Name: Haut débit, l’absolue détermination de la teneur d’une protéine sélectionnée aux niveaux de tissus en utilisant Quantitative Dot Blot Analysis (QDB) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Apprenez la quantification absolue de protéines par analyse quantitative dot blot (QDB) dans les tissus de souris. Cette méthode simple et à haut débit permet de mesurer précisément les biomarqueurs comme CAPG.

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Ce travail est soutenu par Taishan érudits Construction Engineering (G.T.), le Shandong Excellent Young Scientist Award (ZR2016JL026 à G. T.), National Fondation sciences naturelles de Chine (31771284, 3167070448 et 81641108), Shandong naturelles provinciales Fondation de la science (ZR2016JL026, 2017GSF18103)-sciences provinciale Shandong et technologie Plan (J14LE01 et J15LK03), plan(2015ZH083) de science et technologie Yantai et Binzhou médicale Université scientifique fonds de recherche (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), le Conseil de recherche suédois accorder 621-2011-4423 et 2015-4870. Ce travail est également parrainé par « Yantai Double cent talents Plan » et « Yantai Hi-Tech Zone océan Talent Plan bleu ».

Toutes les procédures d’animaux ont été réalisées conformément aux Directive de Binzhou Medical University Animal Use et approuvés par la Commission d’examen éthique de l’Université de médecine de Binzhou.
1. préparation de l’échantillon
<ol><li>Prendre le tissu de souris 50 mg dans un Tube de 1,5 mL. Ajouter 200 µL de tampon de lyse (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, EGTA, 5 mM 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1 % X-100 Triton, 10 % de glycérol), complétée avec les inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase (100 mM NaF, 0,1 mM phénylméthylsulfonyle fluorure, 5 µg/mL pepstatine, 10 µg/mL leupeptine, aprotinine 5 µg/mL).</li>
	<li>Homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur pendant 1 min sur la glace.</li>
	<li>Centrifugation pendant 10 min à de 8 000 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Recueillir le liquide surnageant dans des tubes neufs (1,5 mL) et retirer 1 µL pour dosage concentration protéique avec kit de BCA. Remarque : Tous les tampons de lyse couramment utilisés pour l’analyse par western blot et Dot blot analyse peuvent être utilisés pour l’analyse QDB.</li>
</ol>2. déterminer la spécificité des anticorps
<ol><li>Préparer les lysates de sample (20 µg) à la section 1.4, IgG BSA gratuit (20 µg), protéine standard (600 pages), pour analyse par western blot. Remarque : IgG BSA libre est utilisé comme contrôle négatif et la protéine standard est utilisée comme témoin positif. La spécificité de l’anticorps est démontrée en montrant une bande de bonne taille à l’aide de l’analyse par western blot.</li>
</ol>3. définir la gamme de linéarité de l’analyse QDB
<ol><li>Dissoudre la protéine standard avec FD2O. diluer la protéine à une concentration de 1 200 pg/µL.</li>
	<li>Diluer le concentré de protéine de l’échantillons préparés dans la section 1.4 à 4 µg/µL.</li>
	<li>Dissoudre la BSA avec FD2O. diluer la protéine à une concentration de 1 200 pg/µL à 4 µg/µL.</li>
	<li>Une série de dilution de protéines standard et échantillons préparés ont été préparés avec l’aide du tableau 1 et tableau 2.</li>
	<li>Mix 10 µL dilution standard protéines ou dilution préparé échantillons et 10 µL 2 x tampon de chargement (120 millimètres Tris-HCl pH 6,8, 20 % glycérol, SDS de 4 %, 0,2 % bleu de bromophénol, 200 mM DTT) ensemble.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/µl)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µl)</td>
			<td>S3 (100pg/µl)</td>
			<td>S3 (300pg/µl)</td>
			<td>S5 (600pg/µl)</td>
			<td>S6 (1200pg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protein(1200pg/µl) standard</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12,5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG BSA gratuit (4pg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45,83</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Système de dilution pour les courbe standard de protéines.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg/µl)</td>
			<td>X2 (0,25 / µl)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µl)</td>
			<td>X4 (1µg/µl)</td>
			<td>X5 (2 µg/µl)</td>
			<td>X6 (4 µg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µL)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12,5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG BSA(4µg/µl) gratuit</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43,75</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 2. Système de dilution des échantillons préparés
<ol start="6"><li>Faire chauffer le mélange à 85 ° C pendant 5 min.</li>
</ol>4. processus d’analyse QDB
<ol><li>
Exemple d’application
	<ol>
<li>Soutenir la plaque QDB pour éviter le fond de la plaque de touche la surface de la table. Par exemple, utiliser une boîte de pointe de pipette vide comme support.</li>
		<li>Charger jusqu'à 2 µL de l’échantillon au centre de la membrane au bas de l’unité individuelle de la plaque QDB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sécher la plaque
	<ol>
<li>Laisser la plaque QDB chargée pendant 1 h à la salle tempérée (RT) ou en guise d’alternative, laisser la plaque chargée à 37 ° C pendant 15 min dans un endroit bien aéré.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La plaque de blocage
	<ol>
<li>Trempez la plaque QDB dans le tampon de transfert (0,039 M Glycine, 0,048 M Tris, 0,37 % SDS, 20 % d’alcool méthylique) et secouez légèrement la plaque pendant 10 s.</li>
		<li>Rincez la plaque QDB doucement avec un mélange TBST (Tris-buffered saline, 0,1 % Tween 20) trois fois et puis laver la plaque pendant 5 min dans un mélange TBST sous agitation constante.</li>
		<li>Bloquer la plaque QDB avec un tampon de blocage (5 % de lait dans un mélange TBST (100 µL/puits) pendant 1 h sous agitation constante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubation des anticorps primaires
	<ol>
<li>Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de blocage à une concentration choisie (à partir de 1:500 à 1:5 000) et ajouter 100 µL à chaque puits individuels d’une plaque bien 96 ordinaire. Insérer la plaque QDB dans la plaque 96 puits et incuber les boîtes combinées soit pendant 2 h à ta ou toute la nuit à 4 ° C sous agitation constante.</li>
		<li>Vous pouvez également placer la plaque QDB à l’intérieur d’une boîte et remplir la boîte avec un tampon de blocage 2 à 3 mm au-dessus de la portion de la membrane de la plaque si le même anticorps est utilisé pour une plaque entière. Ajoutez l’anticorps primaire à la concentration choisie et incuber la plaque soit pendant 2 h à ta ou toute la nuit à 4 ° C par sous agitation constante.</li>
		<li>Rincez la plaque délicatement avec un mélange TBST pendant trois fois avant il est lavé avec un mélange TBST pour trois fois, chaque fois pendant 5 min sous agitation constante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubation d’anticorps secondaire
	<ol>
<li>Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration choisie (à partir de 1:1, 000 à 01:50, 000) et chaque aliquote 100 µL/puits dans une plaque 96 puits ou dans une boîte comme décrit à la section 4.4.2 et puis incuber la plaque QDB à l’intérieur soit l’APL bien 96 chargé te ou la boîte pendant 1 h à RT sous agitation constante.</li>
		<li>Rincez la plaque QDB doucement 3 fois avec un mélange TBST, puis laver la plaque de 3 fois, 5 min chacun avec un mélange TBST sous agitation constante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantification
	<ol>
<li>Préparer le substrat chimiluminescence améliorée (ECL) en suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Substrat de ECL aliquote dans un 96 plaque puits (100 µL/puits) et insérer la plaque QDB à l’intérieur de la plaque 96 puits pendant 2 min sous agitation constante.</li>
		<li>Retirez la plaque QDB de la 96 puit plaque et agiter brièvement pour enlever l’excès de liquide. Placez la plaque sur une plaque de microtitration blanc.</li>
		<li>Allumez le lecteur de microplaques et sélectionnez « plaque avec couvercle » sur l’interface utilisateur avant de placer les plaques combinées (QDB plate + adaptateur de plaque blanche) dans le lecteur de microplaque pour la quantification. Remarque : Assurez-vous d’utiliser la plaque de microtitration blanc, opaque comme un adaptateur pour éviter toute interférence de la plaque. Assurez-vous de choisir « plaque avec couvercle » afin d’éviter le blocage de la machine lorsqu’il est combiné plaques (adaptateur, QDB plaque + 96 plaque puits) sont placées dans le lecteur de microplaques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li>
<li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29.+Quantitative+assay+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22G.+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li>
<li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen%2C+immunoglobulin+G%2C+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li>
<li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li>
<li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+array%3A+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li>
<li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot+blot+analysis+%28QDB%29%2C+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang et Jiandi Zhang sont des employés de Zestern Biotechniques qui produit des plaques QDB utilisées dans cet Article. WenFeng Zhang et Yunyun Zhang déclarent les conflits d’intérêts et Jiandi Zhang a déposé des demandes de brevet. Les autres ne réclamer aucun intérêts opposés.

Parmi tous les test immunologique disponible les techniques actuelles d’analyse des protéines sauf ELISA, analyse QDB est la seule méthode pour obtenir la teneur absolue d’une protéine spécifique aux niveaux cellulaire et tissulaire dans un format haut débit. Bien que stable isotope-étiqueté standard, spectrométrie de masse est en mesure de réaliser une quantification absolue de quelques protéines, cette méthode n’est pas encore conçue pour des performances haut débit. Dans cette étude, nous avons démontré le processus d’analyse QDB pour atteindre la détermination absolue du niveau de protéine du GPAW en tissus de souris, y compris les reins, la rate et la prostate. CAPG s’observait entre 200 à 360 pg/g dans les tissus de rein de souris, 460 à 650 pg/g de rates de souris et 330 à 390 pg/g dans les tissus de la prostate souris.
Par rapport à l’ELISA, analyse QDB nécessite des efforts minimales pour être développé dans un laboratoire régulier. Tout d’abord, la plaque QDB est basée sur une membrane de nitrocellulose pour éliminer l’étape de revêtement en ELISA. Deuxièmement, analyse QDB exige seulement un au lieu de deux anticorps spécifiques dans un sandwich ELISA. Troisièmement, la capacité de liaison haute de membrane de nitrocellulose par rapport à la surface de la plaque ELISA permet aussi la membrane supporter les étapes de lavage rigoureux généralement utilisés dans l’analyse d’immunoblot pour réduire les parasites de fond. Cette fonctionnalité est très utile dans l’analyse compliquées lysats préparés à partir de cellules et de tissus. En revanche, en raison de la capacité de liaison relativement faible des plaques ELISA, la réduction de l’arrière-plan lors de l’analyse des lysats cellulaires et tissulaires compliqués devient un véritable défi dans le processus de développement.
Analyse QDB peut être adopté facilement dans n’importe quel laboratoire avec l’accès d’un anticorps spécifique. Cependant, il est important de mentionner que la spécificité de l’anticorps est un terme relatif, limité par des facteurs incluant les espèces, les types de tissus et types de cellules. Comme le montre la Figure 1A, CAPG anticorps est spécifique lors de l’analyse de lysat de la prostate, rate et le rein de souris et devient encore non spécifiques lors de l’analyse de foie de souris. En effet, on retrouve régulièrement un anticorps à être spécifiques d’un tissu type, mais pas toujours spécifique à l’autre type de tissu de la même espèce. Ainsi, immunobuvardage préalable est nécessaire pour assurer la spécificité de l’analyse QDB. En effet, la relative spécificité de l’anticorps peut être la cause de faux résultats, souvent liées à l’analyse d’ELISA, comme n’importe quel effort de l’entreprise de fabrication peut avoir passé afin d’assurer la spécificité de l’essai, ils ne peuvent pas épuiser tous les possibles types d’échantillons, les utilisateurs peuvent choisir d’analyser à l’aide de leurs produits d’ELISA.
Comme avec tous les tests immunologiques, un problème potentiel avec la méthode d’analyse QDB est le manque d’uniformité de la qualité de l’anticorps commerciaux. Même si la qualité apparente d’un anticorps de la même compagnie (même Catalogue numéro, etc.) est utilisé, il pourrait y avoir des différences importantes d’un achat à l’autre en raison de la variabilité de lot. Par conséquent, sauf si est atteint la pleine confiance dans la qualité de l’anticorps disponibles, re-qualifier l’anticorps lors de chaque achat est important.
En résumé, nous fournissons ici un protocole détaillé et un exemple lorsque vous utilisez la méthode d’analyse QDB pour atteindre absolue détermination quantitative d’une protéine spécifique au niveau des tissus. Nous montrons que la méthode d’analyse QDB est un outil pratique pour quiconque s’intéresse à haut débit, l’analyse quantitative par immunotransfert. Sa capacité à atteindre l’absolue détermination de la teneur d’une protéine spécifique au niveau cellulaire et tissulaire distingue aussi cette technique d’immunoblot traditionnelles techniques. Cette fonctionnalité permet la combinaison et la comparaison des résultats d’analyses multiples, une étape nécessaire surtout dans les grandes études de population et la réalisation des études d’association pertinents au niveau de la protéine dans un proche avenir.

Aux côtés d’avec les avancements passionnants en recherche en génomique dans les dernières années, le domaine de la recherche biomédicale témoins aussi l’avancement significatif dans la recherche de la protéomique. Avec l’augmentation de l’accumulation de données biologiques à la fois génomiques et protéomiques, utilisant des outils bioinformatiques pour analyser ces données est devenue le centre de recherche biomédicale à l’avenir perceptible. Par conséquent, le succès de la recherche bioinformatical déclenche la demande de nombre et de meilleure qualité des données de la communauté de la recherche biologique et biomédicale, une tâche ne peut être atteint que grâce à l’avancement de la technique à la génomique et protéomique.
Spectrométrie de masse (SM) et l’analyse par immunotransfert sont actuellement deux techniques dominantes de l’analyse des protéines. MS a dominé la recherche protéomique dans les dernières années pour permettre l’analyse de milliers de protéines individuelles en même temps. Les techniques basées sur immunoblot, y compris la tache occidentale et la dot blot, d’autre part, ont également joué un rôle important dans la recherche de protéines même depuis son invention1,2,3,4, 5. Enzymatique immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 et inversion de phase protéine microarray (RPPM)8,9 peut être considéré comme le format haut débit d’immunoblot analyse. Cependant, toutes ces méthodes de dosage immunologique, sauf ELISA, mesurent le niveau de l’expression relative d’une protéine spécifique. Le caractère relatif de ces méthodes va devenir un véritable problème pour les études de population, comme l’analyse doit se faire en même temps, empêchant tout effort visant à augmenter la taille de la piscine au moyen d’analyses multiples. En outre, les résultats provenant de ces études ne sont semi-quantitatifs, ce qui complique toute tentative de bio-informatique dans l’analyse des données. Pendant ce temps, bien qu’ELISA est bien adaptée pour l’analyse des échantillons de protéines absolu à haut débit, cette technique semble relever des défis dans des environnements complexes tels que les cellules ou tissus en raison de sa capacité de fixation faible et le multiplexage,10.
Nous avons développé une méthode d’immunoblot adaptée aux études sur la population ayant les caractéristiques principales d’être pratique, haut débit, quantitatif et adapté à la détermination absolue de la teneur en protéines et nommé cette technique quantitative point de tache analyse (QDB)11. Dans cette étude, nous présenter un protocole détaillé pour QDB analyse et illustrent la méthode de détermination de la teneur en protéines absolue d’une protéine spécifique, CAPG, dans trois tissus de souris différents, y compris les reins, la rate et la prostate. Nous pensons que ce protocole détaillé illustre bien la faisabilité et la commodité de cette méthode et fournir des conseils sur comment éviter les pièges potentiels dans la pratique de cette méthode.

<table><tbody><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Tecan</td><td>Tecan Infinite 200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Plaque QDB</td><td>Yantai Zestern Co.Ltd</td><td></td><td>Les plaques sont disponibles sur demande à des fins de vérification, soit par e-mail ou en visitant www.zestern.net.</td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td><td>jackson</td><td>&nbsp ; 711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Substrat de chimiluminescence amélioré</td><td>Thermo</td><td>32134</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-CAPG&nbsp ;</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-T52</td><td></td></tr><tr><td>Protéine CAPG</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-HNAE</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td><td>10461220</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl2</td><td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20120802</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>BNN1913</td><td></td></tr><tr><td>Na2P2O7</td><td>Haituo Test de médecine chinoise</td><td>20160914</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>pepstatine</td><td>Sigma</td><td>Z290033</td><td></td></tr><tr><td>leupeptine</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A3428</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hcl</td><td>Sigma</td><td>T6455</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de Bromphénol</td><td>Sigma</td><td>B-0126</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr></tbody></table>

haut débit, l’absolue détermination de la teneur d’une protéine sélectionnée aux niveaux de tissus en utilisant quantitative dot blot analysis (qdb)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Faute d’une commode, méthode immunoblot quantitative, haut débit pour la détermination absolue de la teneur d’une protéine spécifique au niveau cellulaire et tissulaire entrave considérablement les progrès dans la recherche de la protéomique. Résultats provenant de techniques d’immunotransfert actuellement disponibles sont également relatifs, empêchant tout effort visant à combiner les études indépendantes avec une analyse à grande échelle des échantillons de protéines. Dans cette étude, nous montrons le processus de l’analyse quantitative dot tache (QDB) pour réaliser une quantification absolue dans un format haut débit. À l’aide d’un niveau de protéine disponibles dans le commerce, nous sommes en mesure de déterminer la teneur absolue du plafonnement protéines actine, la gelsoline ressemblant (CAPG) dans des échantillons de protéines préparées à partir de trois tissus de souris différents (rein, rate et la prostate), ainsi qu’un détail explication des détails expérimentaux. Nous vous proposons l’analyse QDB comme une méthode d’immunoblot commode, quantitative, haut débit de quantification absolue de protéines individuelles au niveau cellulaire et tissulaire. Cette méthode facilitera considérablement le biomarqueur validation et vérification de la voie dans les différents domaines de la recherche biologique et biomédicale.

La détermination de la quantité absolue d’une protéine dont la protéine GPAW en tissu souris nécessite un anticorps spécifique tant une protéine purifiée en standard. La gamme de linéarité des analyses de la protéine étalon et les lysats doit également être établi avant toute analyse à grande échelle. La gamme de linéarité de l’anticorps est fortement tributaire de l’anticorps en soi, et la gamme de dilution appropriée d’anticorps spécifique doivent être vérifiées par chaque utilisateur individuel.
Nous avons d’abord déterminé la spécificité de l’anticorps du GPAW en rein de souris, tissus de rate et de la prostate par analyse par western blot avec le contrôle négatif (IgG gratuit BSA) et le contrôle positif (protéine du GPAW disponible dans le commerce) (Figure 1A). L’anticorps anti-GPAW était spécifique contre les lysats de rate de souris, coeur, muscle et prostate (une seule bande détectée). Bandes non spécifiques ont été observées dans les lysats du rein et du foie. Toutefois, dans le rein lysat, les bandes non spécifiques ont été significativement plus faibles que la bande spécifique, ce qui suggère que l’anticorps est adapté à l’analyse de tissus rénaux. Ensuite, la gamme de linéarité de la protéine étalon et de la quantité de lysats d’analyses ont été déterminées par deux courbes dose côte à côte. Une protéine CAPG disponible dans le commerce a été diluée en série comme indiqué au tableau 1 basée sur nos expériences passées et les lysats de tissus du rein souris, la rate et la prostate ont été dilués également basé sur la quantité de protéines totales dans les lysats déterminés par un kit de dosage de protéines totales BCA. Deux études de dose a eu lieu à côté et complotés ensemble dans la Figure 1B. La quantité appropriée de lysats de rein de souris, de rate et de la prostate ont été choisis en fonction des signaux QDB mesurées par le lecteur de microplaque en unité arbitraire. La leçon primitive de cette expérience est illustrée dans le tableau 3.
Dans la dernière étape, la norme de protéine GPAW en série diluée et les lysats de rein de souris, la rate et la prostate ont été chargés sur la plaque de QDB. Dans ce cas, nous avons choisi de charge 0,3 µg/échantillon de lysats de rein de souris et de la rate et 1 µg/échantillon de lysats d’analyse de souris de la prostate, comme à ces niveaux, la lecture de QDB prit fin au moins 20 fois le fond bien dans la gamme linéaire de l’analyse basé sur la courbe de dose de la protéine étalon et les lysats. La plaque a été soumise au protocole QDB décrit avant que la plaque a été quantifiée directement par le lecteur de microplaques. À l’aide de la protéine en série diluée de CAPG purifiée, nous pourrions établir une courbe dose-réponse, l’équation et R2 par analyse de régression simple à l’aide de logiciels disponibles (par exemple, Microsoft office excel). Le QDB signaux de lysats des reins de souris, de rate et la prostate ont été convertie à la quantité absolue de protéine du GPAW en ces lysats en utilisant l’équation établie, et les résultats ont été corrigés par la quantité de protéines totales, dans ce cas, 0,3 microgramme de lysats de rates de souris et les reins et 1 microgramme de lysats de prostates de souris, pour la concentration finale de protéine du GPAW dans ces tissus pg/µg. Les résultats sont présentés dans la Figure 1C avec la leçon primitive montrée tableau 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> Figure 1 . Résultat représentatif d’une analyse QDB pour déterminer les niveaux absolus du GPAW en trois tissus de souris (rein, la rate et la prostate). A. examinant la spécificité des anticorps anti-CAPG de lapin à l’aide de la souris les lysats de tissus préparés à partir de rate, coeur, Muscle, rein, foie et la Prostate à l’aide occidentale tache analyse avec le contrôle négatif (IgG gratuit BSA) et le contrôle positif (dans le commerce protéine du GPAW disponible). B. définir les analyses de gamme linéaire de QDB des anticorps anti-CAPG de lapin à l’aide de lysats préparés à partir de la prostate, rein, rate et à l’aide de purifié recombinant protein CAPG standard. Les résultats ont été réanalysés en moyenne. C. la détermination absolue des niveaux du GPAW dans les lysats préparés à partir de la prostate, rate et les reins de souris. Chaque barre représente un tissu d’une souris individuelle. Les résultats ont été la moyenne des trois exemplaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> Tableau 3 : Résultent de lecteur de microplaques des études dose utilisant à la fois dilués en série, lysats de mise en commun des rates de souris, reins et de la prostate et protéine recombinante purifiée de CAPG.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
Tableau 4 : Résultat du lecteur de microplaques de l’analyse QDB du niveau absolu CAPG dans les reins de souris (8), rate (4) et de la prostate (5) en utilisant une protéine recombinante du GPAW en standard.

Nous démontrons un processus détaillé de l’analyse quantitative dot tache (QDB) par détermination de la teneur absolue d’une protéine ciblée, plafonnement protéines actine, gelsoline-like (CAPG), dans trois tissus de souris différente. Nous démontrons un haut débit, la technique d’immunoblot commode, quantitative pour validation des biomarqueurs au niveau cellulaire et tissulaire.

Haut débit, l’absolue détermination de la teneur d’une protéine sélectionnée aux niveaux de tissus en utilisant Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Cette méthode peut être appelée ELISA au niveau tissulaire pour se démarquer de la quantification semi-quantitative relative traditionnelle de la teneur en protéines aux niveaux cellulaire et tissulaire qui est actuellement la norme dans les laboratoires de recherche et dans le domaine du diagnostic clinique. Les principaux avantages de cette technique peuvent être décrits en trois mots : haut débit, quantitatif et absolu. Si nous devions ajouter un autre mot, ce serait simple.Les implications de cette technique s’étendent au domaine de la protéomique, tandis que la vérification des biomarqueurs peut être réalisée à haut débit. Cette méthode a de nombreuses applications dans la recherche et le domaine clinique. La quantification de la quantité de protéines aux niveaux cellulaire et tissulaire est encore primitive à l’heure actuelle.D’une manière générale, les personnes novices dans cette méthode ne rencontreront aucun problème à apprendre cette technique et elle est assez basique et nécessite un minimum de compétences en laboratoire. Nous sommes ravis de démontrer la fiabilité, la simplicité et la précision de la technique en utilisant le modèle animal. Les échantillons peuvent être préparés avec n’importe quelle méthode traditionnelle de préparation d’échantillons en utilisant tous les tampons de lyse couramment utilisés dans le laboratoire de recherche avec ou sans détergent comme le MP40 ou le Triton X.In notre cas, nous utilisons le tampon de lyse Triton X.Placez une tranche de tissu de cinq à 100 milligrammes dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse complété par des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Ensuite, homogénéisez le tissu avec un homogénéisateur pendant une minute sur de la glace.Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 10 minutes à 8 000 fois g à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes et prélever un microlitre pour mesurer la quantité totale de protéines dans le lysat de protéines à l’aide d’un kit de détermination des protéines tel qu’un test BCA. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius puis mesurer l’absorbance à 562 nanomètres sur un lecteur de microplaques.Dans cette étape, en utilisant une protéine recombinante dont la concentration est connue comme étalon, diluez la protéine à une concentration de 12 000 picogrammes par microlitre sous forme de solution mère. Pendant ce temps, diluez les lysats de l’échantillon préparé à quatre microgrammes par microlitre. Pour obtenir des résultats plus fiables, nous vous recommandons d’utiliser un mélange de lysats d’échantillons afin d’éviter toute différence entre les échantillons individuels.Diluez en série à la fois la protéine standard et les échantillons préparés pour une étude de dose typique. La BSA a été complétée pour garantir des quantités à peu près égales de protéines chargées pour chaque échantillon. Après cela, mélangez 10 microlitres de protéines standard diluées en série ou des lysats d’échantillon avec 10 microlitres de tampon de chargement 2X.Ensuite, chauffez le mélange à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Dans cette procédure, placez une boîte d’embout de pipette vide sous la plaque QDB pour éviter que le bas de la plaque ne touche la surface de la table. Chargez jusqu’à deux microlitres de l’échantillon au centre de la membrane au bas d’une unité individuelle de la plaque QDB.Ne laissez jamais le bas de la plaque QDB toucher une surface pendant le chargement et ne chargez pas trop pour un puits individuel. D’après notre expérience, pas plus de quatre microlitres par puits. Ensuite, laissez la plaque QDB chargée pendant une heure à température ambiante ou laissez la plaque chargée à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un espace bien ventilé.Pour bloquer la plaque, trempez la plaque QDB dans le tampon de transfert et secouez-la doucement pendant 10 secondes. Après cela, rincez doucement la plaque QDB avec du TBST trois fois, puis lavez la plaque pendant cinq minutes dans du TBST en secouant constamment. Par la suite, bloquez la plaque QDB avec un tampon de blocage pendant une heure en secouant constamment.Maintenant, diluez l’anticorps primaire dans le tampon de blocage à une concentration choisie et ajoutez-en 100 microlitres dans chaque puits individuel d’une plaque ordinaire de 96 puits. Insérez la plaque QDB dans la plaque à 96 puits et incubez les plaques combinées pendant deux heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius en secouant constamment. Après cela, rincez doucement la plaque avec du TBST trois fois avant de la laver avec du TBST trois fois à chaque fois pendant cinq minutes en secouant constamment.Ensuite, diluez l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration choisie et aliquote 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque à 96 puits. Ensuite, incubez la plaque QDB à l’intérieur de la plaque chargée de 96 puits pendant une heure à température ambiante sous agitation constante. Rincez doucement la plaque QDB trois fois avec du TBST, puis lavez la plaque trois fois cinq minutes chacune avec du TBST en secouant constamment.Pour la quantification, préparez le substrat ECL et aliquotez-le dans une plaque de 96 puits à 100 microlitres par puits. Insérez ensuite la plaque QDB à l’intérieur de la plaque à 96 puits pendant deux minutes en secouant constamment. Après cela, retirez la plaque QDB de la plaque à 96 puits et secouez brièvement pour éliminer l’excès de liquide.Ensuite, placez la plaque sur une plaque de microtitration blanche. Ensuite, allumez le lecteur de microplaques et sélectionnez la plaque avec le couvercle sur l’interface utilisateur avant de placer les plaques combinées à l’intérieur du lecteur de microplaques pour la quantification. Assurez-vous de choisir la plaque avec couvercle pour éviter les erreurs.Cette figure montre la spécificité de l’anticorps anti-CAPG de lapin à l’aide de lysats de tissu de souris préparés à partir de la rate, du cœur, des muscles, des reins, du foie et de la prostate avec analyse par transfert Western. La gamme linéaire de l’analyse QDB des anticorps anti-CAPG de lapin à l’aide de lysats préparés à partir de la prostate, des reins, de la rate et à l’aide d’un étalon de protéine CAPG recombinant purifié a été définie. Les résultats ont été une moyenne de triplets.Et c’est ici que l’on voit la détermination absolue des niveaux de CAPG dans les lysats préparés à partir de reins, de rates et de prostate de souris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à 24 heures si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un anticorps spécifique prédéterminé pour l’ensemble de la procédure.Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse biostatistique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires qui ne peuvent être obtenues que par une mesure absolue des teneurs en protéines individuelles au niveau cellulaire ou tissulaire. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche en protéomique pour explorer la relation présumée des biomarqueurs protéiques avec diverses maladies au niveau de la population. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse QDB au format haut débit.N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains ou animaux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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