Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

L’objectif global de cette procédure est d’induire la conversion des cellules germinales en neurones chez C. elegans. Cette méthode peut aider à étudier l’implication des processus biologiques, tels que les voies de signalisation ou l’épigénétique, dans la régulation de la reprogrammation du destin cellulaire. Le principal avantage de la méthode décrite dans cette vidéo est que chez les animaux vivants, les cellules germinales peuvent être mises à l’épreuve par la surexpression d’un facteur de transcription induisant le destin.

En parallèle, un dépistage génétique tel qu’un dépistage ARNi peut être effectué afin d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la régulation de la reprogrammation cellulaire. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie régénérative. Parce que cette méthode in vivo pourrait être utilisée pour étudier la reprogrammation cellulaire dans différentes conditions de développement et environnementales.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de reprogrammation sont difficiles à apprendre. Parce que le phénotype de conversion de la cellule germinale en neurone, lors de l’épuisement de lin-53, ne se produit que dans des conditions soigneusement contrôlées. Pour les plaques d’ARNi, chargez des plaques de six centimètres avec de la gélose NGM contenant de l’IPTG et de la carbénicline.

Laissez-les sécher pendant 24 à 48 heures à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, transférez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à 14 jours. Ensuite, striez des plaques sélectives contenant de la carbénicilline et de la tétracycline avec des clones de bactéries ARNi avec le plasmide L4440 portant le gène lin-53.

Utilisez un motif de stries triphasées et assurez-vous de plaquer un contrôle vectoriel vide. Ensuite, faites pousser les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, choisissez au moins trois colonies individuelles et inoculez chacune d’elles dans un tube de culture séparé avec deux millilitres de LB, complété par de la carbénicline, mais pas de tétracycline.

Prévoyez d’avoir trois cultures saines par condition. Ensuite, cultivez les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique de 600 nanomètres de 0,6 à 0,8. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de chaque culture bactérienne dans une plaque d’ARNi ggaré NGM de six centimètres.

Incuber les assiettes toute la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Ce protocole est optimisé pour les vers de souche BAT28 maintenus à 15 degrés Celsius, où les transgènes sont les plus stables. Des détails sur la génétique de la souche sont fournis dans le texte.

La synchronisation de l’âge des vers est essentielle. Utilisez la technique du blanchiment. Lavez les plaques de gélose NGM de six centimètres contenant des adultes et des œufs avec 800 microlitres de M9. Ensuite, granulez les vers par centrifugation et retirez le surnageant.

Ensuite, ajoutez 1/2 à un millilitre de solution de blanchiment aux vers. Et tout en observant les vers sous un stéréoscope, secouez le tube jusqu’à ce que les vers adultes commencent à éclater, puis récupérez les œufs. Maintenant, séparez les déchets des œufs.

Centrifugez d’abord le tube et éliminez le surnageant. Ensuite, lavez trois fois la pastille de mouchoirs en papier avec 800 microlitres de M9. Assurez-vous d’utiliser la centrifugation pour regrouper les tissus entre les lavages.

Maintenant, transférez les œufs nettoyés dans des plaques NGM fraîches ensemencées avec la bactérie OP50. Vérifiez brièvement si l’isolement des embryons a réussi et leur transfert vers les plaques NGM. Faites pousser les animaux à 15 degrés Celsius.

Pour réaliser la conversion des cellules germinales en neurones lors de l’épuisement de lin-53, l’épuisement doit commencer dans la génération parentale. Pour appauvrir la lin-53, soumettre les animaux L4 à l’ARNi. Transférez manuellement 50 vers L4 par réplication sur une plaque d’ARNi NGM sans bactéries.

Utilisez un fil de platine. Les vers L4 sont reconnaissables à une tache blanche à peu près à mi-chemin le long de leurs faces ventrales. Maintenant, incubez les vers à 15 degrés Celsius dans l’obscurité pendant environ sept jours.

L’IPTG est sensible à la lumière. Lorsque la progéniture F1 atteint les stades L3 et L4, séparez-la des animaux parentaux plus gros et plus épais. À ce stade, dépister le phénotype de la vulve saillante dans le F1, ce qui indique que l’ARNi contre lin-53 a été couronné de succès.

L’activité de l’ARNi peut également entraîner une létalité, qui augmente au-dessus de 15 degrés Celsius. Pour activer che-1 et induire la conversion des cellules germinales en neurones dans la descendance F1, choquez les vers pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Utilisez un incubateur ventilé, car il permet un choc thermique plus efficace.

Après le choc thermique, incubez des assiettes à 25 degrés Celsius pendant la nuit dans l’obscurité. Il est important d’éviter d’induire une surexpression de che-1 par choc thermique avant que les animaux n’atteignent le milieu du stade L3. Cela peut conduire à l’expression de la protéine che-1 dans les tissus non ciblés.

Le lendemain, installez une source lumineuse à fluorescence et un filtre GFP pour examiner les animaux à la recherche d’une fluorescence dérivée du transgène dans la zone du milieu du corps. Pour évaluer la pénétrance du phénotype, déterminez le rapport entre les animaux émettant un signal fluorescent. En règle générale, environ 30 % présenteront un signal GFP discret.

En comparaison, chez les animaux porteurs du vecteur vide ARNi, même un signal diffus dans la lignée germinale n’est pas observé chez plus de 5 % de la population. Les animaux F1 qui présentent le phénotype de la vulve saillante illustrent l’application réussie de l’ARNi lin-53. Chez ces animaux, la conversion des cellules germinales en cellules neuronales ressemblant à des neurones ASE lors de l’induction de che-1 par choc thermique est courante.

Un examen attentif révèle des projections semblables à des neurones qui sont typiques des neurones des cellules germinales. En revanche, les témoins vectoriels vides ont montré une expression minimale de la GFP, qui était tout au plus diffuse. Les cellules germinales de ces animaux manquaient de caractéristiques semblables à celles des neurones.

Lorsque les animaux étaient trop jeunes au moment de l’induction de la surexpression de che-1, ils présentaient souvent une expression transgénique ectopique dans d’autres régions du corps, telles que la vulve en développement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de planifier et d’effectuer soigneusement les expériences à l’aide de vers vivants afin de reprogrammer les cellules germinales en neurones. La méthode décrite ici dans cette vidéo vous permettra maintenant d’étudier l’implication d’un certain nombre de facteurs différents dans la régulation de la reprogrammation cellulaire.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en 10 jours. Lors de la tentative de l’expérience, il est important de soigneusement mettre en scène les animaux avant l’induction de la reprogrammation, et de maintenir la souche BAT28 à 15 degrés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le double ARNi peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : Quels sont les mécanismes sous-jacents qui jouent un rôle lors des conversions du destin cellulaire ?