Name: Protocole de différenciation cérébelleux 3D simplifiée avec Modification 2D facultative (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Apprenez une méthode simplifiée de différenciation cérébelleuse 3D utilisant des cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole permet de générer des lignées cellulaires cérébelleuses pour étudier les troubles cérébraux infantiles.

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Nous sommes reconnaissants envers Gerbren Jacobs et Jurjen Broeke pour leur aide technique d’experts, Prisca Leferink pour contribuer à la génération et la caractérisation de deux lignes de commande iPSC et de Lisa Gasparotto pour démontrer nos procédures.

<ol><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li>
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<li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li>
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<li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6%2C+Tbr2%2C+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Complexité et les coûts sont des facteurs pertinents pour les chercheurs de cellules souches lorsque choisir ou élaborer des protocoles de différenciation. Cela est particulièrement vrai, car c’est une question ouverte du degré de contrôle externe est nécessaire pour générer des types de cellules désiré, ou — il poser différemment — comment hPSCs compétentes sont à produire leur propre environnement de développement, si laissés à eux-mêmes avec suffisamment éléments nutritifs. Introduction de facteurs extrinsèques in vitro peut produire très bien produits cellule désirée, mais ils pourraient aussi interférer avec les capacités de développement intrinsèques des cellules seraient ont exposés en vivo. Ces considérations sont importantes, surtout si l’objectif est utilisation de dérivés de patient CISP pour la modélisation de la maladie. Utilisation extensive des patrons ou des facteurs de croissance pourrait masquer les phénotypes de la maladie. Les protocoles détaillés dans le présent rapport suivent la tendance des études antérieures pour réduire la complexité, coût, ou l’utilisation de motifs extrinsèques facteurs8,9.
Selon les résultats fournis par Bertin et al. et notre propre étude récente, il semble qu’il est possible d’atteindre la différenciation vers cérébelleux destins sans efforts concertés visant à reproduire des conditions in vivo , comme les études antérieures ont fait 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. la partie intéressante est que les deux études utilisé différents ensembles de facteurs de croissance, ce qui suggère que ni ensemble était nécessaire, bien que les deux utilisés FGF2. Nous avons effectué des tests supplémentaires, où FGFs ont été sélectivement exclus du protocole et a montré que les cellules sont capables de générer les mêmes produits sans extrinsèque FGFs10. Différences entre nos études ont été qualifiés par le fait que nous avons utilisé des lignes de hPSC différents et des méthodes de culture, induit la différenciation neuronale avec RA et comprenaient des éléments étayant la survie des cellules granule et maturation (BDNF, GDNF, SAG et le KCL)11 –14. En outre, une méthode de démarrage moins complexe, comparée à Bertin et al., a été employée. Leur protocole a commencé en générant EBs uniforme en 96WPs, qui eux isolés physiquement et chimiquement les uns des autres. Le protocole ici a tous les PSC relativement entassés dans 6WPs lors de la formation EB, qui leur a permis d’interagir librement. Comment cela peut avoir affectées différemment l’environnement physique et chimique de l’EBs et organoïdes plus tard (y compris la production intrinsèque des composés de signalisation) sont inconnue et pourraient être explorées. Aussi, tandis que nous montrons l’expression des gènes associés — et si évocatrice de — origine cérébelleuse, situé au sein de structures morphologiquement similaires à ceux rapportés par Bertin et al., nous ne pouvons exclure génération neuronale-comme des structures qui sont d’identité non-cérébelleux. Des études futures, à l’aide d’un large panel d’anticorps comme ceux signalés par Bertin et al. (c.-à-d., ATOH1, CALB, etc.) rendrait ces affectations et comparer entre les produits de ces deux protocoles, plus concluantes.
Au sein du protocole 3D, il est important pour commencer et maintenir un nombre suffisant de cellules en culture pour assurer un nombre suffisant de produits finis pour l’analyse. Compte tenu des importantes mortalités massives tôt dans le protocole, nous recommande de commencer avec plus de 500 EBs/puits pendant les 3 premiers jours en culture (Figure 1). Cela ne devrait pas être difficile d’atteindre des tailles de colonie donnée pour hPSCs en culture sans chargeur, mais peut-être pas aussi facile pour ceux qui utilisent encore des méthodes axées sur le conducteur. Étant donné le grand nombre de cellules, il est important de regarder pour le changement de couleur dans un milieu (indiquer les changements de pH) et l’accumulation de cellules mortes. Les deux doivent être corrigées pour éviter l’effondrement de la culture. Il peut y avoir également agglutination des cellules et des agrégats en structures massives. Même s’il peut encore entraîner les agrégats qui peuvent être analysés, quantité de produit sera grandement réduite, afin de les briser en petits agrégats avec trituration douce peut être utile. Toutefois, éviter des agrégats normaux inquiétantes, qui eux-mêmes peuvent se développer de grandes tailles (Figure 4). Si agrégats deviennent trop clairsemées, il est recommandé de combiner les puits pour que les agrégats ne sont pas complètement isolés. Variabilité du produit (en nombre, la taille et la morphologie) est un problème bien connu dans la culture cellulaire 3D, y compris pour les protocoles à partir isolé, uniforme pas formation de EB, suggérant qu’une procédure de démarrage moins complexe (tels que le protocole décrit ici ) pourrait être plus pratique de8,15. Alors que cette hétérogénéité est quelque chose que les chercheurs doivent garder à l’esprit, en particulier pendant l’analyse, le protocole déclaré générée produits conformes à ceux trouvés dans d’autres protocoles 3D8,9,15. Basé sur la taille et la morphologie, ils entraient dans le cadre de rosette neuronaux à organoïde cérébrale, comme décrit dans une étude récente de15Kelava et Lancaster, le plus souvent mise en place au classement de sphéroïde. Particulièrement remarquables, sont la présence de structures 3D suggestif de rosettes neurales avec lumen, les zones ventriculaires (void) et rhombique-lèvre comme caractéristiques (Figure 5 et Figure 6) tels que définis par d’autres groupes8 , 15 , 16 , 17. étant donné que chaque expérience a produit au moins un agrégat avec putatifs VZ/SVZs et marqueurs associés à cervelet (ZIC1, KIRREL2), ceux sont des critères utiles pour déterminer le succès d’une différenciation 3D à l’aide de notre protocole, avec RL-comme caractéristiques fournit une aide supplémentaire. Prolonger la durée de la culture depuis 35 jours n’a pas testé, mais susceptibles d’être appliquée pour déterminer les limites de la croissance, la complexité et maturité permise par cette technique.
Le protocole 2D utilise la même formation de EB non adhérents et le processus d’induction neurale comme le protocole 3D et donc des observations qui précèdent s’appliquent également. Une fois plaqué, on doit considérer un ensemble différent de considérations. L’EBs devraient adhérer rapidement pour les cellules à proliférer vers l’extérieur sur la plaque. S’il y a des problèmes avec l’adhérence, adjonction de RI (si pas déjà utilisé), réduit le volume de milieu, ou les variations expérimentales de PLO/LAM concentration peuvent être appliquées. Il est important de garder les cellules de plus en plus trop dense ou éparse (préférence cultivé entre confluence de 20 à 80 %) dans les puits ; surveillance quotidienne et passage en temps opportun est important, pour éviter des cellules flottantes ou over-confluence. Contrairement au protocole 3D, il faut éviter une mortalité significative durant la culture, bien qu’il peut y avoir des zones de faible croissance, ou un ralentissement du taux de prolifération. Passage affecte l’état de maturation des cellules (par exemple, suppression des prolongements cellulaires et les réseaux développés entre les cellules) et devrait garder à l’esprit lorsque vous approchez des points où les cellules seront collectées ou analysés en quelque sorte. Par exemple, pour le calcium imaging il est très important de cellules de passage entre 2 à 6 jours avant l’analyse. Passage trop près d’analyse peut signifier les cellules n’ont pas eu le temps de se connecter ou matures et trop loin peuvent entraîner dans les cellules, la surpopulation, ce qui rend difficile l’imagerie. Bien que la variabilité entre les expériences peut-être exister, les résultats concordent avec ceux rapportés dans les premiers protocoles cérébelleux 2D1,2. Analyse d’expression de la coloration et le gène ICC corroborent la présence de cellules positives pour marqueur de cellules de granules ZIC1, tout en identifiant également les marqueurs associés aux autres identités neurones et cérébelleuses (Figure 7 et Figure 8). Imagerie calcique, qui implique la stimulation électrique des cellules incubées avec le colorant de fluor5, a indiqué l’activité neuronale fonctionnelle (Figure 9, supplémentaire Figure 1et la Figure 2), bien qu’il n’est pas confirmé si ces sont des cellules étoilées. On peut soutenir que, en donnant des cellules plus de temps pour mûrir en prolongeant la durée de la culture depuis 35 jours, le montant de l’activité neuronale fonctionnelle devrait augmenter. Ce potentiel pourrait être envisagée à l’avenir.
En plus des voies de recherche proposé ci-dessus, il serait intéressant pour déterminer les différences dans les identités de produit (quantité et qualité) entre les protocoles 2D et 3D. L’importance de la FGF extrinsèque n’a pas été testé dans le protocole de 2D, et il serait utile de savoir si l’absence de structure 3D après ensemencement, et donc les voies de signalisation associés, ferait des cultures 2D plus ou moins dépendantes sur ceux tôt le patterning composés. Des protocoles plus allégées (p. ex., non RA, le BDNF, le SAG) sont tout aussi plausibles lignes pour complément d’enquête. Enfin, les études futures pourraient bénéficier de nouveaux outils de recherche pour mieux caractériser (et évaluer l’efficacité de la production de) sous-types neuronales cérébelleux spécifiques à l’homme.
Avec les mises en garde donnés à l’esprit, ont tous deux signalé protocoles peuvent être utilisés pour les différenciations cérébelleuses, avec produits adaptés à des fins différentes. Elles peuvent servir de point de départ pratique pour les chercheurs qui effectuent des études pilotes, viabilité des lignées cellulaires pour ces différenciations, ou comme un modèle de base pour d’autres types de différenciation neurale ciblée.

In vitro les protocoles permettant de différencier les hPSCs vers les lignées cérébelleuses initialement exploités sur le principe d’imiter en vivo développement cérébelleux1,2,3,4. À ce titre, ils exigeaient une succession de facteurs a présenté à des moments précis pour piloter la maturation et structuration pro-cérébelleux. Parmi ceux-ci étaient WNT, OS protéines morphogénétiques (PGB) et facteurs de croissance fibroblastiques (FGF) avec des rôles connus dans le cerveau Mid-postérieur développement et formation de l’organisateur Isthmiques5,6,7. Bien sûr, chaque étape supplémentaire et le facteur signifie une augmentation des manipulations fastidieuses et une plus grande dépense pour le chercheur, et ainsi développer des protocoles plus simples capables d’atteindre des résultats d’equal est intéressant. Cette question pratique concorde bien avec la question hypothétique, si les cellules ont besoin de ce contrôle serré, externe au cours de leur développement in vitro.
Pour une différenciation cérébelleuse, un protocole publié en 2015 adressée la nécessité d’utiliser un grand nombre de facteurs de croissance en utilisant seulement FGF2, FGF19 et facteur de culture cellulaire stromal 1 (SDF1) pour des fins8le patterning. Cette étude diffère également des protocoles cérébelleux antérieurs, en utilisant un système de culture 3D flottant. En plus de produire des cellules positifs pour les marqueurs cérébelleux, les cerveau « organoïdes » générés par leur technique se sont révélés pièce morphologie pertinente, non disponible dans certaines cultures traditionnelles monocouche 2D, comme rhombiques structures ressemblant à des lèvres. Bien que moins complexe et coûteux en ce qui concerne les facteurs de croissance, autres fonctionnalités telles que la formation de corps embryoïdes uniformes (EBs) et de la culture dans les plaques à 96 puits (96WPs), fait sur le plan procédural complexe au cours des étapes initiales. Un autre protocole 3D publiée la même année, a signalé la différenciation réussie aux lignées neurones à l’aide de commun et peu coûteux de cellule culture techniques9. Bien que ce groupe enquêtait corticaux plutôt que de différenciation cérébelleuse, application de leur concept de différenciation cérébelleuse ne pourrait pas être écartée.
Nous avons récemment rapporté un protocole de différenciation cérébelleux 3D à l’aide d’un nombre réduit de facteurs de structuration (à savoir, FGF2, 4 et 8), ainsi qu’une configuration simplifiée en gardant les cellules en plaques 6 puits (6WPs) tout au long de minimiser les exigences moyennes10. Pour faciliter la production de cellules étoilées, lissé agoniste (SAG) a été utilisé au cours de l’étape finale de la maturation. SAG est une alternative moins chère chimique à sonic hedgehog (SHH), qui avait été utilisée dans les protocoles antérieurs cérébelleux, en raison de son rôle dans la promotion de la croissance de granule cellules précurseurs (BPC) in vivo1,2, 11,12,13. Différenciation des produits étaient conformes à ceux d’autres protocoles 3D, y compris la présence de marqueurs associés à cervelet en structures morphologiquement concernées8,9. Ces résultats renforcent le message précédent qui détaille le mimétisme de l' in vivo environnement est peut-être pas nécessaire pour les protocoles de différenciation complexe 3D in vitro .
Outre le protocole 3D, ce rapport décrit un protocole de 2D, conçu avec la même configuration rapide, matériaux de base et réduit le nombre de facteurs de croissance. Il est capable de produire des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSCs), positifs pour les marqueurs associés à tôt neuronaux, cérébelleux et granule cell identités. En outre, imagerie calcique indique la présence de neurones humains fonctionnels. La possibilité de choisir entre les protocoles, ajoute un niveau de flexibilité pour les chercheurs, pour ceux qui souhaitent soit : (1) génération de cellule spécifique tape, le développement du cerveau humain (2) modélisation et associés structures, (3) l’analyse optimisée en monocouche paramètres (p. ex., enregistrements de patch clamp), ou les interactions cellule-cellule (4) dans des cultures mixtes neurales. Leur nature simple et à faible coût les rend accessible pour les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine de la hPSC, ou besoin de procédures de base hPSC d'où vous pourrez explorer davantage les options de différenciation.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>enrichi en glutamine DMEM/F12</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>milieu neural de base</td></tr><tr><td>Supplément N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B27</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>bêta-mercaptoéthanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poly (méthacrylate de 2-hydroxyéthyle)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>alias Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 milieu et supplément</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC milieu et supplément</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (inhibiteur de ROCK)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Revêtement adhérent adapté hPSC (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0,2 um filtre</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tube Eppendorf</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>wrap pour plaques de culture</td></tr><tr><td></td><td>cryotubes ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>agent de dissociation à base de trypsine</td></tr><tr><td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R& D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé du cerveau</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé des glies</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophique Facteur 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Agoniste lissé (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Microscope Axiovert 40C Microscope</td><td>d’imagerie en fond clair</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imagerie en fond clair - acquisition d’images</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5810</td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipettes sérologiques</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipettes sérologiques</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture 6 puits</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture 12 puits</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>CSEh</td><td>WiCELL</td><td></td><td>ligne H01</td></tr></tbody></table>

protocole de différenciation cérébelleux 3d simplifiée avec modification 2d facultative

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Réduire la complexité et le coût des protocoles de différenciation est important pour les chercheurs. Cet intérêt s’inscrit dans les préoccupations au sujet de possibles effets inattendus que facteurs extrinsèques structuration pourraient introduire dans les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) des modèles de développement du cerveau ou de la physiopathologie, comme masquant le phénotype de la maladie. Nous présentons ici deux protocoles de différenciation cérébelleux pour hPSCs, conçu avec la méthode de démarrage plus simple, moins des facteurs de répétition et moins les exigences matérielles que les protocoles antérieurs. Récemment, nous avons développé les méthodes de culture, qui génèrent flottants 3 Dimensions (3D) produits compatibles avec d’autres protocoles « organoïde » cerveau, y compris les morphologies rhombiques et pertinents à la modélisation de développement du cerveau tels que zone ventriculaire/sub- structures ressemblant à des lèvres. La seconde utilise une procédure de monocouche adhérentes, 2D de différenciation complète, ce qui est montrée capable de générer des neurones cérébraux fonctionnels, comme les produits sont positifs pour les marqueurs associés à cervelet et pièce influx calciques neuron-comme. Ensemble, ces protocoles offrent aux scientifiques un choix d’options adaptées à des fins de recherche différents, mais aussi un modèle de base pour tester d’autres types de différenciation neurale simplifiée.

Aperçu visuel de la réduction de la croissance Factor protocoles de différenciation cérébelleux 2D et 3D La figure 1 montre la chronologie globale pour les protocoles de différenciation cérébelleux 2D et 3D, identification des facteurs extrinsèques et temps du bordé. La progression typique de hPSCs en cours de différenciation cérébelleuse 3D est représentée à la Figure 2: ligne de CSEh H01 à partir des colonies de culture sans chargeur au jour 0 (coin supérieur gauche de la figure) ; en cours de formation de l’EB par jour 2 (moyen supérieur) ; devenant plus grands agrégats cellulaires avec lumen apparente après induction neurale avec RA et FGF8 au jour 14 (en haut à droite) ; formant des agrégats de taille variable et de forme à 28 jours (en bas à gauche) ; développer en complexité avec les différentes structures d’un agrégat unique indiqué au jour 28 (milieu bas) ; et a poursuivi des changements morphologiques aux structures mêmes à jour 35 (en bas à droite). La progression typique de hPSCs en cours de différenciation cérébelleuse 2D est représentée à la Figure 3: des CSEh ligne H01 comme colonies en culture sans chargeur au jour 0 (coin supérieur gauche de la figure, avec cercle indique la zone de cellules différenciées entre les colonies de CSEh) ; en cours de formation de l’EB par jour 2 (moyen supérieur) ; devenant plus grands agrégats cellulaires avec lumen apparente après induction neurale avec RA et FGF8 au jour 13 (en haut à droite) ; la prolifération des cellules adhérentes après ensemencement au jour 14 (en bas à gauche) ; et puis comme une monocouche de cellules avec une morphologie complexe/mature plus à jour 35 sous faible (inférieure au milieu) et fort grossissement (en bas à droite).
Marqueurs d’exposition de produits 3D et les Structures du neuroépithélium précoce Figure 2 (image du bas gauche) et la Figure 4 montre l’hétérogénéité de la morphologie globale 3D vue à travers la mise en culture, en raison de variables de croissance et/ou taux de maturation, ainsi que la fusion stochastique ou breaking apart des agrégats. Malgré l’hétérogénéité, chaque différenciation produit des agrégats présentant des marqueurs précoces de neuronales et neurones, y compris granule cérébelleux marqueur ZIC1, comme indiqué par immunocytochimie (ICC), coloration à la Figure 5. Plus important encore, Figure 5 et Figure 6 donnent à penser qu’une simple culture 3D, avec des facteurs de croissance réduites, est capable de produire des agrégats avec des structures complexes liés au développement du cerveau comme le neuroépithélium précoce et lèvre rhombique.
Les produits 2D pièce marqueurs cérébelleux et l’activité neuronale fonctionnelle Alors que les cultures 2D ne peut pas reproduire des structures 3D complexes, ils sont capables de générer des cellules montrant des marqueurs précoces de neuronales et neurones, y compris de marqueur de cellules de granules cérébelleux ZIC1, comme indiqué par ICC coloration à la Figure 7. Analyse de l’expression génique par RT-PCR, comme on le voit dans la Figure 8, prend en charge les résultats de coloration de ICC, bien que la présence du marqueur précoce de cellules granule ATOH1 est variable entre les expériences et les lignes. Imagerie calcique est géré plus facilement dans la culture 2D. Comme on le voit dans la Figure 9, supplémentaire vidéo 1et 2 vidéo supplémentaire, stimulées électriquement les cellules montrent des influx calciques qui sont typiques des patrons de décharge neuronale, suggérant la génération de neurones fonctionnels.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figure 1 : chronologie du protocole de différenciation (commençant au jour J0 de différenciation). Boîtes de trait plein indiquent quand des facteurs particuliers sont ajoutés au milieu de culture, et boîtes en pointillé indiquent plaque-revêtement pour modification 2D facultative. Pour FGF2, la flèche vers le bas se réfère à des concentrations plus faibles (4 ng/mL), et la flèche vers le haut se réfère à des concentrations plus élevées (20 ng/mL). Ce chiffre a été modifié par Holmes et Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figure 2 : images de fond clair représentant du protocole 3D. colonies de CSEh en d0, EBs à d2, agrégats après induction à d14, agrégats de taille différente et la morphologie (numérotés de 1-5) à J28, un agrégat unique avec des caractéristiques uniques et identifiables (indiqués par les lettres a–c) à J28, et changements visibles dans les mêmes fonctions à d35. Echelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié par Holmes et Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figure 3 : images de fond clair représentant du protocole 2D. CSEh colonies une d0, EBs à d2, agrégats après induction à d13, après placage agrégats à d14, après maturation à d35, comme on le voit à 5 x grossissement et un grossissement de 20 x. Le cercle blanc dans le panneau de gauche montre la zone de cellules différenciées entre les colonies de CSEh. Echelle = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figure 4 : images de fond clair montrant différentes dimensions et la complexité dans la culture 3D. Les agrégats à (A), jour 8 (CSEh) et (B) d35 (hiPSCs). L’image de ce dernier est composé de trois images séparées pour montrer l’ensemble global. Les deux agrégats ont été touchés par la fusion de petits agrégats ou perte (rupture) des structures. Echelle = 200 µm. Ce chiffre est republié de Holmes et Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figure 5 : ICC images de produits 3D montrent des marqueurs pertinents et structures. À la culture d35, pièce 3D produits : PAX6 (vert) et TBR2 (rouge) de lumen de rosette-comme la formation neurale (1er rang) ; DCX (vert) et NeuN (rouge) s’étalant de la zone ventriculaire de bord extérieur (VZ)-comme la structure (seconde ligne) ; KIRREL2, un marqueur associé neuroépithélium cérébelleux (troisième rangée, gauche) ; et les cellules ZIC1 un marqueur associé à granule cérébelleux (3e rangée, droite). L’expérience a été réalisée plusieurs fois à l’aide de quatre hPSC différentes lignes : ligne de CSEh H01 (n = 5) et hvs88 lignes iPSC (n = 4), hvs60 (n = 3) et hvs51 (n = 1). Flèches pointent vers la lèvre rhombique (RL)-comme la structure. Echelle = 100 µm. Ce chiffre est republié de Holmes et Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figure 6 : structure en forme de zone ventriculaire à grande échelle de produits 3D. Culture d35, un agrégat de CSEh dérivé est positif pour PAX6 (vert) et TBR2 (rouge), souvent associées à des neurones précoces dans les zones ventriculaires (VZs) et sous-ventriculaire (SVZs), in vivo. (En haut) Un astérisque (*) marque le côté apical d’une région de VZ-like qui longe le bord de l’agrégat, avec parenthèses indiquant la profondeur/division de VZ / SVZs. (milieu) : fusion des signaux montrent des tronçons épars de PAX6 + / TBR2-cellules augmente dans la taille vers l’extrémité supérieure droite de la VZ. (En bas) Image de grossissement plus élevé de la section indiquée par un rectangle dans le panneau central. Echelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié par Holmes et Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figure 7 : ICC images 2D produits montrent des marqueurs pertinents. À la culture d35, exposition de produits 2D, de CSEh (rangée du haut) et hiPSCs (rangée du bas), cellules positives pour : marqueur de cellules de granules ZIC1 et migrateurs neurones cérébelleux marqueur TAG1 (colonne de gauche) ; et les neurofilaments (NF) de la marqueur neuronal et TAG1 (colonne de droite). Echelle = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figure 8 : RT-PCR de produits 2D. analyse de l’expression ARNm de CSEh ligne H01 (rangée du haut) et hiPSC ligne hvs60 (rangée du bas) à la fin de la 2D Protocole montre produits avec électrophorèse pour : marqueur de cellules de granules ZIC1, marqueur de cellules de granules ATOH1, neurones cérébelleux migrateurs marqueur TAG1, Purkinje marqueur de cellules Calbindin (CALB), canaux calciques voltage-dépendants de CACNA1A (C-1 a), CACNA1E (C-1F), récepteur de l’acide gamma - aminobutyrique (GABA) B 1 (G-Br1) et gène de ménage EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figure 9 : Calcium imagerie/analyse des produits 2D. À la culture d35, hPSC produits de différenciation ont été enregistrés pendant 2 min au microscope, après incubation avec de la teinture de fluor5. À 30 s, les cellules ont été stimulés électriquement pour 10 s à 10 Hz. (A) des images fixes Voir la CSEh à 0 s (à gauche) et après le début de la stimulation électrique à 30 s (à droite). Les flèches indiquent la région d’intérêt (ROI) pour l’analyse des influx de calcium. Affichage de graphiques d’analyse (B) changement de fluorescence relative par rapport au temps de retour sur investissement (changer en fluorescence = (F-F,0) / f0, où F0 = (∑F1-n) / n), avec des pointes de neurone-comme se produisant avant, pendant et après stimulation. Barre noire indique la durée de la stimulation électrique. L’échelle bar (blanc) = 50 µm. complet d’enregistrement pour CSEh (comme ici) et une ligne de hiPSC (non illustré) sont disponibles en supplémentaire vidéo 1 et 2 de vidéo supplémentaire, respectivement. Les enregistrements sont au format AVI, à la vitesse 4 x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Supplémentaire 1 vidéo : Calcium imagerie vidéo 2D produit de CSEh ligne H01. À la culture d35, produits de différenciation de la ligne de CSEh H01 ont été enregistrés pendant 2 min au microscope, après incubation avec fluor5 teignent. À 30 s, les cellules ont été stimulés électriquement pour 10 s à 10 Hz. enregistrements ont été réalisés à 2 images/s et transformé en vidéo AVI à ~ 7 images/s, produisant une vidéo d’une durée d’environ 30 s, à ~ 4 x la vitesse. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
2 vidéo supplémentaire : Calcium imagerie vidéo 2D produit de hiPSC ligne hvs51. À la culture d35, produits de différenciation de hiPSC ligne hvs51 ont été enregistrés pendant 2 min au microscope, après incubation avec de la teinture de fluor5. À 30 s, les cellules ont été stimulés électriquement pour 10 s à 10 Hz. enregistrements ont été réalisés à 2 images/s et transformé en vidéo AVI à ~ 7 images/s, produisant une vidéo d’une durée d’environ 30 s, à ~ 4 x la vitesse. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous décrivons un support de protocole de hPSCs, à l’aide de défini différenciation 3D simplifié et réduit les facteurs de croissance, capables de produire des agrégats cellulaires avec les premières structures neuroépithéliales et positifs pour les marqueurs associés à cervelet, ainsi qu’une option Modification 2D afin de différencier les cellules comme une monocouche pour générer des neurones fonctionnels.

Protocole de différenciation cérébelleux 3D simplifiée avec Modification 2D facultative

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

L’objectif global de ces cultures de différenciation est de générer des lignées cellulaires cérébelleuses dans des environnements 2D ou 3D. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions fondamentales concernant les nouveaux développements ou les mécanismes pathologiques sous-jacents aux troubles cérébraux infantiles en utilisant des cellules souches dérivées de patients. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a un démarrage et une maintenance simples avec peu de facteurs et qu’elle peut être utilisée comme base pour tester des protocoles neuronaux plus complexes. La démonstration de la procédure sera faite par Lisa, une technicienne de mon laboratoire. Pour mettre en place la différenciation avec la méthode G modifiée de passage des hPSC, transférez le volume requis de milieu de maintenance neurale dans un tube stérile et complétez avec 4 nanogrammes par millilitre de FGF2 et dix inhibiteurs de roche micromolaires. Ensuite, conservez le tube moyen à température ambiante ou au bain-marie à 37

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