50 millilitres contenant 40 millilitres ou un tampon de nettoyage. Incuber l’échantillon dans le tampon de nettoyage à 37 degrés Celsius et changer l’échantillon pour un tampon de nettoyage frais tous les deux jours.

Pour vérifier la bonne clairance, tenez l’échantillon près d’une lumière et assurez-vous que l’échantillon laisse passer la lumière mais conserve une certaine coloration beige dans les régions exocrines. Un échantillon trop dégagé apparaîtra effiloché sur les bords et la texture sera très douce lorsqu’elle sera ramassée avec une pince. Il est courant qu’un échantillon s’éclaircisse de manière inégale.

Remplacez le tampon de clarification par 40 millilitres de PBS 0,01 molaire et placez les échantillons sur un agitateur à 60 tr/min pendant une journée à température ambiante. Effectuez quatre à cinq changements de tampon et laissez le lavage final se poursuivre pendant la nuit. Ensuite, préparez le tampon de coloration PACT dans un tube à fond plat de 2 millilitres et ajoutez 2 % de sérum normal à 1 millilitre de tampon PACT de base.

Ensuite, ajoutez environ cinq fois la quantité standard d’anticorps primaires au tampon de coloration. À l’aide d’une spatule, retirez l’échantillon du tampon de lavage et tamponnez l’excédent sur une serviette en papier. Placez l’échantillon dans le tube contenant la solution d’anticorps primaires et incubez-le dans la solution pendant deux à quatre jours à température ambiante, sur un agitateur, à 60 tr/min.

Après l’incubation, retirer la solution d’anticorps et ajouter 0,01 molaire de PBS. Lavez soigneusement les échantillons sur le shaker à 60 tr/min, en passant au tampon frais quatre à cinq fois et en laissant le lavage final sur le shaker pendant la nuit. Ensuite, ajoutez l’anticorps secondaire à 1 à 200 dans le tampon de coloration PACT avec 2 % de sérum ajouté.

À l’aide d’une spatule, retirez l’échantillon du tampon de lavage et tamponnez l’excédent de tampon sur une serviette en papier. Placez ensuite l’échantillon dans le tube avec la solution d’anticorps secondaire. Protégez l’échantillon de la lumière pendant l’incubation de l’échantillon à température ambiante sur un agitateur à 60 tr/min pendant deux jours.

Après l’incubation, retirer la solution d’anticorps et la remplacer par du PBS 0,01 molaire. Lavez soigneusement les échantillons sur l’agitateur à 60 tr/min, en passant au tampon frais quatre à cinq fois et en laissant le dernier lavage sur l’agitateur pendant la nuit. Pour commencer, préparez le tampon de solution à indice de réfraction adapté en pesant d’abord 11 grammes de milieu à gradient de densité non ionique et en le transférant soigneusement dans un tube conique de 50 millilitres.

Ajoutez ensuite 5 millilitres de tampon de phosphate de 0,02 molaire à l’aide d’une spatule pour libérer l’air du milieu à gradient de densité non ionique en poudre. Si nécessaire, portez le volume à 10 millilitres, en utilisant plus de tampon de phosphate de 0,02 molaire, mélangez-le avec une spatule, puis grattez l’excédent de la spatule dans le tube. Incuber le tampon à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il se dissolve complètement, en l’inversant et en le mélangeant doucement périodiquement.

Transférez les échantillons dans le tampon de solution d’adaptation à l’indice de réfraction et incubez-les sur la paillasse à l’abri de la lumière pendant deux à quatre jours avant l’imagerie. Juste avant l’imagerie, placez une petite quantité de la solution d’appariement de l’indice de réfraction dans une lame de chambre inférieure à huit puits. Ajoutez ensuite l’échantillon dans le puits et coiffez la lame.

Dans le pancréas humain, les îlots peuvent être délimités par l’insuline, le glucagon et le Grana Three sécrété pour les cellules bêta, les cellules alpha ou toutes les cellules endocrines respectivement. Les cellules de Schwann apparaissent blanches et les cellules endocrines sont colorées par l’insuline ou le glucagon. Les nerfs, qui courent le long des vaisseaux sanguins à la périphérie de l’îlot, se détachent sous forme de lignes blanches et s’étendent dans les îlots.

Ici, le contact entre les cellules de Schwann et les cellules endocrines est clairement visible. Ici, un échantillon préparé à l’aide des méthodes présentées dans cette vidéo a été coloré pour le peptide intestinal vasoactif et imagé à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière. Les fibres nerveuses sont clairement visibles en haute résolution et sont montrées enveloppant un conduit au premier plan et un ganglion à l’arrière-plan.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des régions pancréatiques acineuses exemptes de canaux et de vaisseaux majeurs.