Haut débit, l’absolue détermination de la teneur d’une protéine sélectionnée aux niveaux de tissus en utilisant Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Cette méthode peut être appelée ELISA au niveau tissulaire pour se démarquer de la quantification semi-quantitative relative traditionnelle de la teneur en protéines aux niveaux cellulaire et tissulaire qui est actuellement la norme dans les laboratoires de recherche et dans le domaine du diagnostic clinique. Les principaux avantages de cette technique peuvent être décrits en trois mots : haut débit, quantitatif et absolu. Si nous devions ajouter un autre mot, ce serait simple.

Les implications de cette technique s’étendent au domaine de la protéomique, tandis que la vérification des biomarqueurs peut être réalisée à haut débit. Cette méthode a de nombreuses applications dans la recherche et le domaine clinique. La quantification de la quantité de protéines aux niveaux cellulaire et tissulaire est encore primitive à l’heure actuelle.

D’une manière générale, les personnes novices dans cette méthode ne rencontreront aucun problème à apprendre cette technique et elle est assez basique et nécessite un minimum de compétences en laboratoire. Nous sommes ravis de démontrer la fiabilité, la simplicité et la précision de la technique en utilisant le modèle animal. Les échantillons peuvent être préparés avec n’importe quelle méthode traditionnelle de préparation d’échantillons en utilisant tous les tampons de lyse couramment utilisés dans le laboratoire de recherche avec ou sans détergent comme le MP40 ou le Triton X.In notre cas, nous utilisons le tampon de lyse Triton X.

Placez une tranche de tissu de cinq à 100 milligrammes dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse complété par des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Ensuite, homogénéisez le tissu avec un homogénéisateur pendant une minute sur de la glace.

Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 10 minutes à 8 000 fois g à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes et prélever un microlitre pour mesurer la quantité totale de protéines dans le lysat de protéines à l’aide d’un kit de détermination des protéines tel qu’un test BCA. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius puis mesurer l’absorbance à 562 nanomètres sur un lecteur de microplaques.

Dans cette étape, en utilisant une protéine recombinante dont la concentration est connue comme étalon, diluez la protéine à une concentration de 12 000 picogrammes par microlitre sous forme de solution mère. Pendant ce temps, diluez les lysats de l’échantillon préparé à quatre microgrammes par microlitre. Pour obtenir des résultats plus fiables, nous vous recommandons d’utiliser un mélange de lysats d’échantillons afin d’éviter toute différence entre les échantillons individuels.

Diluez en série à la fois la protéine standard et les échantillons préparés pour une étude de dose typique. La BSA a été complétée pour garantir des quantités à peu près égales de protéines chargées pour chaque échantillon. Après cela, mélangez 10 microlitres de protéines standard diluées en série ou des lysats d’échantillon avec 10 microlitres de tampon de chargement 2X.

Ensuite, chauffez le mélange à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Dans cette procédure, placez une boîte d’embout de pipette vide sous la plaque QDB pour éviter que le bas de la plaque ne touche la surface de la table. Chargez jusqu’à deux microlitres de l’échantillon au centre de la membrane au bas d’une unité individuelle de la plaque QDB.

Ne laissez jamais le bas de la plaque QDB toucher une surface pendant le chargement et ne chargez pas trop pour un puits individuel. D’après notre expérience, pas plus de quatre microlitres par puits. Ensuite, laissez la plaque QDB chargée pendant une heure à température ambiante ou laissez la plaque chargée à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un espace bien ventilé.

Pour bloquer la plaque, trempez la plaque QDB dans le tampon de transfert et secouez-la doucement pendant 10 secondes. Après cela, rincez doucement la plaque QDB avec du TBST trois fois, puis lavez la plaque pendant cinq minutes dans du TBST en secouant constamment. Par la suite, bloquez la plaque QDB avec un tampon de blocage pendant une heure en secouant constamment.

Maintenant, diluez l’anticorps primaire dans le tampon de blocage à une concentration choisie et ajoutez-en 100 microlitres dans chaque puits individuel d’une plaque ordinaire de 96 puits. Insérez la plaque QDB dans la plaque à 96 puits et incubez les plaques combinées pendant deux heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius en secouant constamment. Après cela, rincez doucement la plaque avec du TBST trois fois avant de la laver avec du TBST trois fois à chaque fois pendant cinq minutes en secouant constamment.

Ensuite, diluez l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration choisie et aliquote 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque à 96 puits. Ensuite, incubez la plaque QDB à l’intérieur de la plaque chargée de 96 puits pendant une heure à température ambiante sous agitation constante. Rincez doucement la plaque QDB trois fois avec du TBST, puis lavez la plaque trois fois cinq minutes chacune avec du TBST en secouant constamment.

Pour la quantification, préparez le substrat ECL et aliquotez-le dans une plaque de 96 puits à 100 microlitres par puits. Insérez ensuite la plaque QDB à l’intérieur de la plaque à 96 puits pendant deux minutes en secouant constamment. Après cela, retirez la plaque QDB de la plaque à 96 puits et secouez brièvement pour éliminer l’excès de liquide.

Ensuite, placez la plaque sur une plaque de microtitration blanche. Ensuite, allumez le lecteur de microplaques et sélectionnez la plaque avec le couvercle sur l’interface utilisateur avant de placer les plaques combinées à l’intérieur du lecteur de microplaques pour la quantification. Assurez-vous de choisir la plaque avec couvercle pour éviter les erreurs.

Cette figure montre la spécificité de l’anticorps anti-CAPG de lapin à l’aide de lysats de tissu de souris préparés à partir de la rate, du cœur, des muscles, des reins, du foie et de la prostate avec analyse par transfert Western. La gamme linéaire de l’analyse QDB des anticorps anti-CAPG de lapin à l’aide de lysats préparés à partir de la prostate, des reins, de la rate et à l’aide d’un étalon de protéine CAPG recombinant purifié a été définie. Les résultats ont été une moyenne de triplets.

Et c’est ici que l’on voit la détermination absolue des niveaux de CAPG dans les lysats préparés à partir de reins, de rates et de prostate de souris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à 24 heures si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un anticorps spécifique prédéterminé pour l’ensemble de la procédure.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse biostatistique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires qui ne peuvent être obtenues que par une mesure absolue des teneurs en protéines individuelles au niveau cellulaire ou tissulaire. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche en protéomique pour explorer la relation présumée des biomarqueurs protéiques avec diverses maladies au niveau de la population. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse QDB au format haut débit.

N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains ou animaux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.