Protocole de différenciation cérébelleux 3D simplifiée avec Modification 2D facultative
9 décembre 2017
Nous décrivons un support de protocole de hPSCs, à l’aide de défini différenciation 3D simplifié et réduit les facteurs de croissance, capables de produire des agrégats cellulaires avec les premières structures neuroépithéliales et positifs pour les marqueurs associés à cervelet, ainsi qu’une option Modification 2D afin de différencier les cellules comme une monocouche pour générer des neurones fonctionnels.
L’objectif global de ces cultures de différenciation est de générer des lignées cellulaires cérébelleuses dans des environnements 2D ou 3D. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions fondamentales concernant les nouveaux développements ou les mécanismes pathologiques sous-jacents aux troubles cérébraux infantiles en utilisant des cellules souches dérivées de patients. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a un démarrage et une maintenance simples avec peu de facteurs et qu’elle peut être utilisée comme base pour tester des protocoles neuronaux plus complexes. La démonstration de la procédure sera faite par Lisa, une technicienne de mon laboratoire. Pour mettre en place la différenciation avec la méthode G modifiée de passage des hPSC, transférez le volume requis de milieu de maintenance neurale dans un tube stérile et complétez avec 4 nanogrammes par millilitre de FGF2 et dix inhibiteurs de roche micromolaires. Ensuite, conservez le tube moyen à température ambiante ou au bain-marie à 37
Aperçu
Cet article présente un protocole simplifié de différenciation en 3D des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) utilisant un milieu défini et des facteurs de croissance réduits. Ce protocole permet de générer des agrégats cellulaires présentant des structures neuroépithéliales précoces ainsi que des marqueurs associés au développement cérébelleux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie des cellules souches
- Différenciation cellulaire
Contexte
- La compréhension des lignées cellulaires du cervelet est essentielle pour l'étude des troubles cérébraux de l'enfance.
- Les cellules souches dérivées de patients peuvent fournir des informations sur les mécanismes des maladies.
- Le protocole vise à simplifier le processus de différenciation.
- Il permet des environnements de culture en 2D et en 3D.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode simple pour générer des types cellulaires cérébelleux.
- Faciliter la recherche sur les troubles cérébraux de l'enfance.
- Fournir une base pour des protocoles de différenciation neuronale plus complexes.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un milieu de maintien neural défini.
- Supplémentation avec le FGF2 et un inhibiteur de la ROCK.
- Culture des cellules souches pluripotentes humaines en formats 2D et 3D.
- Surveillance de la différenciation vers les lignées cérébelleuses.
Résultats principaux
- Génération réussie d'agrégats cellulaires présentant des structures neuroépithéliales.
- Expression de marqueurs associés au cervelet dans les cellules différenciées.
- Mise en évidence de la simplicité et de l'efficacité du protocole.
- Potentiel d'applications ultérieures dans des études neuronales complexes.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour la différenciation cérébelleuse.
- Il peut être adapté à diverses applications de recherche en neurosciences.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette base pour des recherches neuronales avancées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole simplifié de différenciation cérébelleuse réduit la complexité et le coût liés à la génération de lignées cérébelleuses dérivées de cellules souches pluripotentes humaines, soutenant ainsi la validation précoce des cibles dans la recherche sur les troubles cérébraux de l'enfance. En minimisant les facteurs de polarisation extrinsèques, il diminue le risque de phénomènes pathologiques interférant dans les modèles de cellules souches pluripotentes humaines, renforçant ainsi la fiabilité prédictive lors de la détection préclinique des cibles thérapeutiques. La flexibilité offerte par le format double en 2D/3D permet un développement d'essais à grande échelle et un alignement des biomarqueurs translationnels tout au long des flux de travail de découverte.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques cérébelleuses à l'aide de cellules souches dérivées de patients afin de clarifier les mécanismes de la maladie.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'ambiguïté mécanistique en simplifiant la différenciation grâce à l'utilisation de moins de facteurs extrinsèques pouvant masquer les phénotypes.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des données quantitatives sur l'expression de marqueurs associés au cervelet et sur l'entrée de calcium, utiles pour le criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests, tant en format adhérent 2D qu'en format tridimensionnel (3D) en suspension.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit des modèles cellulaires pertinents pour l'étude des maladies, comportant des structures semblables au bourrelet rhombique et aux zones ventriculaires, pour la validation préclinique.
- Valeur opérationnelle : Permet des décisions d'avancement ajustées au risque grâce à une génération reproductible et évolutive de neurones cérébelleux.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis le test d'hypothèses sur la cible jusqu'à l'identification de composés candidats, en soutenant la génération de lignées cérébelleuses pour le criblage mécanistique et la découverte de biomarqueurs.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques et la réduction des risques biologiques lors de la validation précoce des cibles cérébelleuses.
- Criblage : Fournit des sorties quantitatives prêtes à l'essai, incluant l'expression des marqueurs et le flux calcique fonctionnel, pour l'évaluation des composés.
- Analytique : Permet l'analyse comparative de l'efficacité de la différenciation et de la maturation neuronale dans différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité du stade de découverte au stade préclinique par la production de neurones cérébelleux pertinents pour la maladie.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une plateforme de base adaptable pour tester des protocoles simplifiés de différenciation neuronale dans divers projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive accrue dans la validation des cibles grâce à une réduction du bruit phénotypique et à une fidélité améliorée du modèle.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, efficacité en coûts et évolutivité dans les systèmes de culture 2D et 3D.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'aller/arrêt en réduisant les risques biologiques tardifs dans les programmes ciblant le cervelet.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles cérébelleuses en utilisant des modèles de maladies fiables et évolutifs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches et des compétences en formulation de milieux définis.
- Dépend de l'accès à l'infrastructure requise pour le FGF2, l'inhibiteur de ROCK et le milieu de maintenance neuronal.
- Implique une standardisation interéquipes pour une exécution cohérente des formats 2D et 3D.
- Implique des ajustements lors du passage des cultures en monocouche à des agrégats de type organoïde.
- Est limité par la nécessité de tests de validation fonctionnelle allant au-delà de l'expression des marqueurs pour confirmer la maturité neuronale.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
0:44
3D "Organoid" Differentiation
4:32
Alternative 2D Differentiation Culture
8:28
Results: 3D Products Exhibit Markers and Structures of Early Neuroepithelium, and 2D Products Exhibit Cerebellar Markers and Functional Neuronal Activity
9:48
Conclusion
