Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

L’objectif global de cette technique est de tester les effets de différents composés sur les organismes modèles C. elegans dans un test à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la chimie, de la biologie et du vieillissement, telles que : des structures chimiques spécifiques prolongent-elles la durée de vie de C. elegans ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de cribler de nombreux composés de manière rapide et rapide.

Pour préparer des plaques de culture de masse pour la production d’un grand nombre de vers, dans une armoire à flux laminaire, versez d’abord 30 millilitres de gélose de milieu de croissance de nématode à 60 degrés Celsius sur des plaques de culture de 10 centimètres pour une solidification pendant la nuit. Le lendemain matin, ajoutez deux millilitres d’E. coli concentré sur chaque plaque, en inclinant et en tournant la plaque pour répartir complètement les bactéries sur la surface de la plaque. Lorsque les plaques de culture de masse ont séché, conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines.

Pour préparer des plaques de culture d’essai à haut débit pour le criblage, utilisez un distributeur automatisé à huit canaux pour ajouter 0,15 millilitre de gélose de milieu de croissance de nématode fondu dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Laissez la gélose se solidifier pendant la nuit. Ensuite, stockez les plaques de dosage à haut débit à quatre degrés Celsius pendant deux semaines maximum.

Pour mettre en place les cultures de C. elegans, utilisez un pic à vers et un microscope de dissection pour transférer 20 œufs sur chaque plaque de culture de masse et incubez les plaques à 20 degrés Celsius pendant six jours. Le septième jour, utilisez un microscope de dissection pour confirmer visuellement la présence d’ovules dans l’utérus. Pour recueillir les adultes gravides, utilisez une pipette en verre pour ajouter deux à trois millilitres de solution S Bassale par plaque et faites tourner les solutions autour de chaque plaque à la main.

À l’aide de la pipette en verre, transférez les vers dans un tube de 15 millilitres et granulez les vers par centrifugation. Remettez les vers en suspension dans 10 millilitres de solution d’hypochlorite et secouez rapidement les tubes de haut en bas pendant cinq secondes. Ensuite, incubez les vers pendant cinq minutes à température ambiante en secouant toutes les 2,5 minutes.

À la fin de l’incubation, centrifugez à nouveau les vers. Les granulés doivent être brun jaunâtre. Remplacez les surnageants par 10 millilitres de solution d’hypochlorite fraîche et secouez vigoureusement le tube à nouveau.

Incuber les vers pendant encore une à trois minutes en les secouant de temps en temps. Lorsqu’il ne reste que des œufs, centrifugez les tubes et aspirez les surnageants. Les granulés doivent être blancs sans coloration brune.

À l’aide d’une technique stérile, ouvrez les tubes dans une armoire à flux laminaire stérile et ajoutez 14 millilitres de solution S Bassale à chaque pastille. Lavez la pastille trois fois avec 14 millilitres de S Basal. Après trois lavages par centrifugation, remettre les œufs en suspension dans deux à trois millilitres de solution S Bassale fraîche.

Pour préparer la larve de C. elegans au stade L1, transférez les surnageants dans une boîte de Pétri en verre stérile par tube et utilisez deux à trois millilitres de solution basale S pour rincer les œufs restants des tubes dans chaque boîte. Ajoutez cinq millilitres de solution S Bassale dans chaque plat pour réduire l’encombrement et placez le plat sur un agitateur orbital à 20 degrés Celsius et 20 tr/min pendant 16 à 24 heures pour favoriser l’éclosion. Tous les nouveau-nés s’arrêteront au premier stade larvaire en raison d’un manque de nourriture.

À l’aide d’une pipette sérologique, transférez les larves L1 dans un tube de 15 millilitres pour leur centrifugation. Une fois que tous les L1 éclos ont été consolidés par centrifugation et aspiration répétées, remettre en suspension la pastille de larve avec 10 millilitres de solution basale S stérile. Ensuite, transférez 10 microlitres dans une assiette non ensemencée et comptez le nombre de larves présentes sur l’assiette.

Répétez cette opération 10 fois pour obtenir la densité moyenne des L1 dans votre solution. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, déterminer le volume total de la solution contenant les L1. Ensuite, utilisez le volume de la solution L1 et la densité des L1 dans la solution pour calculer le nombre total de L1 présents dans votre solution.

Pour plaquer les vers dans une plaque d’essai à haut débit de 96 puits, diluez la suspension L1 à une larve L1 par microlitre dans un flacon de milieu rond stérile, équipé d’une barre d’agitation à rotation modérément lente et laissez les plaques d’essai se réchauffer à température ambiante. Ensuite, dans une armoire à flux laminaire, ajoutez cinq microlitres d’E. coli concentré dans chaque puits, suivis de 10 microlitres de suspension L1 par puits pour obtenir une moyenne de 10 vers par puits. Lorsque tous les vers ont été plaqués, couvrez les plaques et incubez les vers pendant deux jours à 25 degrés Celsius, pour permettre aux larves de devenir adultes.

À la fin de l’incubation, ramener les plaques de la chimiothèque à température ambiante après la congélation. Secouez doucement les plaques décongelées à 60 tr/min sur un agitateur à microplaques pendant une minute immédiatement avant l’utilisation. À l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé à 96 puits, transférez 0,75 microlitre de composé de la plaque de bibliothèque à la plaque de dosage.

Lorsque tous les puits ont été traités, faites sécher à l’air libre le composé à la surface des plaques dans une armoire à flux laminaire pendant quatre à huit heures, en retirant les plaques individuelles dès qu’elles sont sèches. Scellez les plaques séchées avec un film transparent et couvrez-les. Faites ensuite tourner les plaques pendant 45 secondes à 1000 G et rangez-les en position inversée à 25 degrés Celsius.

Pour tester les réponses de C. elegans aux composés d’intérêt, une plaque de contrôle négative peut être utilisée pour noter la survie totale jusqu’à ce que 95 % des animaux de contrôle soient morts, après quoi toutes les plaques de test peuvent être notées. Par exemple, dans cette étude, 57 résultats positifs ont été observés dans la bibliothèque de retests de 179 composés, ce qui démontre que 32 % des produits chimiques retestés étaient positifs au total. Le regroupement des scores moyens de pourcentage vivant pour les puits témoins négatifs et les puits d’essai a indiqué que les puits d’essai ont obtenu de meilleurs résultats que les puits de contrôle.

Des criblages à petite échelle peuvent également être effectués, comme le démontre cet essai représentatif dans lequel 50 concentrations micromolaires et 100 concentrations micromolaires du composé testé ont été utilisées. La réévaluation de ces plaques d’essai sur petit écran lorsque plus de 99 % des animaux traités avec le témoin négatif étaient morts a indiqué que les puits de contrôle positifs ont obtenu de nombreux résultats supérieurs à ceux des témoins négatifs et des puits d’essai, en ce sens que les puits d’essai ont donné des résultats légèrement supérieurs à ceux des témoins négatifs. Dans cette expérience, ce dernier résultat a été biaisé par l’indication que de nombreux puits d’essai semblaient présenter une toxicité par rapport au traitement témoin, confondant ainsi cette interprétation simple.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en deux à quatre semaines si elle est correctement exécutée. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de maintenir l’intégrité des plaques de dosage, en s’assurant qu’elles sont impeccables avant d’être utilisées. En suivant cette technique, des questions supplémentaires peuvent être répondues, telles que, lequel de ces composés induit la mythophagie ?

Pour un test de mytophagie, un brin rapporteur de mytophagie serait utilisé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’effectuer un criblage chimique à haut débit en utilisant C. elegans comme organisme modèle.