Name: Cinématique oculaire mesurée In Vitro la stimulation des nerfs crâniens de la tortue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez la cinématique des mouvements oculaires chez la tortue Trachemys scripta par stimulation des nerfs crâniens sur préparation isolée in vitro. Cette méthode électrophysiologique permet d'étudier l'évolution de la vision sans entraînement animal.

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Les auteurs remercient Mme Paulette McKenna et Lisa Pezzino dans cette étude pour les services de secrétariat et M. Phil Auerbach pour le support technique. Les auteurs remercient également les Drs Michael Ariel et Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) pour nous introduire à la préparation de tête en vitro isolé. Prise en charge de cette collaboration a été financé par le département de biologie (Robert S. Chase Fund), le Comité de la recherche universitaire et du programme de neurosciences au Lafayette College. Enfin, cette oeuvre est dédiée à M. Phil Auerbach, qui est décédé le 28 septembre 2016 ; Il a retiré du service en microscopie électronique à balayage et a reconnu l’utilité de son étape 5 axes pour une utilisation dans le présent protocole. Son amitié et l’ingéniosité nous manquera grandement.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Étapes essentielles :
Les étapes critiques au sein de ce protocole sont les suivants : 1) la dissection et le soin apporté à maintenir la viabilité des nerfs sectionnées ; 2) la correspondance des tailles par les électrodes d’aspiration aux nerfs crâniens à répondre de manière cohérente ; et 3) le placement de la tête dans le cardan d’étalonnage adéquat des rotations de le œil.
Dépannage :
La dissection peut être difficile, mais après avoir fin...

Justification de l’utilisation des tortues à oreilles rouges dans des expériences électrophysiologiques :
Tortues à oreilles rouges (Trachemys scripta elegans), sont considérés comme un des pires d’espèces envahissantes du monde1 et peut indiquer qu’un écosystème est en difficulté. Pourquoi les tortues à oreilles rouges sont parvenus est mal comprise, mais elle peut être en partie en raison de leur physiologie tolérante et la possession des tissus nerveux qui peut survivre dans des conditions hypoxiques2,3,4 . Leur utilisation pour l’expérimentation ne menace pas leurs numéros et avec des efforts minimes, préparations électrophysiologiques peuvent demeurer viables sur longues durées, tant que 18 heures5,6. L’avantage est semblable à l’avantage d’utiliser des animaux invertébrés tels que les écrevisses7, qui ont également la capacité de résister à faibles niveaux d’oxygène8.
Techniques de mesure des mouvements oculaires :
Approches pour mesurer les mouvements des yeux chez les animaux aux yeux frontal à l’aide de primates non humains ont été bien développé9. Le œil tourne en orbite autour de trois axes : horizontal, vertical et de torsion. La méthode de bobine magnétique de recherche est généralement considérée comme la plus fiable pour la mesure des rotations, mais est envahissante, exigeant des petites bobines pour être inséré dans les scleras des animaux10,11. Systèmes vidéo peuvent également mesurer des rotations et ont l’avantage d’être non invasive. Le développement de meilleures caméras ainsi que de traitement d’image innovants ont amélioré leurs fonctionnalités rendant les systèmes axés sur la vidéo une alternative intéressante à envisager le12,13,14.
Les techniques développées pour mesurer les mouvements des yeux en nonmammals ont été beaucoup moins importants. Mesures sont soit basse résolution ou décrivent quelques-unes des rotations15,16,17,18. Le manque de développement peut être partiellement attribué à la difficulté de nonmammals de formation pour suivre des cibles visuelles. Bien que les mouvements oculaires ont été bien documentés dans les oreilles rouges tortues19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, en raison de la contestation chez les animaux de la formation de suivre les objectifs, la cinématique précise de leurs mouvements oculaires est mal compris.
Tortues à oreilles rouges sont généralement considérés comme vertébrés aux yeux latéraux, mais parce qu’ils peuvent rentrer complètement leurs têtes dans leur coquille31, occlusion significative des champs visual latéraux de la carapace produit32. Le résultat est que leur ligne de mire visuelle est forcé vers l’avant, ce qui les rend se comportent plus comme des mammifères aux yeux frontal. Par conséquent, leur utilisation comme un modèle pour l’élaboration d’approches pour mesurer les mouvements des yeux offre également un point de vue évolutif unique.
Le protocole décrit dans cet ouvrage utilise une préparation in vitro isolés tête pour identifier la cinématique des mouvements oculaires dans les tortues à oreilles rouges. Cerveau est disséqués de crânes laissant les nerfs crâniens intact. Chefs sont placées dans un cardan pour calibrer les mouvements oculaires et évoquent des réponses par stimulation électrique des nerfs crâniens innervant les muscles oculaires. Des rotations par les yeux, les mesures sont faites par un système vidéo, en utilisant des algorithmes logiciels, qui trace la pupille sombre et les marquages de l’iris. L’établissement offre la possibilité de mesurer la cinématique des deux extra-oculaires (c'est-à-direles rotations horizontales, verticales et torsion)32 et intraoculaires (c.-à-d., variations de la pupille)33 mouvements.
Système de modèle pour l’analyse des voies nerveuses efférentes :
Plus généralement, l’approche offre la possibilité d’étudier les signaux neuronaux efférents comment générer des mouvements oculaires lorsque les muscles commencent leurs États détendue et en l’absence d’information sensorielle intégré traitée par le cerveau32, les enquêteurs 33. Par conséquent, la cinématique de le œil peut être examinée dans un système de modèle dans lequel elles sont traitées uniquement par la voie neuronale efférente, laissant le cerveau et synapsing sur les muscles.

<table><tbody><tr><td>Tortues à oreilles rouges</td><td>Kons Scientific</td><td>Trachemys scripta elegans</td><td>Grande taille (longueur de la carapace 15-20 cm)</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Choure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>M7304</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>C5767</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique concentré</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>H7020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Oakton</td><td>pH 6+</td><td></td></tr><tr><td>Électrode de stimulation par aspiration</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>Électrode d’aspiration bipolaire. Notez que 573000 a été remplacé par 573050.</td></tr><tr><td>Verre capillaire</td><td>A-M systems</td><td>626000</td><td>Verre capillaire borosilicaté à barillet unique sans microfilament, longueur 10 cm, diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,50 mm</td></tr><tr><td>Électrode de stimulation par aspiration alternative</td><td>A-M Systems</td><td>573050</td><td>Électrode d’aspiration bipolaire. Nécessite un verre capillaire de plus grand diamètre : 627000, diamètre extérieur 1,2 mm, diamètre intérieur 0,68 mm</td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Lieca</td><td>GZ7</td><td>Plage de grossissement, 10x &ndash ; 70x</td></tr><tr><td>Source lumineuse à fibre optique</td><td>Amscope</td><td>HL250-A</td><td>150W Microscope à fibre optique illuminateur caisson lumineux</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>625654</td><td>en acier inoxydable, ressort droit, 5,25"</td></tr><tr><td>Sonde de dissection émoussée</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>627405</td><td>sonde du centre commercial Huber, sonde à double extrémité et chercheur,</td></tr> <tr>ciseaux de <td>microscission</td> 6 » <td>Carolina Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>ciseaux de microdissection Iris, acier inoxydable, lames de 0,5 », pince fine de 4,75 » de long</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>F6521</td><td>Pince de bijoutier, dumont n° 5, alliage d’inox, 4,25 "</td></tr><tr><td>Pince incurvée</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>Z168696</td><td>Pointe moyenne, pince incurvée, acier inoxydable,</td></tr> <tr><td>manche de scalpel</td> 4" <td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2896</td><td>Manches de scalpel, n° 3, acier inoxydable</td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2771</td><td>Lames de scalpel, n° 11, acier</td></tr><tr><td>Guillotine</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-1918</td><td>Guillotine Kleine type 7575</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Sigma</td><td>Z648299</td><td>Micro cuillère et spatule set de pesée. Utiliser une petite spatule : 5,9" long x 0,07 po Diamètre de la poignée avec extrémité carrée : 0,17" x 1,3 po Long, autre extrémité ronde : 0,17 po x 1,27 po </td></tr><tr><td>Long Hook</td><td>Autozone</td><td>98069</td><td>SureBilt hook and pick set. Utilisez le broyeur pour émousser les pointes pointues de l’hameçon afin d’éviter de blesser la bouche des animaux.</td></tr><tr><td>95/5 % O2/CO2</td><td>Airgas, Inc.</td><td>X02OX95C2003102</td><td>5 % de dioxyde de carbone équilibre oxygène certifié mélange gazeux standard, bouteille de taille 200, CGA-296</td></tr><tr><td>Régulateur</td><td>Airgas, Inc.</td><td>Y11244D296-AG</td><td>Régulateur de cylindre analytique mono-étagé en laiton 0-100 psi CGA-296 avec sortie d’aiguille. Utilisez une valve de tuyau d’air réglable en laiton pour passer de 3/8 », de diamètre intérieur, un tube d’air en vinyle connecté au régulateur à un diamètre intérieur de 3/16 », un raccord d’air allant à une pipette en pierre à air ou en verre pasteur</td></tr>.<tr><td>Valve de tuyau d’air réglable</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-12061</td><td>Valve en laiton</td></tr><tr><td>Table rigide</td><td>Inconnu</td><td>Inconnu Porte</td><td>autoclave posée sur une table solide. Neuf balles de tennis de 5 po de diamètre isolent les vibrations de la surface supérieure de la table.</td></tr><tr><td>Balle de tennis 5"</td><td>Petco Animal Supplies, Inc.</td><td>712868</td><td>balle de tennis Petco Jumbo Pet : les balles sont découpées et maintenues dans un cadre intégré sur la partie inférieure de la porte de l’autoclave.</td></tr><tr><td>Table alternative d’isolation des vibrations</td><td>Newport Corporation</td><td>INT1-36-6-N</td><td>Système rigide de contrôle des vibrations, intégrité 1 : Dimensions de surface, 3' x 6'Gimbal</td></tr> <tr><td></td><td>ISI, International Scientific Instruments, Inc.</td><td>Platine de SUPER III-A Scanning EM</td><td>Platine eucentrique à 5 axes : mouvements linéaires X, Y et Z, &plusmn ; Précision de 20 mm, 0,1 mm ; Rotations, verticales, &plusmn ; 10&deg ;, et horizontal, &plusmn ; 12,5 ° ° ° , avec 1,25 ° ° précision. Remarque : de l’instrument de mise hors service.</td></tr><tr><td>Mandrin pour cardan</td><td>Inconnu</td><td>Le</td><td>mandrin d’un vieux microtome de fabrication inconnue a été usiné pour s’adapter à l’arbre du porte-échantillon de l’étage de balayage EM</td></tr><tr><td>cardan alternatif</td><td>ThorLabs, Inc.</td><td>GN2/M avec MBT602/M</td><td>Goniomètre à deux axes (GN2/M) monté sur une platine à 3 axes avec ajusteurs à vis moletées (MBT602/M) : concevoir un mandrin pour maintenir la tête de tortue avec l’œil à 12,7 mm au-dessus de la surface supérieure du goniomètre (distance au point de rotation)</td></tr><tr><td>Système de suivi oculaire basé sur la vidéo</td><td>Arrington Research, Inc.</td><td>ViewPoint EyeTracker, PC-60</td><td>Méthode de suivi : Vidéo infrarouge par pupille sombre ; Appareil photo noir et blanc (article BC02) : 30 Hz, 640 x 480 ; Configuration requise : Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10 ; Portée visuelle : Horizontale +/- 44&deg ;; vertical +/- 20&deg ;; Précision ~0.5&deg ;; Résolution spatiale ~0.15&deg ;; Résolution de la taille de la pupille ~0,03 mm ; Données oculaires : X, Y, position du regard, hauteur et largeur de la pupille, torsion, temps delta, temps total et régions d’intérêt (ROI) ; Communication en temps réel (article 0022) : sortie analogique à 4 canaux avec huit canaux d’entrée TTL pour marquer les codes dans le fichier</td></tr><tr><td>de données Base magnétique multiposition</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>Pittsburg, article #5645</td><td>Le support magnétique atteint jusqu’à 12" et produit 45 lb de traction magnétique. Permet de positionner la caméra. Usinez des trous de vissez à l’extrémité de la tige pour monter les caméras.</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Kopf</td><td>900</td><td>Manipulation 5 axes pour le montage de l’électrode d’aspiration : X, Y, Z course linéaire, 2 axes de rotation Lunette de</td></tr><tr><td>dissection sur rampe</td><td>Lieca</td><td>GZ6</td><td>Plage de grossissement, 6,7x &ndash ; 40x</td></tr><tr><td>Stimulateur nerveux/musculaire</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>Grass S88</td><td>Stimulateur de tension à double impulsion : deux canaux de sortie qui peuvent être exploités indépendamment ou synchronisés pour générer des impulsions à tension constante non isolées (10 mv à 150 V). Les impulsions peuvent être uniques (10 &mu ; s à 10 sec), répétitifs (0,01 Hz à 1 KHz) et trains (1 ms à 10 s) et synchronisés avec les entrées et sorties TTL. Envoyez des sorties TTL via les canaux de sortie d’un connecteur DB25 vers les canaux d’entrée TTL du ViewPoint EyeTracker. Remarque : Astro-Med Grass Telefactor n’est plus en affaires.</td></tr><tr><td>Dispositif d’isolation de courant</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>PSIU6</td><td>Unité d’isolation de stimulus de courant : permet de fournir en toute sécurité des courants constants par le S88 à la préparation. Le PSIU6 se connecte par un câble BNC à l’un des canaux de sortie du S88. Les commutateurs multiplicateurs sur le PSIU6 permettent au S88 de générer un large éventail d’amplitudes de courant allant de 0,1 à micro ; A à 15 mA.</td></tr><tr><td>Stimulateur nerf/musculaire alternatif avec isolation</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>Stimulateur d’impulsions isolé : L’unité dispose d’un isolateur intégré pour produire des courants constants.</td></tr></tbody></table>

cinématique oculaire mesurée in vitro la stimulation des nerfs crâniens de la tortue

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Après que les animaux est euthanasiés, leurs tissus commencent à mourir. Tortues d’offrir un avantage en raison d’une plus longue durée de survie de leurs tissus, surtout comparé aux vertébrés à sang chaud. Pour cette raison, des expériences in vitro chez les tortues peuvent être effectuées pour des périodes prolongées de temps pour étudier les signaux neurones et le contrôle de leurs actions de la cible. En utilisant une préparation de tête isolée, nous avons mesuré la cinématique des mouvements oculaires chez les tortues, et leur modulation par des signaux électriques portés par les nerfs crâniens. Après que le cerveau a été supprimé sur le crâne, laissant les nerfs crâniens intact, la tête disséquée a été placée dans un cardan pour calibrer les mouvements des yeux. Électrodes de verre étaient attachés aux nerfs crâniens (oculomoteur, trochléen et abducens) et stimulés par des courants d’évoquer les mouvements des yeux. Nous avons suivi les mouvements des yeux avec une vidéo infrarouge suivi système et quantifiées rotations des yeux. Les impulsions de courant avec une gamme des amplitudes, des fréquences, et durées de train ont été utilisées pour observer les effets sur les réponses. Parce que la préparation est séparée par le cerveau, la voie efférente va cibles musculaires peut être examinée isolément pour étudier la signalisation neuronale en l’absence d’informations sensorielles centralement traitées.

La figure 1 illustre les alambics d’images tirées d’une vidéo décrivant la dissection. Images fournissent des endroits typiquement des nerfs avant la Coupe du cerveau.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56864/56864fig1.jpg"> Figure 1 : Stills d’images capturées à partir de la vidéo de la dissection pour montrer les emplacements du nerf optique (nII), nerf oculomote...

Ce protocole décrit comment utiliser une in vitro isolé tortue préparation tête pour mesurer la cinématique des mouvements de leurs yeux. Après l’ablation du cerveau de la boîte crânienne, nerfs crâniens peut être stimulées par des courants de quantifier les rotations de le œil et les changements dans la taille de la pupille.

Cinématique oculaire mesurée In Vitro la stimulation des nerfs crâniens de la tortue

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

L’objectif global de ce protocole électrophysiologique est de permettre de mesurer la cinématique des mouvements oculaires de la tortue à oreilles rouges à l’aide d’une préparation de tête isolée in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine oculo-moteur, telles que l’évolution de la vision chez les tortues. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas d’entraîner les animaux à suivre les cibles et utilise un cardan pour calibrer leurs mouvements oculaires.La démonstration de cette technique est assurée par Steven Nesbit, un étudiant de premier cycle dans mon laboratoire. Commencez par la tête de tortue dans un plat de dissection. Ayez suffisamment de solution de baguage de tortue à portée de main pour irriguer les tissus.Maintenez le tissu à quatre degrés Celsius en plaçant de la glace autour de l’extérieur du plat. Placez une sonde de dissection émoussée dans la bouche pour faciliter la manipulation de la tête. Ensuite, tout en travaillant sous un microscope de dissection, coupez l’articulation reliant l’os dentaire au crâne avec le scalpel.Ensuite, utilisez des rongeurs pour éloigner la mâchoire inférieure du crâne. Ensuite, retirez la peau et les muscles de leurs attaches dans les régions dorsale et latérale du crâne. Après avoir identifié la colonne vertébrale à l’extrémité du cavum du crâne, pliez la colonne vertébrale ventralement pour exposer la moelle épinière et utilisez des micro-ciseaux pour couper la moelle épinière.Utilisez des rongeurs pour retirer la colonne vertébrale et d’autres tissus du crâne en tirant vers la queue. Ensuite, faites deux incisions superficielles sur le crâne dorsal en commençant par le foramen magnum et retirez soigneusement le crâne dorsal. Utilisez des micro-ciseaux pour retirer les méninges et exposer le reste du cerveau.Retirez suffisamment de méninges pour permettre l’identification des bulbes olfactifs dans la cavité crânienne antérieure. Continuez à irriguer le cerveau avec une solution de bague de tortue si nécessaire. Ensuite, utilisez des pinces incurvées pour tirer doucement le cerveau vers la caudale et produire une légère tension sur les nerfs crâniens.Coupez soigneusement et retirez les bulbes olfactifs et le cerveau à l’aide d’une pince incurvée. Ensuite, utilisez des micro-ciseaux pour pousser doucement le mésencéphale vers la ligne médiane et exposer les nerfs crâniens. Le nerf crânien trois peut être vu devant le nerf crânien quatre.Le diamètre du nerf quatre est légèrement inférieur à celui du nerf trois. Coupez ensuite les trajets gauche et droit du nerf optique, ou nerf crânien deux. Coupez les nerfs trois et quatre où ils s’attachent au mésencéphale.Répétez cette opération de l’autre côté. Inclinez le tronc cérébral d’un côté et observez le nerf crânien six, le nerf abducens, émergeant de la surface ventrale près de la jonction du pont et de la moelle. Coupez le nerf crânien six du côté gauche et du côté droit.Retirez les parties restantes du tronc cérébral de la tête à l’aide d’une pince fine et de micro-ciseaux. Une fois le crâne vide, examinez le plancher de la cavité crânienne et identifiez les nerfs trois, quatre et six. Enfin, retirez les paupières supérieures et inférieures à l’aide d’une pince fine et de micro-ciseaux.Placez la tête de tortue dans le mandrin à cardan. Utilisez ensuite un petit niveau à bulle pour vérifier que la surface dorsale de la tête est parallèle à l’horizon. Positionnez l’un des yeux au centre des rotations horizontales et verticales du cardan.Inclinez une caméra infrarouge à 45 degrés au-dessus de la ligne de visée de l’œil. La LED infrarouge doit être à la position 11 heures, lorsque vous regardez l’objectif de la caméra, pour centrer la LED le long de l’accès optique de l’œil. Ajustez la distance de la caméra par rapport à l’œil afin que la vue de la caméra soit remplie au maximum par le globe oculaire.Assurez-vous que les coins de l’œil se trouvent sur les bords de la vue horizontale. Faites la mise au point de l’appareil photo pour obtenir une image claire de l’œil. Utilisez ensuite les trois degrés de réglage linéaire fournis avec le cardan pour positionner finement l’œil au centre de la vue de la caméra.Détectez la pupille du conduit en réglant le seuil et le contraste de manière appropriée à l’aide du programme fourni avec le système de suivi oculaire basé sur la vidéo. À l’aide de la souris, cliquez sur le menu Vidéo, et sous Mode, sélectionnez Haute précision pour capturer des images à une fréquence d’échantillonnage de 30 hertz, donnant une résolution de 640 pixels par 480 lignes. De plus, sous Vidéo, ouvrez Type de pupille, puis sélectionnez Pupille sombre et Ellipse, ellipse pivotée, pour la méthode de segmentation de la pupille.Dans la fenêtre EyeCamera, cliquez sur l’icône de réglage de la zone de recherche de la pupille. Utilisez la souris pour faire glisser un rectangle qui limite une zone autour de la pupille, en évitant les zones sombres qui pourraient être confondues avec la pupille. Ensuite, dans la fenêtre Commandes, vérifiez que les cases AutoImage et Suivi du seuil de verrouillage positif sont cochées.Cliquez sur AutoThreshold pour optimiser la densité de numérisation, qui s’affichera sous forme de points verts sur la pupille sombre. Calibrez l’affichage vidéo du programme de suivi oculaire basé sur la vidéo en fonction des rotations du cardan et calibrez la rotation en torsion comme décrit dans le texte. Placez une règle dans le même plan focal que la pupille et enregistrez la largeur de la vue complète de la caméra.Pour positionner les électrodes, insérez d’abord une électrode de référence dans le tissu conjonctif ou musculaire restant sur la tête. Adaptez la taille du nerf à stimuler à un embout en verre capillaire poli au feu et placez l’embout en verre sur l’électrode d’aspiration. Remplissez l’électrode d’aspiration avec la solution de la sonnerie et ajustez le volume à l’intérieur de la seringue à environ la moitié de sa capacité.Assurez-vous que les nerfs crâniens sont clairement visibles. Ensuite, tout en regardant à travers une lunette de dissection montée sur perche, utilisez le micro-manipulateur pour déplacer soigneusement la pointe en verre de l’électrode vers une position au-dessus de l’extrémité coupée du nerf sélectionné et sous la surface de la solution de sonnerie qui remplit le crâne. Tirez sur le piston de la seringue.Le vide attirera le nerf à l’extrémité de la pointe capillaire. Connectez l’électrode d’aspiration au dispositif d’isolation de courant à l’aide d’un câble. Connectez le fil de l’électrode de référence de la broche à la connexion à la terre du dispositif d’isolation.Utilisez les cadrans et les interrupteurs du stimulateur et du dispositif d’isolation pour saisir les paramètres de stimulation. Utilisez une gamme de courants de un à 100 microampères, avec une fréquence de 10 à 400 hertz. Utilisez des impulsions d’une ou deux millisecondes dans des trains de 100, 500, 1000 millisecondes.Pour visualiser le calendrier des applications en cours et leur influence sur les mouvements oculaires, cliquez sur le menu PenPlots. Sélectionnez Position du regard X, Position du regard Y, Torsion et Largeur de la pupille pour afficher les données brutes en temps réel sur les positions des yeux x et y, la torsion et la largeur de la pupille. Sélectionnez également les secondes et les marqueurs dans le menu Tracés pour afficher le tracé de synchronisation avec des graduations, qui apparaissent à des intervalles d’une seconde.Pour vous aider à suivre le type de courants appliqués, cliquez sur le menu Windows et sélectionnez DataPad. La fenêtre KeyPad, DataMarker apparaîtra. Cliquez sur la lettre ou le chiffre pour identifier les paramètres des stimulations actuelles délivrées au nerf et analysez les données comme décrit dans le texte du protocole.Cette trace montre le diamètre moyen de la pupille à partir de six stimulations en une seule préparation, les lignes pointillées montrent l’écart-type. La forme d’onde rectangulaire sur l’axe des x indique le début et le décalage d’un train de 100 hertz d’impulsions d’une milliseconde, avec une amplitude de 50 microampères. Ce croquis montre l’orientation de la ligne de l’iris dans l’œil avant la stimulation.Cette image montre une image fixe d’un essai représentatif avant stimulation. Cette image montre l’œil pendant la stimulation. Ici, l’œil est visible après la stimulation.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de prendre votre temps pendant la dissection pour adapter la taille de l’électrode d’aspiration à chaque nerf crânien et de placer la tête de manière appropriée dans le cardan. Après ces procédures, d’autres méthodes, comme tester différentes températures ou appliquer des agents pharmacologiques, y compris des analgésiques, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que la façon dont ces facteurs influencent les mouvements oculaires et la capacité de survie des tissus nerveux.

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