Name: Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Découvrez la reprogrammation de cellules germinales en neurones chez C. elegans par RNAi et expression induite de CHE-1. Cette méthode in vivo permet d'étudier les mécanismes épigénétiques de conversion cellulaire.

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Nous remercions Alina El-Khalili et Martina Hajduskova pour l’assistance technique. Nous remercions les membres du groupe Tursun pour commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été parrainé par l’ERC-StG-2014-637530 et ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 et est pris en charge par le centre de Max Delbrück de médecine moléculaire de l’Association Helmholtz.

Toutes les méthodes décrites ici en ce qui concerne la protection des animaux ont été approuvés par la LaGeSo de Berlin, Allemagne
1. préparation de la solution
<ol>
	<li>NGM-gélose (1 L)
	<ol>
		<li>Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de médias de peptone (p. ex., Bacto-Peptone) et 20 g d’agar. Après la stérilisation, ajouter 1 mL de cholestérol (5 mg/mL en stock EtOH 95 %), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4et 1 mL d’amphotéricine B (2,5 mg/mL de bouillon).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-Agar Arni plaques (1 L)
	<ol>
		<li>Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de médias de peptone et 20 g d’agar. Après autoclavage ajouter, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL en stock EtOH 95 %), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL d’amphotéricine B (stock de 2,5 mg/mL), 1 mL de 1 M IPTG et la carbénicilline 1 mL (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Ajouter 10 g de médias de peptone, extrait de 5 g de levure, 5 g de NaCl, 20 g d’agar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Ajouter H2O à 1 L. Après la stérilisation, ajouter 1 mL de carbénicilline 50 mg/mL et 2.5 mL de tétracycline 5 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Milieu LB (1 L)
	<ol>
		<li>Ajouter 10 g de médias de peptone, extrait de 5 g de levure, 5 g de NaCl et 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Ajouter H2O à 1 L. Après la stérilisation, ajouter 1 mL de carbénicilline 50 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-tampon (1 L)
	<ol>
		<li>Ajouter 6,0 g Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 5 g de NaCl et 50 mg de gélatine. Avant utilisation, ajouter 1 mL de 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solution de blanchiment (10 mL)
	<ol>
		<li>Ajouter 1 mL de NaClO et 2 mL de NaOH de N 5. Ajouter H2O à 10 mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. préparation des plaques de l’ARNi
Remarque : C. elegans est généralement cultivé en laboratoire sur des plats de Pétri de 6 cm contenant 7,5 mL de nématode croissance milieu gélose (NGM-Agar)10,11. Ce protocole est optimisé pour les vers à 15 ° C. Pour préparer les assiettes avec NGM, utiliser les techniques stériles standard pour prévenir la contamination fongique et bactérienne. Voici le protocole afin de préparer les plaques NGM additionnés de réactifs pour RNAi.
<ol>
	<li>Préparer des plaques d’Agar-NGM Arni 6 cm contenant 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et 50 carbénicilline µg/mL. Laissez-les sécher pendant 24 à 48 h à température ambiante dans le sombre12.
	<ol>
		<li>Conservez les plaques d’Arni à 4 ° C dans l’obscurité. Ne pas utiliser si il y a plus de 14 jours.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sélectionnez le clone de bactéries (Escherichia coli HT115) Arni contenant le plasmide L4440 avec la séquence d’ADN gène lin-53 le stock de glycérol congelés du RNAi bibliothèque disponible13 sur LB-géloses contenant 50 µg/mL carbénicilline et 12,5 µg/mL de tétracycline en utilisant le modèle de stries sur trois phases. Cultiver les bactéries à 37 ° C durant la nuit12. Ce clone permet de production d’IPTG dépendant d’ARNdb lin-53 dans les bactéries.
	<ol>
		<li>En outre, poussent Arni bactéries contenant le plasmide L4440 sans n’importe quelle séquence de gène sous le contrôle de vecteur vide14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Le lendemain, prélever une colonie unique de lin-53 ou plaques de vecteur vide LB-gélose à l’aide d’une pipette de 200 µL Astuce et ensemencer chacun d’eux dans un tube à culture distincte contenant 2 mL de liquide LB moyenne14 additionné de 50 carbénicilline µg/mL. Cultiver des cultures pendant une nuit à 37 ° C jusqu'à ce qu’ils atteignent une densité optique (do) à 600 nm de 0,6 à 0,8. Mesurer le diamètre extérieur à l’aide d’un spectrophotomètre à15. ATTENTION : Le milieu LB liquide ne doit pas contenir de tétracycline contrairement à la LB-gélose utilisée pour les bactéries des stries sur le stock de glycérol, depuis l’inclusion de la tétracycline pendant l’alimentation conduit à une diminution Arni efficacité 12</li>
	<li>Ajouter 500 µL de chaque culture bactérienne (lin-53 ou vecteur vide) aux plaques de RNAi NGM-Agar de 6 cm à l’aide d’un échantillon. Incuber les boîtes avec un couvercle fermé pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité pour sécher. Pendant ce temps, l’IPTG dans les plaques NGM va induire la production de dsRNA chez les bactéries.
	<ol>
		<li>Utiliser au moins 3 plaques par une culture bactérienne par expérience. Cela vous donnera 3 techniques réplique pour chaque expérience.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Magasin séchée NGM-agar Arni plaques avec des bactéries à 4 ° C dans l’obscurité pendant jusqu'à deux semaines.</li>
</ol>
3. préparation du BAT28 de souche de c. elegans
<ol>
	<li>Maintenir la souche ver BAT288 contenant les transgènes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] et ntIs1 [gcy-5prom::gfp] OP50 bactéries à l’aide de plaques de gélose-NGM standard à 15 ° C. Remarque : Pour un protocole détaillé sur la culture nématode, voir10. Le rol-6(su1006) est un allèle dominant et couramment utilisé de marqueurs phénotypiques injection16 qui provoque le mouvement de roulement typique. Il est utilisé dans le transgène otIs305 pour suivre les hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Gardez la souche BAT28 à 15 ° C en permanence afin d’empêcher l’activation précautionneux de le hsp-16.2prom::che-1 transgène. Réduire l’exposition à des températures supérieures à 15 ° C lors de la manipulation de la souche autant que possible.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour âge-synchroniser vers, utilisez le blanchiment technique17.
	<ol>
		<li>Laver les plaques de 6 cm NGM-Agar contenant des adultes et des oeufs de BAT28 à l’aide de 900 µL de tampon de M9. Pellet vers par centrifugation à 900 g pendant 1 min. Retirer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 0,5 à 1 mL de solution de blanchiment et agiter le tube pendant environ 1 min jusqu'à ce que les vers adultes commencent à éclater ouvert. Moniteur à l’aide d’un stéréomicroscope standard.</li>
		<li>Pellet vers par centrifugation à 900 g pendant 1 min. Retirer le surnageant.</li>
		<li>Laver le culot de ver 3 fois en ajoutant 800 µL de tampon de M9 et centrifugation à 900 x g.</li>
		<li>Placer les oeufs lavés sur plaques-NGM fraîches ensemencées par des bactéries OP50. Cultiver une population blanchie sur les bactéries OP50 à 15 ° C jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade de L4 (environ 4 jours). Les larves de L4 se distingues par une tache blanche environ à mi-chemin le long de la face ventrale du ver18 utilisant un stéréomicroscope standard. Remarque : Pour atteindre la cellule germinale au phénotype de conversion de neurone sur l’appauvrissement de la couche de lin-53, il doit être épuisé dans la génération parentale (P0).</li></ol></li></ol>Le score du phénotype de conversion est entrepris dans la génération suivante (filiale génération F1). Pour atteindre l' appauvrissent lin-53 déjà dans le P0, L4 animaux subissent d’Arni.
	
	
	<li>Transférer manuellement 50 vers stade L4 par réplicat à l’aide d’un fil de platine à une plaque NGM qui ne pas contenir de bactéries et laisser les vers s’éloigner des bactéries OP50 transférés. Laissez les vers se déplacent sur la plaque pendant environ 5 minutes. Bactéries utilisation des plaques NGM-Agar Arni semé précédemment avec bactéries Arni lin-53 (ou lutte contre les vecteurs vides) pour transférer vers les plaques de RNAi respectifs.
	<ol>
		<li>Éviter de transférer des bactéries OP50 aux plaques Arni réelles. Travailler rapidement afin de minimiser les temps d’exposition de la souche à des températures supérieures à 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incuber les vers sur les plaques de RNAi NGM-Agar à 15 ° C pendant environ 7 jours jusqu'à ce que la progéniture F1 vers atteigne L3-L4 stade. Ils peuvent être clairement séparés des animaux P0 puisqu’ils sont plus gros et plus épais que la progéniture F1.
	<ol>
		<li>Vérifier visuellement sous un stéréomicroscope standard si les vers la progéniture F1 montrent le phénotype qui dépasse de la vulve (pvul) comme illustré à la Figure 1. Arni contre lin-53 a des effets pléiotropiques et provoque le phénotype pvul qui peut être utilisé pour déterminer si l’ARNi contre lin-53 a été un succès. Remarque : Arni contre lin-53 peut également causer la létalité d’embryons de F1. Cet effet augmente si les plaques sont exposés à des degrés supérieurs à 15 ° C avant d’animaux au stade de la L3-L4. Des embryons morts peuvent être reconnus par développement arrêtés et le manque de l’éclosion.</li>
		<li>Incuber dans l’obscurité IPTG étant sensible à la lumière.</li>
	</ol>
	</li>

4. l’induction de la reprogrammation de cellules germinales
<ol>
	<li>Incuber les boîtes de RNAi examinés contenant du lin-53 et vider la progéniture F1 RNAi-traités vecteur pendant 30 min à 37 ° C dans l’obscurité pour activer CHE-1. Utiliser un incubateur ventilé car il permet pour un choc thermique plus efficace.</li>
	<li>Permettre aux animaux soumis au choc thermique à récupérer pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité et puis incuber les boîtes à 25 ° C durant la nuit dans l’obscurité.</li>
	<li>À l’aide d’un stéréomicroscope standard couplé à une source de lumière de fluorescence, examiner les animaux sous le filtre GFP pour gcy-5prom::gfp-dérivé de signaux dans la zone du milieu du corps vers comme illustré à la Figure 2. Set microscope pour signaux GFP : excitation maximale à 488 nm avec émission maximale à 509 nm.</li>
	<li>Évaluer le degré de cellules germinales à la conversion de neurone par animaux de montage avec des signaux de GFP dans la zone du milieu du corps sur gélose contenant du tampon microscopie diapositives19.
	<ol>
		<li>Compter le nombre d’animaux présentant les cellules germinales à la conversion de neurone vs les animaux sombres pour évaluer la pénétrance de phénotype. Environ 30 % des animaux présentent généralement des signaux discrets de GFP dans la lignée germinale sur l’appauvrissement de lin-53 , alors que pas plus de 5 % des animaux montrent des signaux diffus de GFP dans la lignée germinale sur vecteur vide Arni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ont déclaré qu’aucun des intérêts concurrents n’existent.

Alors que le protocole décrit en utilisant transgénique c. elegans souche BAT28 et Arni contre lin-53 est simple, un certain nombre d’étapes est essentiel afin d’assurer le résultat escompté de cellules germinales de reprogrammation du neurone. Il est important que la souche BAT28 est maintenue à 15 ° C en tout temps avant les expériences. Pendant le maniement et l’entretien de la souche, le temps à des températures supérieures à 15 ° C doit être réduite autant que possible. Conditions de choc thermique appropriée sont importantes car induction insuffisante de la surexpression de che-1 n’entraînera pas de cellules germinales à la conversion de neurone ASE. Cela peut être détecté en mesurant la pénétrance de phénotype comme décrit dans le protocole. Choc thermique étendu peut conduire à la détermination de la létalité des animaux. Par exemple, les plaques qui ont été placés près des murs intérieurs ou sur le terrain de fond d’un incubateur d’air statique souvent expérience vaste traitement thermique. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser un incubateur ventilé chaleur. En outre, moment de l’induction de choc thermique est critique depuis la surexpression de che-1 au cours des stades larvaires plus tôt puis L3 peut conduire à induction ectopique gcy-5prom::gfp dans les régions du corps différents comme la vulve (Figure 3) 9. en outre, une vaste choc thermique peut être détecté par la pénétrance de phénotype chez les animaux d’Arni vecteur vide qui ne doit pas dépasser 5 % et auto-fluorescence accrue des autres tissus, à savoir l’intestin.
Sporadiquement, Arni bactéries peuvent perdre leur activité pour produire efficacement des ARNdb du gène cible. Malheureusement, cela ne peut être détecté avant l’expérience d’Arni. Dans ce cas une strie fraîche de la glycérol doit être cultivée comme décrit dans l’article 2 du protocole. S’il y a encore aucun causées par ARNi pléiotrope phénotype visible tels que le phénotype pvul causée par ARNi réussie contre lin-53, puis un plasmide isolement d’ADN de la bactérie respectif ne doit être effectué et les bactéries HT115 fraîches doivent être transformée avec le plasmide L4400 contenant la séquence de lin-53 .
Ce qui est important, la souche BAT28 a un le phénotype rouleau causé par l’injection marqueur pRF4, qui a été utilisé au cours de la transgénèse des animaux avec le hsp-16.2prom::che-1 construction d’ADN. Parfois, les animaux perdent le phénotype évolutif, qui peut indiquer le silençage de la hsp-16.2prom::che-1 transgène. Afin de bien maintenir la souche BAT28, choisir 10 animaux rouleau à un plat frais et se propagent en sélectionnant pour rouler des animaux.
L’application du protocole est limitée à la procédure de l’ARNi F1, ce qui signifie que les animaux dont les parents (génération P0) n’ont pas été exposées à lin-53 Arni n’affichera pas cellules germinales à la conversion de neurone en raison de sauvetage maternelle4. Procédure alternative pour convertir les cellules germinales de neurones a été décrite par Ciosk et ses collègues15 à l’aide de précipitation RNAi de gld-1 et de mex-3 sans la surexpression d’un facteur de transcription. Toutefois, les neurones obtenus n’appartiennent pas à un type spécifique de neurones et les cellules germinales également convertir en cellules musculaires après épuisement véhiculée par ARNi de gld-1 et mex-315. Auparavant, il a été démontré l’ARNi contre lin-53 a permis la conversion de cellules germinales en cellules semblables à des neurones GABAergiques sur la surexpression du facteur de transcription Pitx-type homoedomain UNC-3016 au lieu de CHE-14 . Pour les orientations futures, transcription de sort induisant différente facteurs peuvent être testés si lin-53 appauvri les cellules germinales peut être convertie à d’autres types de cellules que les neurones spécifiques. Dans ce contexte, la surexpression du facteur de transcription bHLH myogéniques HLH-1, homologue des mammifères MyoD17, induit la conversion des cellules germinales aux muscles sur lin-53 RNAi5. La reprogrammation établi des cellules germinales d’un type spécifique de cellules somatiques à lin-53 RNAi et la surexpression d’un facteur de transcription sort induisant approprié peut être utilisée pour un certain nombre de différents écrans génétiques. Ces écrans suppresseur ou enhancer peuvent aider à disséquer les voies réglementaires qui jouent un rôle lors de la conversion de destin cellulaire.

Cell fate reprogrammation par l’expression ectopique TF comme le MyoD TF myogène, qui, lorsque surexprimée, fibroblastes convertis directement dans les cellules musculaires1, a été un axe de recherche depuis des décennies. Cependant, les cellules différenciées sont souvent réfractaires à ce processus, en raison de mécanismes qui garantissent leur identité cellulaire. Les cellules germinales présentent un degré similaire de protection, et il y a des mécanismes sous-jacents qui agissent souvent comme une barrière pour empêcher la conversion des cellules germinales dans d’autres types de cellules à la surexpression d’un TF induisant sort. En général, la régulation épigénétique telles que des modifications d’histone et structure de la chromatine impose un obstacle pour la conversion des cellules sort2,3. Nous avons déjà appliqué génétique inverse à l’aide de RNAi knock-downs chez c. elegans et identifié les facteurs sauvegarder les identités cellulaires et ainsi lutter contre la reprogrammation des cellules germinales dans les neurones4. Plus précisément, le polycomb 2 complexe répressif (PRC2) et l’escorte de l’histone hautement conservée LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 chez les humains) empêchent la conversion directe des cellules germinales dans les types spécifiques de cellules somatiques telles que les neurones glutamatergiques de goût chez c. elegans 4 , 5. pour identifier ces facteurs de la barrière de la reprogrammation des cellules germinales, nous avons utilisé des animaux transgéniques portant le choc thermique inductible Zn-doigt TF CHE-1. CHE-1 est généralement exprimée en deux neurones tête c. elegans, où il précise que le sort des neurones glutamatergiques goût appelé ASE6. Le sort de neurone ASE peut être visualisé par l’expression de l’ASE spécifique fluorescente journaliste gcy-5prom::gfp. GCY-5 est une zone chémoréceptrice seulement exprimée en ASE juste neurone7. Après épuisement de lin-53 par ARNi et induction de l’expression ectopique large de CHE-1 par choc thermique, les cellules germinales peuvent être convertis en neurones en vivo4,,5. Ce qui est important, calendrier de traitement de l’ARNi est cruciale car les vers adultes seulement (génération P0) exposés à lin-53 Arni donnent lieu à des animaux de la progéniture F1 avec une lignée germinale qui est permissif pour la reprogrammation en neurones4.
Les cellules germinales décrits ci-dessus à la procédure de conversion du neurone chez c. elegans peut servir à étudier diverses questions biologiques tels que l’implication de la signalisation des voies dans la cellule sort reprogrammation. Par exemple, nous avons utilisé la reprogrammation en neurones ASE à Arni contre lin-53 afin d’étudier l’implication de l’encoche voie8la reprogrammation des cellules germinales dans le processus de signalisation des cellules germinales induite par CHE-1. En effectuant des double Arni pour co appauvrissent lin-53 et l’histone déméthylase-encodage gène utx-1 nous avons démontré que l’encoche de signalisation voie neutralise PRC2-mediated gene silencing en activant l’expression de UTX-1 dans la lignée germinale8 . Cette constatation montre que la conversion de cellules germinales aux neurones décrites dans le présent protocole pourrait servir à étudier un processus biologique complex tels que la reprogrammation cellulaire dans un organisme intact et dans le contexte de différentes du développement et environnement conditions. En outre, il fournit la perspective pour défier les cellules germinales en surexprimant différents inducteurs sort TFs pour étudier leur rôle dans la restriction de la plasticité cellulaire9, ou d’évaluer leur potentiel pour induire la reprogrammation des cellules germinales à autres cellules types in vivo.
Des cultures de cellules mammifères permettent également d’étudier différents aspects de la reprogrammation de cellules sort, cellules en culture ont une capacité limitée d’imiter les conditions de voie signalisation par rapport à un organisme intact. Par conséquent, le c. elegans est un modèle polyvalent pour l’examen des rôles des divers processus biologiques tels que Notch signalisation lors reprogrammation in vivo. En outre, il est un modèle puissant pour écrans génétiques qui est relativement facile à maintenir et à modifier génétiquement des faibles coûts.

<table><tbody><tr><td>Chemicals&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&nbsp ;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extrait de levure&nbsp ;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>USBiologique</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp ;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25 163 364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N</td><td>)Roth&nbsp ;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>Incubators</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator&nbsp ;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td><td>pour</td></tr><tr><td>incubateur</td> à choc thermique.<td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>pour le maintien des souches de vers à 15 &deg ; C ou 25 &deg ; </td></tr><tr><td>CMicroscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>M205 FA</td> Microscope <td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>(imagerie) + caméra</td><td>Axio Imager 2</td> Microscope <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>(imagerie) + caméra</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial souches </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14 ::Tn10(DE3 lysogen : lavUV5 promoter -T7 polymérase) (IPTG-inducible T7 polymérase) (ARNASE III moins).</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp ; </td><td></td><td></td><td>Uracil auxotroph E. coli strain<</td></tr><tr><td>strong>Souches de vers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT28 : otIs305 (hsp16.2prom ::che-1 :: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom ::gfp) V.</td><td></td><td></td><td>dérivé de OH9846 par 4 fois plus de rétrocroisement avec des</td></tr> <tr><td>clones N2RNAi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Bibliothèque Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>vide vetor : L4440</td><td>Addgene&nbsp ;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>Misc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioche à vers&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Fabriqué par vous-même à l’aide d’une pipette Pasteur et d’un fil de platine</td></tr></tbody></table>

application de rnai et expression du facteur de transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Étudier les processus biologiques des cellules au cours de la conversion de l’identité des types spécifiques de cellules fournit des renseignements importants sur mécanisme qui maintiennent et protègent les identités cellulaires. La conversion des cellules germinales dans des neurones spécifiques chez le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) est un outil puissant pour réaliser des écrans génétiques pour disséquer les voies réglementaires qui sauvegardent les identités cellulaires établies. Reprogrammation des cellules germinales d’un type spécifique de neurones appelés ASE exige des animaux transgéniques qui permettent à la surexpression de la transcription de Zn-doigt large facteur (TF) CHE-1. CHE-1 endogène est exprimée exclusivement en deux neurones tête et doit indiquer le sort des neurones glutamatergiques ASE, qui peut facilement être visualisé par le journaliste gcy-5prom::gfp . Un gène de trans contenant le choc thermique pilotée par le promoteur che-1 gène expression chimère permet large expression erronée de CHE-1 chez l’animal entier traitement par choc thermique. La combinaison de l’ARNi contre le facteur de régulation de la chromatine LIN-53 et la surexpression induite par la chaleur-choc che-1 conduit à la reprogrammation des cellules germinales dans les cellules de neurone comme ASE. Nous décrivons ici la procédure Arni spécifique et des conditions appropriées pour le traitement de choc thermique d’animaux transgéniques afin d’induire avec succès des cellules germinales à la conversion de neurone.

Comme illustré à la Figure 1, F1 animaux qui présentent le phénotype pvul illustrent l’application réussie de lin-53 Arni. Ces animaux est susceptibles de permettre la conversion de leurs cellules germinales dans des cellules de neurone comme ASE à induction choc thermique de la surexpression de che-1 tel qu’illustré à la Figure 2. Contrairement vers qui poussaient sur le contrôle vides vector Arni lin-53 Arni traitement donnera les animaux qui affichent ectopiques GFP-signaux dans la zone du milieu du corps après choc thermique et incubation de 25 ° C la nuit comme décrit plus tôt4, 8. un examen plus attentif de ces vers sous un microscope à épifluorescence révèle que les cellules présentant des signaux GFP également affichent neuron-comme les projections (Figure 2 b, flèches blanches) qui sont typiques des cellules neuronales. Si l’ARNi contre lin-53 n’a pas réussi ou conditions de choc thermique ne convenaient GFP signaux ressemblera à ceux de contrôle Arni animaux traités (Figure 2). Éviter ce qui est important, induisant la surexpression de che-1 par induction de chaleur avant d’animaux atteindre le milieu stade L3. Animaux qui étaient trop jeunes au moment de l’induction de la surexpression de che-1 peuvent afficher une expression ectopique gcy-5prom::gfp dans d’autres régions du corps comme la vulve en voie de développement tel qu’illustré en Figure 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figure 1 : Pvul phénotype causée par ARNi contre lin-53. (En haut) Photo DIC vers de descendance L4/jeunes stade adulte F1 dérivé de contrôle ou lin-53 mères Arni traité. Barreaux de l’échelle = 20 µm. (bas) les animaux traités avec lin-53 Arni Visualisez le phénotype qui dépasse de la vulve (pvul) (têtes de flèche noires). Le phénotype pvul confirme que l’ARNi contre lin-53 a réussi. Barreaux de l’échelle = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figure 2 : Worms avec des cellules germinales avec succès reprogrammé en neurones. (A) BAT28 animaux de souche cultivées sur le vecteur vide ne montre pas de signaux GFP dans la lignée germinale après l’induction de choc thermique de la surexpression de che-1 . Ver de contours pointillé de blanc. Barreaux de l’échelle = 20 µm. (B) contrairement aux animaux de souche BAT28 cultivé sur le contrôle de vecteur vide Arni animaux cultivés sur lin-53 Arni affichage gcy-5prom::gfp signaux dans la zone du milieu du corps. Photos de la section du milieu du corps avec des signaux de GFP prise à un grossissement de X 63 révèlent des cellules positives GFP montrant les saillies (têtes de flèche blanches). Cette caractéristique morphologique indique que les cellules germinales a subi une transformation en cellules de neurone type ASE. Astérisques blancs marquent intestin dérivé auto-fluorescence. Toutes les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à épifluorescence avec 20 X 63 X grossissement et de grossissement. Pointillé blanc décrit les vers. Barreaux de l’échelle = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figure 3 : Ver de stade précoce avec GFP ectopique. BAT28 souche animaux cultivés sur les bactéries de RNAi vecteur vide qui étaient le choc thermique induit pour che-1 surexpression dans les premiers stades larvaires comme L2 de la GFP signaux dans la zone du milieu du corps (blancs astérisques). Ces signaux ne sont pas en raison de la reprogrammation des cellules germinales. Ver de contours pointillé de blanc. Barreaux de l’échelle = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit comment faire pour étudier les processus cellulaires au cours de la conversion destin cellulaire chez Caenorhabditis elegans in vivo. L’utilisation d’animaux transgéniques, permettant la surexpression de choc thermique pilotée par le promoteur le neurone induisant sort du facteur de transcription CHE-1 et par l’ARN-épuisement de la chromatine réglementant facteur LIN-53 cellules germinales à neurone reprogrammation peut être observée in vivo.

Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

L’objectif global de cette procédure est d’induire la conversion des cellules germinales en neurones chez C. elegans. Cette méthode peut aider à étudier l’implication des processus biologiques, tels que les voies de signalisation ou l’épigénétique, dans la régulation de la reprogrammation du destin cellulaire. Le principal avantage de la méthode décrite dans cette vidéo est que chez les animaux vivants, les cellules germinales peuvent être mises à l’épreuve par la surexpression d’un facteur de transcription induisant le destin.En parallèle, un dépistage génétique tel qu’un dépistage ARNi peut être effectué afin d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la régulation de la reprogrammation cellulaire. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie régénérative. Parce que cette méthode in vivo pourrait être utilisée pour étudier la reprogrammation cellulaire dans différentes conditions de développement et environnementales.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de reprogrammation sont difficiles à apprendre. Parce que le phénotype de conversion de la cellule germinale en neurone, lors de l’épuisement de lin-53, ne se produit que dans des conditions soigneusement contrôlées. Pour les plaques d’ARNi, chargez des plaques de six centimètres avec de la gélose NGM contenant de l’IPTG et de la carbénicline.Laissez-les sécher pendant 24 à 48 heures à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, transférez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à 14 jours. Ensuite, striez des plaques sélectives contenant de la carbénicilline et de la tétracycline avec des clones de bactéries ARNi avec le plasmide L4440 portant le gène lin-53.Utilisez un motif de stries triphasées et assurez-vous de plaquer un contrôle vectoriel vide. Ensuite, faites pousser les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, choisissez au moins trois colonies individuelles et inoculez chacune d’elles dans un tube de culture séparé avec deux millilitres de LB, complété par de la carbénicline, mais pas de tétracycline.Prévoyez d’avoir trois cultures saines par condition. Ensuite, cultivez les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique de 600 nanomètres de 0,6 à 0,8. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de chaque culture bactérienne dans une plaque d’ARNi ggaré NGM de six centimètres.Incuber les assiettes toute la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Ce protocole est optimisé pour les vers de souche BAT28 maintenus à 15 degrés Celsius, où les transgènes sont les plus stables. Des détails sur la génétique de la souche sont fournis dans le texte.La synchronisation de l’âge des vers est essentielle. Utilisez la technique du blanchiment. Lavez les plaques de gélose NGM de six centimètres contenant des adultes et des œufs avec 800 microlitres de M9. Ensuite, granulez les vers par centrifugation et retirez le surnageant.Ensuite, ajoutez 1/2 à un millilitre de solution de blanchiment aux vers. Et tout en observant les vers sous un stéréoscope, secouez le tube jusqu’à ce que les vers adultes commencent à éclater, puis récupérez les œufs. Maintenant, séparez les déchets des œufs.Centrifugez d’abord le tube et éliminez le surnageant. Ensuite, lavez trois fois la pastille de mouchoirs en papier avec 800 microlitres de M9. Assurez-vous d’utiliser la centrifugation pour regrouper les tissus entre les lavages.Maintenant, transférez les œufs nettoyés dans des plaques NGM fraîches ensemencées avec la bactérie OP50. Vérifiez brièvement si l’isolement des embryons a réussi et leur transfert vers les plaques NGM. Faites pousser les animaux à 15 degrés Celsius.Pour réaliser la conversion des cellules germinales en neurones lors de l’épuisement de lin-53, l’épuisement doit commencer dans la génération parentale. Pour appauvrir la lin-53, soumettre les animaux L4 à l’ARNi. Transférez manuellement 50 vers L4 par réplication sur une plaque d’ARNi NGM sans bactéries.Utilisez un fil de platine. Les vers L4 sont reconnaissables à une tache blanche à peu près à mi-chemin le long de leurs faces ventrales. Maintenant, incubez les vers à 15 degrés Celsius dans l’obscurité pendant environ sept jours.L’IPTG est sensible à la lumière. Lorsque la progéniture F1 atteint les stades L3 et L4, séparez-la des animaux parentaux plus gros et plus épais. À ce stade, dépister le phénotype de la vulve saillante dans le F1, ce qui indique que l’ARNi contre lin-53 a été couronné de succès.L’activité de l’ARNi peut également entraîner une létalité, qui augmente au-dessus de 15 degrés Celsius. Pour activer che-1 et induire la conversion des cellules germinales en neurones dans la descendance F1, choquez les vers pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Utilisez un incubateur ventilé, car il permet un choc thermique plus efficace.Après le choc thermique, incubez des assiettes à 25 degrés Celsius pendant la nuit dans l’obscurité. Il est important d’éviter d’induire une surexpression de che-1 par choc thermique avant que les animaux n’atteignent le milieu du stade L3. Cela peut conduire à l’expression de la protéine che-1 dans les tissus non ciblés.Le lendemain, installez une source lumineuse à fluorescence et un filtre GFP pour examiner les animaux à la recherche d’une fluorescence dérivée du transgène dans la zone du milieu du corps. Pour évaluer la pénétrance du phénotype, déterminez le rapport entre les animaux émettant un signal fluorescent. En règle générale, environ 30 % présenteront un signal GFP discret.En comparaison, chez les animaux porteurs du vecteur vide ARNi, même un signal diffus dans la lignée germinale n’est pas observé chez plus de 5 % de la population. Les animaux F1 qui présentent le phénotype de la vulve saillante illustrent l’application réussie de l’ARNi lin-53. Chez ces animaux, la conversion des cellules germinales en cellules neuronales ressemblant à des neurones ASE lors de l’induction de che-1 par choc thermique est courante.Un examen attentif révèle des projections semblables à des neurones qui sont typiques des neurones des cellules germinales. En revanche, les témoins vectoriels vides ont montré une expression minimale de la GFP, qui était tout au plus diffuse. Les cellules germinales de ces animaux manquaient de caractéristiques semblables à celles des neurones.Lorsque les animaux étaient trop jeunes au moment de l’induction de la surexpression de che-1, ils présentaient souvent une expression transgénique ectopique dans d’autres régions du corps, telles que la vulve en développement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de planifier et d’effectuer soigneusement les expériences à l’aide de vers vivants afin de reprogrammer les cellules germinales en neurones. La méthode décrite ici dans cette vidéo vous permettra maintenant d’étudier l’implication d’un certain nombre de facteurs différents dans la régulation de la reprogrammation cellulaire.Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en 10 jours. Lors de la tentative de l’expérience, il est important de soigneusement mettre en scène les animaux avant l’induction de la reprogrammation, et de maintenir la souche BAT28 à 15 degrés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le double ARNi peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : Quels sont les mécanismes sous-jacents qui jouent un rôle lors des conversions du destin cellulaire ?

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