Name: Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des kératinocytes primaires à partir de peau adulte humaine. Cette méthode permet d'étudier la biologie cutanée in vitro et les mécanismes des maladies inflammatoires de la peau.

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L’auteur tient à remercier Annette Blak Rasmussen et Kristine Moeller pour leur support technique

Le prélèvement d’échantillons de peau sur des volontaires adultes sains qui subissent une chirurgie plastique doit être approuvée par le Comité éthique dans les établissements d’accueil. Ce protocole a été approuvé par la régionale Comité éthique de région Midtjylland, à Danemark (M-20110027). La méthode décrite ici provient d’études similaires par Maciaq et al. 10 et Liu et Karasek11.
1. isolement des kératinocytes de la peau humaine
<ol>
	<li>Commencez par faire les solutions suivantes : 50 mL de solution de glucose de la trypsine et 0,1 % 0,25 % au SPD. Filtre Mix et stérilisent (0,2 µm) la solution. Préparer 10 mL de milieu RPMI 1640 + 2 %, solution FBS, 50 mL de SPD et kératinocytes de milieu sans sérum (KSFM). Ajouter des suppléments de KSFM et 250 µL de gentamycine à 500 mL de KSFM. Réchauffez les solutions à 37 ° C avant utilisation.</li>
	<li>Recueillir la peau des volontaires adultes sains qui subissent une chirurgie plastique. Les échantillons de peau utilisés sont environ 10 cm x 15 cm, mais peuvent varier en taille. Garder la fraîcheur de la peau au titre des transports en transportant des échantillons de peau dans une boîte de Styrofoam contenant un élément de refroidissement. Si nécessaire, l’échantillon de peau peut être stocké à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Enlever le gras du dessous de la section de la peau à l’aide de pinces, scalpels et ciseaux stérilisés.</li>
	<li>Boucle de la section de la peau (environ 10 cm x 15 cm) sur une couverture stérile sur le dessus une plaque à l’aide d’aiguilles. Tout d’abord, nettoyer la peau avec une compresse stérile sèche. Puis nettoyer la peau en utilisant un tampon de gaze stérilisé avec l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>À l’aide d’un rabot de pied, couper du calque du dessus (épiderme) de la section de la peau et le mettre dans une boîte de Pétri de 9 cm. Puis, immédiatement ajouter 25 mL de la solution de trypsine/SPD/glucose (préparée à l’étape 1.1) de la boîte de Pétri. Incuber 30 min à 37 ° C.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette enlever la solution de trypsine/SPD/glucose de la boîte de Pétri et ajouter 10 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS pour inactiver la trypsine.</li>
	<li>À l’aide de deux pinces, maintenant libérer les cellules épidermiques dans le milieu par doucement raclage et agitation de l’épiderme et le compartiment par voie cutanée des sections peau.</li>
	<li>La suspension de cellules épidermiques filtrer sur un filtre métallique (taille de trou de 1 mm) et de recueillir dans un tube de 50 mL. Ajouter les sections restantes de la peau dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu RPMI-1640 sans FBS et vortex pour filtre s. 10 la suspension à travers le métal du filtre dans un tube de 50 mL contenant la suspension de cellules épidermiques. Ajouter SPD à un volume total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 450 g à la température ambiante.</li>
	<li>Retirez le surnageant et Resuspendre le culot de cellules épidermiques dans environ 10 mL de 37 ° C KSFM selon la taille du culot cellulaire. Compter les cellules en utilisant le bleu de Trypan méthode sous microscope. Le nombre de cellules obtenues à partir d’une section de peau de 10 cm x 15 cm est d’environ 50-100 x 106 cellules. À chaque flacon de culture de2 75 cm, 8 x 106 cellules avec 12 mL de 37 ° C KSFM de transfert. Secouer doucement les flacons de culture pour assurer une distribution uniforme des cellules.</li>
	<li>Incuber les kératinocytes dans un incubateur à 37 ° C avec 100 % d’humidité et 5 % de CO2. Changer le support après 2 jours et trois fois par semaine. Cellules de passage lorsque la culture est anastomosé 70 à 80 %, ce qui prend environ 2 semaines, selon le taux de prolifération des kératinocytes.</li>
</ol>
2. passage des kératinocytes
<ol>
	<li>Faire chauffer la quantité appropriée de la solution de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 ° C dans un incubateur. Utilisez 4,5 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour un flacon de culture de2 75 cm.</li>
	<li>Éliminer le milieu des cellules et ajouter le flacon de culture 4,5 mL/75 cm2 préchauffée solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour les cellules. Placer le flacon de culture dans un incubateur à (37 ° C) et après environ 5 min, vérifier au microscope si les cellules ont commencé à desserrer.</li>
	<li>Quand environ 50 % des cellules sont desserrées, doucement frapper le ballon de la culture contre la main pour desserrer les cellules restantes. Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajouter 6 mL de RPMI 1640 + 2 % SVF (37 ° C) dans le flacon de culture de2 75 cm et transférer la suspension cellulaire aux tubes de 50 mL.</li>
	<li>Rincer les flacons de culture avec 3 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS et ajouter aux tubes de 50 mL. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 450 g à la température ambiante.
	<ol>
		<li>Remettre en suspension les cellules granulés dans 10 mL de KSFM (37 ° C). Compter les cellules non vides et 3 x 106 cellules de transfert à un flacon de culture de2 150 cm avec 20 mL de KSFM (37 ° C). Agiter doucement le flacon de culture pour assurer une distribution uniforme des cellules. Geler les cellules alors que la culture est anastomosé 80 à 90 %, ce qui prend environ 4 à 6 jours selon le taux de prolifération des kératinocytes (voir la Section 3, gel protocole ci-dessous). Développez les kératinocytes pour générer des stocks congelés appropriés.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. gel des kératinocytes
<ol>
	<li>Faire chauffer la quantité appropriée de la solution de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 ° C dans un incubateur. Utilisation 9 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour un flacon de culture de2 150 cm.</li>
	<li>Éliminer le milieu des cellules et ajouter le flacon de culture 9 mL/150 cm2 préchauffée solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour les cellules. Placer le flacon de culture dans un incubateur à (37 ° C) et après environ 5 min, vérifier au microscope si les cellules ont commencé à desserrer.</li>
	<li>Quand environ 50 % des cellules sont desserrées, frapper doucement le flacon de culture contre la main afin de détacher les cellules restantes. Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajouter 12 mL du milieu RPMI 1640 + 2 % SVF (37 ° C) dans le flacon de culture de2 150 cm et aspirer la suspension cellulaire aux tubes de 50 mL.</li>
	<li>Rincer les flacons de culture avec 6 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS et ajouter aux tubes de 50 mL. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 450 x g à 4 ° C. Préparer la cellule glacée congélation moyen (KSFM + 10 % DMSO).</li>
	<li>Resuspendre le culot dans KSFM + 10 % DMSO, compter les cellules non vides et geler les cellules à une densité de 6 x 106 cellules/mL à l’aide de standard-congélation lente cryoconservation méthodes12.</li>
	<li>Stocker les kératinocytes dans l’azote liquide (phase vapeur) jusqu'à utilisation.</li>
</ol>
4. le dégel et la culture de kératinocytes congelés
<ol>
	<li>Rapidement décongeler les flacons congelés appropriés dans un bain-marie à 37 ° C. Utiliser l’éthanol à 70 % pour nettoyer l’extérieur de la cryovial. Transférer le nombre adéquat de cellules (environ 15 000 cellules/cm2) dans une fiole de culture et ajouter immédiatement milieu de croissance pré chauffé (KSFM) dans le flacon de culture. N’importe quelle taille de flacons de culture peut être utilisé selon le paramétrage de l’expérience.</li>
	<li>Utiliser 5 mL de milieu de culture pour un flacon de culture de 25 cm2 .</li></ol>Le nombre de cellules a ajouté que le flacon de culture peut-être varier étant donné que la croissance des cellules varie de bailleurs de fonds aux donateurs. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 100 % d’humidité et 5 % de CO2.
	<li>Changement du milieu après 2 jours et trois fois par semaine à l’aide de frais préchauffé KSFM. Remarque : Nos données ont démontré que, en moyenne, 95 % des cellules isolées par le protocole décrit ici sont positifs pour les kératinocytes-marqueur cytokeratine-1413.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
<li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+%28MMP-1%29+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li>
<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
<li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth%3A+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li>
<li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. L’auteur n’a aucun conflit d’intérêts.

Ici, nous décrivons comment isoler facilement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et à leur culture in vitro. Ce modèle peut avoir une large demande d’enquête de la biologie cellulaire épidermique et peut être utile pour les chercheurs intéressés à étudier les maladies cutanees.
Certains des avantages du protocole décrit ici est que, contrairement aux kératinocytes isolées du prépuce néonatal obtenu à partir des mâles nouveau-nés subissant la circoncision, les kératinoc...

La peau est le plus grand organe du corps humain et agit comme une barrière protectrice contre l’environnement externe. La peau est composée de deux couches principales : le derme et l’épiderme, où l’épiderme constitue la couche la plus superficielle de la peau. Le type de cellule plus abondant dans l’épiderme est les kératinocytes comprenant plus de 95 % de la masse1,de cellule2. Les kératinocytes sont maintenues à différents stades de différenciation dans l’épiderme et sont organisés en couches basales, épineux, granulaires et cornéocytaire qui correspondent à des étapes spécifiques de différenciation3. La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, produisant ainsi une barrière intacte au monde extérieur.
Les kératinocytes représentent également la première ligne de défense contre les agents pathogènes de la peau et jouent donc un rôle important dans la réponse immunitaire innée4,5. Exposition des kératinocytes aux stimuli externes conduit à l’activation des voies de signalisation intracellulaires et par la suite, la production d’un certain nombre de différents médiateurs inflammatoires, y compris les cytokines, chimiokines et peptides antimicrobiens. Ces protéines dérivées des kératinocytes participent dans la réponse inflammatoire en recrutant et en activant des cellules immunitaires comme les cellules dendritiques, les neutrophiles et spécifiques T cellules6,7. Ainsi, parce que les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, la justification de la technique présentée ici était de générer un modèle in vitro pour étudier la biologie de la peau. Cultures de kératinocytes primaire provenant du prépuce néonatal sont souvent utilisés pour étudier la biologie de la peau8,9. Cependant, avec la technique décrite ici, les kératinocytes des deux sexes sont obtenus résultant en une plus grande diversité biologique des cellules.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la génération des kératinocytes humains primaires de peau adulte, y compris l’entretien et la congélation des kératinocytes. L’objectif général de cette méthode est de générer des kératinocytes humains primaires pouvant servir comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Suppléments KSFM ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>37000-015</td><td>Suppléments pour KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS sans calcium et magnésium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Diméthylsulfoxyde</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Additif de milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Filtre de stérilisation</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Filtre à seringue avec une taille de pores de 0,2 & micro ; m</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Utilisé pour trypsiniser les cellules</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Utilisé pour inactiver la trypsine</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>-</td><td>-</td><td>Les pinces de n’importe quelle entreprise peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>-</td><td>-</td><td>Les ciseaux de n’importe quelle entreprise peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Les scalpels de n’importe quelle entreprise peuvent être utilisés à</td></tr><tr><td>70 % d’éthanol</td><td>-</td><td>-</td><td>--</td></tr><tr><td>Les tampons de gaze</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Tampons de gaze de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Raboteuse à pied</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Raboteuse à pied de n’importe quel fournisseur peut être utilisée</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Des boîtes de Pétri de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Filtre métallique</td><td>-</td><td>-</td><td>Interne Trou de 1 mm Filtre métallique</td></tr><tr><td>75 cm2 flacons de culture</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>156499-150 cm2 TTP</td><td></td><td>90151-0,05</td><td></td></tr><tr><td> % Trypsine-EDTA solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Utilisé pour trypsiniser les cellules lors du passage</td></tr></tbody></table>

génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, tout en conservant une barrière mécanique au monde extérieur. En outre, les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans l’initiation, d’entretien et règlement de la réponse immunitaire épidermique en faisant partie du système immunitaire inné répondant aux stimulations antigéniques d’une manière rapide, non spécifique. Nous décrivons ici un protocole pour l’isolement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et de démontrer que ces cellules répondent à la différenciation terminale induits par le calcium, telle que mesurée par une augmentation de l’expression de l’involucrin de marqueur de différenciation. En outre, nous montrons que les kératinocytes isolés sont sensibles aux induite par l’IL-1β activation des voies de signalisation intracellulaires, telle que mesurée par l’activation de la voie de p38 MAPK. Ensemble, nous décrivons une méthode d’isolement et de mise en culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte. Parce que les kératinocytes sont le type cellulaire prédominant dans l’épiderme, cette méthode est utile pour étudier les mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Différenciation terminale induits par le calcium Kératinocytes humains subissent une différenciation terminale par traitement avec du calcium14,15,16. Des kératinocytes humains primaires ont été isolées et cultivées comme décrit dans le protocole ci-dessus. Quand environ 50-60 % anastomosé, les cellules sont stimulées avec calcium (1,2 mM) ou véhicule et photos des cellules ont été prises le jour 0, 1 et 2. <...

La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des kératinocytes humains primaires qui peuvent être utilisés comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules épidermiques, telles que la régulation de la différenciation des kératinocytes humains ou comme modèle pour l’étude des maladies inflammatoires de la peau. Les principaux avantages de cette technique sont que les kératinocytes humains primaires peuvent être isolés de manière conventionnelle de la peau adulte des hommes et des femmes et peuvent inclure la peau de personnes de tout âge de plus de 18 ans.La démonstration de la procédure sera assurée par Annette Blak Rasmussen, une technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, préparez une solution de 50 millilitres de trypsine à 0,25 % et de glucose à 0,1 % dans du DPBS. Ensuite, mélangez et filtrez pour stériliser la solution.Préparez 10 millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS, 50 millilitres de DPBS et un milieu exempt de sérum de kératinocytes, ou KSFM. Ajoutez des suppléments de KSFM et 250 microlitres de gentamicine à 500 millilitres de KSFM. Ensuite, préchauffez les solutions à 37 degrés Celsius avant de les utiliser.Prélevez des échantillons de peau de 10 centimètres sur 15 centimètres de volontaires adultes en bonne santé subissant une chirurgie plastique. Gardez la peau au frais en transportant les échantillons de peau dans une boîte en polystyrène contenant un élément de refroidissement. Si nécessaire, conservez l’échantillon de peau à quatre degrés Celsius pendant la nuit.À l’aide de ciseaux, de scalpels et de pinces stérilisés, retirez la graisse sous la section de la peau. Ensuite, à l’aide d’aiguilles, bouclez la section de peau sur un couvercle stérile sur une plaque. À l’aide d’un tampon de gaze sec et stérilisé, nettoyez la peau.Ensuite, appliquez 70 % d’éthanol sur un tampon de gaze stérilisé. Ensuite, à l’aide d’une raboteuse à pied, coupez la couche supérieure de l’épiderme de la section de la peau et transférez-la dans une boîte de Pétri de neuf centimètres. Ensuite, ajoutez immédiatement 25 millilitres de la solution de glucose de trypsine DPBS préalablement préparée dans la boîte de Pétri.Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’une pipette, retirez la solution de trypsine glucosine DPBS de la boîte de Pétri et ajoutez 10 millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS pour inactiver la trypsine. Maintenant, à l’aide de deux pinces, libérez les cellules épidermiques dans le milieu en grattant et en agitant doucement l’épiderme et le compartiment dermique des sections cutanées.Filtrez la suspension de cellules épidermiques à travers un filtre métallique et collectez le filtrat dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez les sections de peau restantes dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de RPMI 1640 sans FBS et vortex pendant 10 secondes. Filtrez cette suspension à travers le filtre métallique dans un tube de 50 millilitres contenant la suspension de cellules épidermiques.Ensuite, ajoutez DPBS à un volume total de 50 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 450 fois G et à température ambiante, pendant 10 minutes. Ensuite, retirez le surnageant et, en fonction de la taille de la pastille cellulaire, remettez en suspension la pastille de cellules épidermiques dans environ 10 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM.À l’aide de la méthode de coloration au bleu de trypan, comptez les cellules au microscope. Ensuite, dans chaque flacon de culture de 75 centimètres carrés, transférez huit fois 10 dans les sixièmes cellules, avec 12 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM. Agitez doucement les flacons de culture pour assurer une répartition uniforme des cellules.Incuber les kératinocytes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 100 % d’humidité et 5 % de CO2. Changez de milieu après deux jours, puis trois fois par semaine. Lorsque les cellules atteignent 70-80 % de confluence, maintenez la quantité appropriée de solution EDTA à 0,05 % de trypsine à 37 degrés Celsius dans un incubateur.Retirez le milieu des cellules et ajoutez 4,5 millilitres par flacon de culture de 75 centimètres carrés de solution préchauffée de trypsine EDTA à 0,05 % dans les cellules. Après avoir placé le ballon de culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes, vérifiez au microscope si les cellules ont commencé à se détacher. Lorsqu’environ 50 % des cellules se sont détachées, frappez doucement le ballon de culture contre la main pour détacher les cellules restantes.Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajoutez six millilitres de RPMI 1640 à 37 degrés Celsius plus 2 % FBS dans le ballon de culture de 75 centimètres carrés et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de 50 millilitres. Rincez les flacons de culture avec trois millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS et ajoutez le milieu dans les tubes de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pendant 10 minutes à 450 fois G et à température ambiante.Utilisez 10 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM pour remettre en suspension les cellules granulées. Ensuite, comptez et transférez trois fois 10 dans les six cellules dans une fiole de culture de 150 centimètres carrés, avec 20 millilitres de KSFM à 37 degrés Celsius. Agitez doucement le ballon de culture pour assurer une répartition uniforme des cellules, avant de remettre les cellules dans l’incubateur.Lorsque la culture est confluente à 80-90 %, après avoir trypsinisé et transféré les cellules dans des tubes de 50 millilitres, comme démontré précédemment dans cette vidéo, rincez les flacons de culture avec six millilitres de RPMI 1640 plus 2 % FBS et ajoutez-les dans les tubes de 50 millilitres. Centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 450 fois G et quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez un fluide de congélation glacé.Remettez en suspension la pastille cellulaire dans du KSFM plus 10 % de DMSO. Ensuite, après avoir compté les cellules, congelez-les à une densité de six fois 10 à six cellules par millilitre, en utilisant des méthodes de cryoconservation standard à congélation lente. Stockez les kératinocytes dans de l’azote liquide jusqu’au moment de l’utiliser.Comme on le voit ici, les kératinocytes humains ont été isolés et cultivés, comme le montre cette vidéo, puis stimulés avec du calcium. Ces images montrent les changements morphologiques dus à l’ajout de calcium les premier et deuxième jours, par rapport aux cellules traitées contrôlées. En plus des changements morphologiques, l’ajout de calcium a également entraîné une augmentation de la transcription de l’ARNm pour le marqueur de différenciation Involucrin, 5,5 fois après 24 heures et 3,5 fois après 48 heures.Dans cette expérience, des kératinocytes cultivés ont été stimulés avec de l’IL-1 bêta pendant des durées variables. Comme l’a montré le Western blot, en l’espace de cinq minutes, la stimulation bêta de l’IL-1 a entraîné une phosphorylation rapide de la kinase p38 MAP, car la stimulation bêta de l’IL-1 n’a eu aucun effet sur les taux de protéines totales de la kinase p38 MAP. Au bout d’une heure, la phosphorylation de la kinase p38 MAP induite par l’IL-1 bêta est revenue à des niveaux basaux.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules épidermiques humaines pour explorer le rôle des kératinocytes dans les réponses immunitaires innées, ainsi que dans le développement de la peau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver des kératinocytes primaires à partir de peau humaine adulte, qui peuvent être utilisés comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro.

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