Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

L’objectif global de cette procédure est de générer des kératinocytes humains primaires qui peuvent être utilisés comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules épidermiques, telles que la régulation de la différenciation des kératinocytes humains ou comme modèle pour l’étude des maladies inflammatoires de la peau. Les principaux avantages de cette technique sont que les kératinocytes humains primaires peuvent être isolés de manière conventionnelle de la peau adulte des hommes et des femmes et peuvent inclure la peau de personnes de tout âge de plus de 18 ans.

La démonstration de la procédure sera assurée par Annette Blak Rasmussen, une technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, préparez une solution de 50 millilitres de trypsine à 0,25 % et de glucose à 0,1 % dans du DPBS. Ensuite, mélangez et filtrez pour stériliser la solution.

Préparez 10 millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS, 50 millilitres de DPBS et un milieu exempt de sérum de kératinocytes, ou KSFM. Ajoutez des suppléments de KSFM et 250 microlitres de gentamicine à 500 millilitres de KSFM. Ensuite, préchauffez les solutions à 37 degrés Celsius avant de les utiliser.

Prélevez des échantillons de peau de 10 centimètres sur 15 centimètres de volontaires adultes en bonne santé subissant une chirurgie plastique. Gardez la peau au frais en transportant les échantillons de peau dans une boîte en polystyrène contenant un élément de refroidissement. Si nécessaire, conservez l’échantillon de peau à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

À l’aide de ciseaux, de scalpels et de pinces stérilisés, retirez la graisse sous la section de la peau. Ensuite, à l’aide d’aiguilles, bouclez la section de peau sur un couvercle stérile sur une plaque. À l’aide d’un tampon de gaze sec et stérilisé, nettoyez la peau.

Ensuite, appliquez 70 % d’éthanol sur un tampon de gaze stérilisé. Ensuite, à l’aide d’une raboteuse à pied, coupez la couche supérieure de l’épiderme de la section de la peau et transférez-la dans une boîte de Pétri de neuf centimètres. Ensuite, ajoutez immédiatement 25 millilitres de la solution de glucose de trypsine DPBS préalablement préparée dans la boîte de Pétri.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’une pipette, retirez la solution de trypsine glucosine DPBS de la boîte de Pétri et ajoutez 10 millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS pour inactiver la trypsine. Maintenant, à l’aide de deux pinces, libérez les cellules épidermiques dans le milieu en grattant et en agitant doucement l’épiderme et le compartiment dermique des sections cutanées.

Filtrez la suspension de cellules épidermiques à travers un filtre métallique et collectez le filtrat dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez les sections de peau restantes dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de RPMI 1640 sans FBS et vortex pendant 10 secondes. Filtrez cette suspension à travers le filtre métallique dans un tube de 50 millilitres contenant la suspension de cellules épidermiques.

Ensuite, ajoutez DPBS à un volume total de 50 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 450 fois G et à température ambiante, pendant 10 minutes. Ensuite, retirez le surnageant et, en fonction de la taille de la pastille cellulaire, remettez en suspension la pastille de cellules épidermiques dans environ 10 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM.

À l’aide de la méthode de coloration au bleu de trypan, comptez les cellules au microscope. Ensuite, dans chaque flacon de culture de 75 centimètres carrés, transférez huit fois 10 dans les sixièmes cellules, avec 12 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM. Agitez doucement les flacons de culture pour assurer une répartition uniforme des cellules.

Incuber les kératinocytes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 100 % d’humidité et 5 % de CO2. Changez de milieu après deux jours, puis trois fois par semaine. Lorsque les cellules atteignent 70-80 % de confluence, maintenez la quantité appropriée de solution EDTA à 0,05 % de trypsine à 37 degrés Celsius dans un incubateur.

Retirez le milieu des cellules et ajoutez 4,5 millilitres par flacon de culture de 75 centimètres carrés de solution préchauffée de trypsine EDTA à 0,05 % dans les cellules. Après avoir placé le ballon de culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes, vérifiez au microscope si les cellules ont commencé à se détacher. Lorsqu’environ 50 % des cellules se sont détachées, frappez doucement le ballon de culture contre la main pour détacher les cellules restantes.

Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajoutez six millilitres de RPMI 1640 à 37 degrés Celsius plus 2 % FBS dans le ballon de culture de 75 centimètres carrés et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de 50 millilitres. Rincez les flacons de culture avec trois millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS et ajoutez le milieu dans les tubes de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pendant 10 minutes à 450 fois G et à température ambiante.

Utilisez 10 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM pour remettre en suspension les cellules granulées. Ensuite, comptez et transférez trois fois 10 dans les six cellules dans une fiole de culture de 150 centimètres carrés, avec 20 millilitres de KSFM à 37 degrés Celsius. Agitez doucement le ballon de culture pour assurer une répartition uniforme des cellules, avant de remettre les cellules dans l’incubateur.

Lorsque la culture est confluente à 80-90 %, après avoir trypsinisé et transféré les cellules dans des tubes de 50 millilitres, comme démontré précédemment dans cette vidéo, rincez les flacons de culture avec six millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS et ajoutez-les dans les tubes de 50 millilitres. Centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 450 fois G et quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez un fluide de congélation glacé.

Remettez en suspension la pastille cellulaire dans du KSFM plus 10 % de DMSO. Ensuite, après avoir compté les cellules, congelez-les à une densité de six fois 10 à six cellules par millilitre, en utilisant des méthodes de cryoconservation standard à congélation lente. Stockez les kératinocytes dans de l’azote liquide jusqu’au moment de l’utiliser.

Comme on le voit ici, les kératinocytes humains ont été isolés et cultivés, comme le montre cette vidéo, puis stimulés avec du calcium. Ces images montrent les changements morphologiques dus à l’ajout de calcium les premier et deuxième jours, par rapport aux cellules traitées contrôlées. En plus des changements morphologiques, l’ajout de calcium a également entraîné une augmentation de la transcription de l’ARNm pour le marqueur de différenciation Involucrin, 5,5 fois après 24 heures et 3,5 fois après 48 heures.

Dans cette expérience, des kératinocytes cultivés ont été stimulés avec de l’IL-1 bêta pendant des durées variables. Comme l’a montré le Western blot, en l’espace de cinq minutes, la stimulation bêta de l’IL-1 a entraîné une phosphorylation rapide de la kinase p38 MAP, car la stimulation bêta de l’IL-1 n’a eu aucun effet sur les taux de protéines totales de la kinase p38 MAP. Au bout d’une heure, la phosphorylation de la kinase p38 MAP induite par l’IL-1 bêta est revenue à des niveaux basaux.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules épidermiques humaines pour explorer le rôle des kératinocytes dans les réponses immunitaires innées, ainsi que dans le développement de la peau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver des kératinocytes primaires à partir de peau humaine adulte, qui peuvent être utilisés comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro.