Name: Fabrication de Surfaces de verre de qualité optique pour étudier la Fusion des macrophages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez comment transformer du verre non fusogène en surface fusogène pour étudier la fusion des macrophages par microscopie optique. Cette méthode permet l'imagerie en direct et la microscopie à super-résolution.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire de Ugarova et chercheurs au centre de métabolisme et de la biologie vasculaire pour une discussion utile de ce travail. Faust de James tient à exprimer sa gratitude pour les instructeurs du cours de l’European Molecular Biology Laboratory Super résolution microscopie en 2015. Nous tenons à remercier Satya Khuon Janelia pour aide à la préparation de l’échantillon pour LLSM. Au cours de l’examen et le tournage des parties de ce document, James Faust était soutenue par une bourse T32 (5T32DK007569-28). Le composant de feuille de lumière de treillis de ce travail a été soutenu par HHMI et Betty et Gordon Moore Foundation. T.U. est financé par les NIH grant HL63199.

Les procédures qui utilisent des animaux ont été approuvées par les comités d’utilisation à la Mayo Clinic, Campus de recherche Janelia et Arizona State University et animalier.
1. préparer la lamelle couvre-objet nettoyé à l’acide
Remarque : couvercle en verre acheté chez de nombreux fabricants n’est peut-être pas aussi propre comme prévu. Envisager de nettoyage régulièrement des lots de la lamelle couvre-objet avant toute procédure lorsqu’il s’agit de microscopie.
<ol><li>Acheter raideur élevée lamelle couvre-objet. Prenez soin de choisir l’épaisseur appropriée (0,15 ou 0,17 mm). Remarque : Le choix de l’épaisseur de la lamelle couvre-objet dépend de l’objectif de microscope et est inscrite directement sur le barillet de l’objectif.</li>
	<li>Incuber le couvercle en verre à l’acide chlorhydrique 12 M dans une hotte chimique bien aéré pendant 1 h avec sonication (42 kHz, 70 W). Répétez cette étape pour deux fois supplémentaires avec frais 12 M HCl.</li>
	<li>Remplir un bécher distinct d’eau ultrapure et ajouter le couvercle en verre. Laisser agir pendant 5-10 min sous une hotte chimique bien aérée le couvercle en verre. Répéter l’opération dix fois.</li>
	<li>Incuber le couvercle en verre dans l’acétone pure dans une hotte chimique bien aérée pendant 30 min avec la sonication. Répétez cette étape pour deux fois supplémentaires.</li>
	<li>Remplir un bol séparé avec de l’eau ultrapure stérile et ajouter le couvercle en verre. Laisser agir pendant 5-10 min sous une hotte chimique bien aérée le couvercle en verre. Répéter l’opération dix fois.</li>
	<li>Incuber le couvercle en verre 100 % d’alcool éthylique dans une hotte chimique pendant 30 min avec la sonication. Répéter cette étape deux fois. Remarque : La pureté de l’alcool éthylique est importante. Contaminants sous forme de solides dissous sécheront sur le verre et peuvent favoriser la fusion des macrophages.</li>
	<li>Pour le stockage à long terme, placer le couvercle en verre nettoyé à l’acide dans un récipient rempli d’alcool éthylique pur. Vous pouvez également sécher le couvercle en verre avec l’azote gazeux et l’entreposer dans un dessiccateur à vide.</li>
</ol>2. préparation des Surfaces coniques-qualité optique
<ol><li>Dissoudre exempt de DMSO fusion eleve point paraffine dans le toluène ultrapure. Remarque : Les concentrations de Stock sont faites à 10 mg/mL et sont dilué 1:9 dans le toluène ultrapure de faire un 1 mg/mL solution de travail. ATTENTION : Toluène doit être manipulé avec soin comme un tératogène. Disposer du toluène conformément au plan institutionnel hygiène chimique.</li>
	<li>Appliquer la paraffine solution à un verre de couverture nettoyé à l’acide sec de travail à un volume qui recouvre uniformément la surface du verre. Décanter la solution de l’excès et le couvercle en verre avec l’azote gazeux ou d’air à sec. Pour la préparation en vrac, utilisez une coloration conçue pour accueillir le couvercle en verre.</li>
	<li>Polir le couvercle en verre de 3 coups dans l’axe des x et ensuite en 3 coups dans l’axe des y avec un chiffon non pelucheux (voir Table des matières).</li>
	<li>Juste avant que l’expérience est réalisée, lavez le couvercle en verre avec de l’eau ultrapure stérile et ensuite stériliser pendant 15-30 min avec une lumière ultraviolette dans une hotte de sécurité biologique. Vous pouvez également stériliser le couvercle en verre par irradiation gamma ou de l’oxyde d’éthylène.</li>
</ol>3. contenant des hydrocarbures microstructuration composés de confiner la Fusion à prédéterminés régions
<ol><li>Sécher le couvercle en verre nettoyé à l’acide et immobiliser le verre sur une surface plane.</li>
	<li>Avec une pincette, plongez délicatement une grille de finder de microscopie électronique de transmission or dans une solution de travail de la composé d’hydrocarbures. Choisir un composé d’hydrocarbure qui répond à l’objectif final de l’expérience (voir tableau 1). Mèche de solution excès away en tapotant doucement la grille sur un papier filtre et immédiatement placer la grille au centre de la lamelle couvre-objet. Permettre le toluène à sécher pendant 2 min avant de passer à l’étape suivante.</li>
	<li>Assurez-vous que la grille est collée à la vitre en retournant doucement le verre. Si la grille détache Répétez l’étape 3.2 en utilisant un nouveau couvercle en verre. Remarque : Si un plasma cleaner n’est pas disponible, omettre étape 3.4.</li>
	<li>Plasma nettoyer la lamelle couvre-objet de traitement par plasma sous vide. Remarque : La grille de recherche agit comme un masque pour protéger la surface sous-jacente adsorbée aux hydrocarbures à chaîne longue du plasma. Les régions qui sont pas protégées par la grille sont rendues non-fusogène par exposition au plasma. La durée de que la lamelle couvre-objet est exposé au plasma doit être déterminée empiriquement.</li>
	<li>À l’aide de pinces à pointe fine, retirer délicatement la grille de la surface du verre pour exposer la composition.</li>
</ol>4. fabrication de vaisselle en verre bas
<ol><li>Percer un trou circulaire de 6 à 10 mm dans le fond d’un plastique de 35 mm boîte de Pétri avec une mèche d’étape. Remarque : Il est essentiel d’utiliser un foret d’étape pour créer des bords lisses. Si les bords sont trop rude, le couvercle en verre adhère pas à plat sur le fond du plat. Surfaces planes imparfaitement compliquent la microscopie.</li>
	<li>Soigneusement mélanger et dégazer élastomère de silicone selon les instructions du fabricant (p. ex., polydiméthylsiloxane ; PDMS).</li>
	<li>Appliquez une fine couche d’élastomère immédiate juste au bord de (c'est-à-dire, le fait de circonscrire) le trou. Remarque : L’élastomère doit apparaître comme une bande continue quoique mince entourant le trou.</li>
	<li>Appliquer doucement le couvercle en verre coniques (voir section 2), ou le verre couverture sèche nettoyé à l’acide (voir section 1) afin de couvrir le trou entouré d’élastomère pour le plat. Assurez-vous que le couvercle en verre apparaît à ras du fond du plat et s’étend au-delà du diamètre du trou, afin qu’une partie importante de la vitre est en contact avec le plastique. Guérir l’élastomère par cuisson à 50 ° C pendant 2-3 h.</li>
	<li>Si fusogène verre est préféré, UV stérilisent les cellules plat et de la culture conformément aux protocoles standards. Toutefois, si une composition est préférée, passez à l’étape 3.2 pour la préparation de la composition (le plasma de gaz utilisé lors de microstructuration stérilise le plat et fortement couples PDMS au verre).</li>
</ol>5. collecte des Macrophages thioglycolate-induites
<ol><li>Injecter des souris C57BL/6 8 semaines 0,5 ml d’une solution stérile de thioglycolate de Brewer 4 % comme décrit précédemment3,4,6.</li>
	<li>Soixante-douze heures plus tard, euthanasier l’animal selon animalier agréé et utiliser les lignes directrices et recueillir des macrophages par lavage péritonéal avec la solution saline tamponnée au phosphate glacee additionnée de 5 mM de tétrasodium.</li>
	<li>Centrifuger les macrophages à 300 g pendant 3 mn et remettre en suspension dans 1 mL de DMEM:F12 additionné de 15 mM HEPES, 10 % de SVF et 1 % antibiotiques (milieu de culture). Remarque : Les cellules sont ensuite comptés avec un hémocytomètre Neubauer. Les macrophages sont dilués à la concentration appropriée et appliqués sur les surfaces. Le nombre de cellules à appliquer sur une surface donnée doit être examiné attentivement par le chercheur aux fins de la question expérimentale. Consulter les normes connues dans la littérature primaire.</li>
	<li>Après 30 min Lavez les surfaces avec HBSS additionné de 0,1 % de BSA pour enlever les cellules non adhérentes et réinstaller avec milieu de culture fraîche. Remettez les cultures dans l’incubateur (5 % CO2 dans l’air à 37 ° C).</li>
	<li>2 h plus tard, aspirer le milieu et remplacer par le milieu de culture enrichi de 10 ng/mL d’IL-4. Les cellules comme décrit ailleurs4de l’image.</li>
</ol>

<ol><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+induces+foreign+body+giant+cells+from+human+monocytes%2Fmacrophages.+Differential+lymphokine+regulation+of+macrophage+fusion+leads+to+morphological+variants+of+multinucleated+giant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells.</a> Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).</li>
<li>Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mediators+of+macrophage+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mediators of macrophage fusion.</a> Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).</li>
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<li>Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fusogenic+glass+surfaces+that+impart+spatiotemporal+control+over+macrophage+fusion%3A+Direct+visualization+of+multinucleated+giant+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation.</a> Biomaterials. 128, 160-171 (2017).</li>
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<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Fölling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
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<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM%2C+iPALM%2C+and+correlative+iPALM-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Planchon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+three-dimensional+isotropic+imaging+of+living+cells+using+Bessel+beam+plane+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination.</a> Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

La nécessité d’identifier et de développer par la suite les surfaces de verre de qualité optique qui favorisent la fusion des macrophages découlait du fait que, jusqu'à l’étude non publiée récemment directement visualisé la fusion des macrophages dans le cadre de vie des spécimens3, 4. Cela est dû au fait que fusogène surfaces plastiques qui sont couramment utilisés nécessitent objectifs GDL et sont en grande partie limitées à l’optique de contraste de phase. Ce...

La formation de MSG accompagne un certain nombre d’états pathologiques dans le corps humain se distingue par une inflammation chronique1. Malgré l’accord qui les macrophages mononucléés se fusionnent pour former MSG2, étonnamment peu d’études ont montré de fusion dans le contexte de vie des spécimens de3,4. C’est parce que les surfaces de verre propre qui sont requis pour la plupart des techniques d’imagerie ne favorisent pas la fusion des macrophages quand induit par des cytokines inflammatoires5. En effet, si le verre propre est utilisé comme substrat pour la fusion des macrophages, puis faible aux objectifs intermédiaires de grossissement (c.-à-d., X 10-20) et plus de 15 h de continu imagerie doivent souvent d’observer un événement unique fusion.
Sur l’autre main, les surfaces en plastique coniques (p. ex., permanox) ou plastique qualité bactériologique promouvoir fusion2. Toutefois, l’imagerie par le biais de plastique est problématique car le substrat est épais et disperse la lumière. Ce qui complique l’imagerie depuis longtemps des objectifs de distance (LWD) de travail sont nécessaires. Toutefois, les objectifs de GDL ont habituellement basse lumière rassemblant la capacité par rapport à leurs homologues de la lamelle couvre-objet-corrigé. En outre, techniques qui exploitent des changements dans la polarité de la lumière passant à travers l’échantillon comme le contraste interférentiel différentiel sont impossibles, car le plastique est biréfringent. Les obstacles liés à l’utilisation de plastique sont encore soulignées par le fait qu’il est impossible de prédire où formation fusion/MGC macrophage se produira sur la surface. Ensemble, ces restrictions limitent la visualisation de la fusion des macrophages à l’optique de contraste de phase, étendue des durées d’imagerie totales (> 15 heures consécutives) et en basse résolution.
Récemment, nous avons identifié une surface de verre hautement fusogène tout en menant la microscopie seule molécule Super-résolution avec macrophages fixes/MSG4. Cette observation a été surprenant parce que nettoyer le verre surfaces promouvoir fusion au très faible taux de ~ 5 % après 24 h en présence de l’interleukine-4 (IL-4), tel que déterminé par la fusion de l’index4. Nous avons constaté que la capacité à promouvoir la fusion était due à la contamination de l’olΘamide. Adsorption d’olΘamide ou d’autres composés contenant de la même façon les hydrocarbures à chaîne longue fait le verre coniques. La plupart fusogène composé (paraffine) a été MICROIMPRIMEES, et il donnait un haut degré de contrôle spatio-temporelle sur fusion des macrophages et une augmentation de 2 fois le nombre d’événements de fusion observée dans le même laps de temps par rapport à permanox. Ces surfaces de qualité optique a fourni le premier coup de œil sur les caractéristiques morphologiques et cinétique qui régissent la formation des MSG dans les spécimens vivants.
Dans ce protocole, nous décrivons la fabrication d’une variété de surfaces de verre qui peut être utilisé pour suivre la formation de MSG de spécimens vivants. En outre, nous montrons que ces surfaces soient prêtent à des techniques de champ lointain Super-résolution. Fabrication de surface dépend de l’objectif de l’expérience, et chaque surface est décrite avec des exemples dans le texte de la procédure.

<table><tbody><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PCD-32G</td><td></td></tr><tr><td>Grille de recherche</td><td>Microscopie électronique sciences</td><td>G400F1-Au</td><td>n’importe quelle grille TEM dorée fonctionnera</td></tr><tr><td>Verre de couverture (22x22 mm)</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>n’utilise que du verre de couverture à haute résistance</td></tr><tr><td>Cire de paroftine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17310</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16415</td><td>doit être exempt d’alpha ;-tocophérol s’il est substitué</td></tr><tr><td>Oléamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O2136</td><td>préparer frais</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Toluène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR International</td><td>BDH1101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Éthanol Microscopie électronique sciences</td><td>15050</td><td>utiliser faiblement dissous solides éthanol</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212</td><td>à utiliser pour laver à l’acide le verre de couverture</td></tr><tr><td>Slyguard 184</td><td>VWR International</td><td>102092-312</td><td>mélanger dans un rapport de 1:10 et durcir à 50 &deg ; C pour 4 h</td></tr><tr><td>35 mm boîte de Pétri</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-351864</td><td></td></tr><tr><td>Dumont n° 5 pince</td><td>Microscopie électronique sciences</td><td>72705</td><td>idéale pour retirer la grille TEM dans la section 3.5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>DMEM :F12</td><td>Corning</td><td>10-092</td><td>contient 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576</td><td>utilisation à 0,1 % dans HBSS pour laver les macrophages non adhérents</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Genscript</td><td>Z02996</td><td>aliquote à 10 &mu ; g/mL et conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>utilisation pour des échantillons fixes ou des techniques qui ne nécessitent pas d’agents de contraste</td></tr><tr><td>souris eGFP-LifeAct</td><td>n/a n</td><td>/a</td><td>utilisation pour l’imagerie par fluorescence vivante</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark&nbsp ;</td><td>34155</td><td>Utilisation pour polir les surfaces adsorbées d’hydrocarbures</td></tr></tbody></table>

fabrication de surfaces de verre de qualité optique pour étudier la fusion des macrophages

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualisation de la formation de cellules géantes multinucléées (MSG) de spécimens vivants a été difficile due au fait que plus les techniques d’imagerie live nécessitent de propagation de la lumière à travers le verre, mais sur verre fusion des macrophages est un événement rare. Ce protocole présente la fabrication de plusieurs surfaces de verre de qualité optique où adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue transforme verre en une surface coniques. Tout d’abord, la préparation des surfaces de verre propre comme matériau pour la modification de la surface de départ est décrite. En second lieu, une méthode est fournie pour l’adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue pour convertir les non-coniques verre en un substrat coniques. Troisièmement, ce protocole décrit fabrication de surface micropatterns qui favorisent un degré élevé de maîtrise spatio-temporelle de formation MGC. Enfin, la fabrication de vaisselle en verre bas est décrite. Des exemples d’utilisation de ce système de cellules in vitro comme modèle pour étudier la fusion des macrophages et formation MGC sont montrés.

Les paramètres physico-chimiques de matériaux ont des effets dramatiques sur l’étendue des macrophages fusion7,8,9,10. En outre, contaminants de surface sont connus pour favoriser des macrophages fusion11. Par conséquent, il est important de commencer par nettoyer lamelle couvre-objet comme témoin négatif pour la fusion des macrophages. N...

Ce protocole décrit la fabrication de surfaces de verre de qualité optique adsorbé avec des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue qui peuvent être utilisés pour surveiller la fusion des macrophages de spécimens vivants et permet de microscopie de Super-résolution d’échantillons fixés .

Fabrication de Surfaces de verre de qualité optique pour étudier la Fusion des macrophages

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

L’objectif global de ce protocole est de transformer le verre de couverture non fusogène en une surface fusogène qui peut être utilisée pour étudier la fusion des macrophages à l’aide de n’importe quelle forme de microscopie optique. Cette méthode peut aider à répondre aux questions fondamentales liées au mécanisme moléculaire de la fusion des macrophages. Le principal avantage de cette procédure est que toute technique de microscope, en particulier l’imagerie en direct, peut être utilisée pour étudier la fusion des macrophages.James Faust, troisième boursier, et Arnat Balabiyev, un étudiant diplômé de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, dans une hotte chimique bien ventilée, incubez du verre de couverture à haute résistance dans de l’acide chlorhydrique 12 molaires avec sonication pendant une heure. Répétez l’étape deux fois de plus avec du HCL 12 molaires frais.Remplissez un bécher séparé avec de l’eau ultra-pure et ajoutez le verre de protection. Ensuite, sonicez le verre de protection pendant cinq à 10 minutes. Ensuite, incubez le verre de couverture dans de l’acétone pure pendant 30 minutes avec sonication.Répétez l’étape deux fois de plus. Remplissez ensuite un bécher séparé avec de l’eau ultrapure stérile et ajoutez le verre de protection. Sonicez le verre de protection pendant cinq à 10 minutes.Incuber le verre de protection dans de l’alcool éthylique à 100 % pendant 30 minutes avec sonication. Répétez cette étape deux fois de plus. Pour un stockage à long terme, placez le verre de couverture nettoyé à l’acide dans un récipient contenant de l’alcool éthylique pur.Vous pouvez également sécher le verre de protection avec de l’azote gazeux et le stocker dans un dessiccateur sous vide. Dissoudre de la cire de paraffine à point de fusion élevé sans DMSO dans du toluène ultrapur. À l’aide d’une pipette en verre, appliquez suffisamment de solution de travail de paraffine sur un verre de couverture nettoyé à l’acide sec pour recouvrir uniformément la surface du verre.Décantez l’excès de solution et, avec de l’azote gazeux ou de l’air, séchez le verre de protection. Avec une lingette non pelucheuse, polissez la vitre de protection en utilisant trois coups le long de l’axe X, puis trois coups le long de l’axe Y. Immédiatement avant la réalisation de l’expérience, utilisez de l’eau ultrapure stérile pour laver le verre de protection, puis stérilisez-le à la lumière ultraviolette dans une cagoule de sécurité biologique pendant 15 à 30 minutes.Séchez le verre de couverture nettoyé à l’acide et immobilisez le verre sur une surface plane. À l’aide d’une pince, immergez soigneusement une grille de recherche de microscopie électronique à transmission d’or dans une solution de travail d’un composé d’hydrocarbures. Évacuez l’excès de solution en tapotant doucement la grille sur du papier filtre, puis placez immédiatement la grille au centre du verre de protection.Laissez le toluène sécher pendant deux minutes. Assurez-vous que la grille est collée au verre en inversant doucement le verre. Si la grille se détache, répétez le collage à l’aide d’un nouveau verre de protection lavé à l’acide.Après avoir retiré la grille TEM, examinez la continuité du micro-motif avec un faible grossissement. Le micro-motif doit apparaître continu, mais le matériau ne doit pas s’étendre au-delà des marges du motif. Ensuite, utilisez un nettoyeur plasma avec du plasma à gaz sous vide pour nettoyer la vitre de protection conformément au protocole de texte.Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, retirez soigneusement la grille de la surface du verre pour exposer le micro-motif. À l’aide d’un foret étagé, percez un trou circulaire de six à 10 millimètres avec des bords lisses au fond d’une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres. Mélangez et dégazez soigneusement l’élastomère de silicium selon les instructions du fabricant.Appliquez une fine couche d’élastomère juste à proximité du bord du trou dans la boîte de Pétri. L’élastomère doit apparaître comme une fine bande continue entourant le trou. Appliquez délicatement un verre de protection fusogène ou nettoyé à l’acide sec sur le plat afin de couvrir le trou entouré d’élastomère.Assurez-vous que le verre de couverture apparaît au ras du fond du plat et s’étend au-delà du diamètre du trou afin qu’une partie substantielle du verre soit en contact avec le plastique. Durcissez l’élastomère en le cuisant à 50 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Injectez à des souris C57 black-6 âgées de huit semaines 0,5 millilitres d’une solution stérile de thioglycolate de bière à 4 %, comme indiqué dans le protocole de texte.72 heures plus tard, après avoir euthanasié l’animal conformément aux directives approuvées en matière de soins et d’utilisation des animaux, prélever les macrophages par lavage interpéritonéal à l’aide de PBS glacé complété par de l’EDTA de cinq millimolaires. Centrifugez les macrophages à 300 fois G pendant trois minutes et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de DMEM/F-12 complété par 15 tas millimolaires de 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques. Après avoir compté et dilué les cellules et les avoir appliquées sur les surfaces pendant 30 minutes, utilisez HBSS 0,1 % BSA pour laver les surfaces et remplacer le milieu de culture.Remettez ensuite les cultures dans l’incubateur. Deux heures plus tard, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu de culture complété par 10 nanogrammes par millilitre d’IL4 avant d’imager les cellules. Lorsqu’il est nettoyé comme décrit dans cette vidéo, le verre de protection est exceptionnellement plat sans caractéristiques de surface évidentes ; tandis que l’absorption d’hydrocarbures à longue chaîne suivie d’un polissage de surface crée un degré de nanotopographie observé ici.Sur les surfaces en verre de couverture propres, les macrophages fusionnent à un taux très faible. En revanche, après 24 heures en présence d’IL4, les macrophages appliqués sur des surfaces adsorbées avec des composés contenant des hydrocarbures à longue chaîne subissent une fusion robuste. De plus, l’absorption du solvant seule ne fait pas du verre une surface fusogène.Ici, la pleine largeur à mi-maximum, ou FWHM, de structures inférieures à la limite de diffraction du microscope optique est utilisée pour évaluer quantitativement les différences de potentiel de résolution. Il est important de noter qu’il n’y a pas de différence apparente dans le FWHM des billes fluorescentes de 100 nanomètres entre les différentes surfaces, ce qui suggère que les caractéristiques du verre requises pour l’imagerie par fluorescence ont été suffisamment préservées. Dans cette expérience, des macrophages ont été appliqués sur les surfaces contenant des hydrocarbures à longue chaîne.Ensuite, une forme de microscopie à super-résolution appelée microscopie de reconstruction optique stochastique directe 3D a été réalisée. Ces vidéos démontrent qu’une variété de techniques d’imagerie en direct sont réalisables lorsque des macrophages sont appliqués sur les surfaces. Une fois maîtrisé, modifier le verre pour rendre la surface fusogène peut se faire en une demi-heure si c’est bien fait.Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de ne pas oublier de la suivre attentivement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la microscopie à fluorescence, peuvent être effectuées afin d’obtenir des vues de fusion avec un contraste spécifique à la molécule. Cela permettra des expériences conçues pour identifier les protéines directement impliquées au moment de la fusion.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour acquérir des vues résolues dans le temps de la fusion des macrophages. À l’avenir, cela nous aidera à mieux comprendre le mécanisme de fusion des macrophages. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de modifier le verre de protection pour étudier la fusion des macrophages.N’oubliez pas que travailler avec de l’acide et du toluène peut être extrêmement dangereux, et qu’un EPI et une ventilation appropriée doivent toujours être utilisés lors de l’exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

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Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

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