Marquage métabolique et profilage des ARN de transfert à l’aide de macroréseaux

L’objectif global de cette procédure est de mesurer simultanément les niveaux cellulaires de tous les ARN de transfert dans des échantillons biologiques en combinant le marquage métabolique in vivo avec l’analyse des macroarrays. Les ARN de transfert ont longtemps été considérés comme des molécules d’entretien dépourvues de fonctions régulatrices. Cependant, de plus en plus de preuves indiquent que les niveaux d’ARNt cellulaire fluctuent en réponse à diverses conditions telles que le type de cellule, l’environnement et le stress.

La fluctuation de l’expression de l’ARNt influence directement la traduction des gènes, favorisant ou réprimant l’expression de protéines particulières. Pour comprendre la dynamique de la synthèse des protéines, il faut des méthodes capables de fournir des profils d’ARNt de haute qualité. Nous présentons ici une technique fiable et simple qui permet une quantification rapide et précise des niveaux d’ARN de transfert dans des organismes cultivés en laboratoire.

Pour commencer, avec une aiguille de calibre 18, placez un seul trou au centre du capuchon d’un tube de micro-centrifugeuse stérile de 1,5 millilitre pour permettre une bonne aération. Ensuite, avec cinq microlitres de Mycobacterium smegmatis provenant d’une culture de démarrage pendant la nuit, inoculez 500 microlitres de bouillon stérile 7H9 supplémenté. Conformément aux pratiques standard de radioprotection, doper le milieu de culture avec 20 microcuries par millilitre d’orthophosphate marqué au phosphore 32.

Cultivez des bactéries à 37 degrés Celsius et à 1 200 tr/min, dans un incubateur à secoueur placé derrière un bouclier acrylique de neuf millimètres d’épaisseur. À mi-log, transférez toute la culture dans un tube à bouchon à vis de deux millilitres et granulez les bactéries radioactives à température ambiante en les centrifugeant à 10 000 fois la gravité pendant deux minutes. Recueillir le surnageant contenant de l’orthophosphate radioactif non incorporé dans un contenant à déchets approprié.

Pour préparer l’ARN total, ajoutez un millilitre de réactif d’extraction d’ARN commercial et environ 200 microlitres de billes de verre à la pastille. Fermez solidement le tube et perturbez les bactéries dans un homogénéisateur sous une agitation maximale pendant deux minutes. Centrifugez l’échantillon à 12 000 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres et jetez les billes de manière appropriée. Ajoutez 0,2 millilitre de chloroforme et secouez vigoureusement le tube à la main pendant 15 secondes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 12 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Prélevez la phase aqueuse de l’échantillon dans un nouveau tube en inclinant le tube à 45 degrés. Évitez de dessiner l’une des couches interphases ou organiques. Ajoutez deux microlitres de précipitant coloré et 0,5 millilitre d’isopropanol à 100 % à la phase aqueuse.

Secouez vigoureusement le tube à la main pendant cinq secondes et centrifugez-le à nouveau. Retirez le surnageant du tube et jetez-le de manière appropriée, car la fraction liquide peut contenir des traces de radioactivité. Ensuite, après avoir séché la pastille à l’air libre pendant cinq minutes, mettez-la en suspension dans 200 microlitres de 2X SSC avec 0,1 % de poids par volume SDS.

À l’aide de la base de données génomique sur l’ARNt, concevez des sondes d’ADN en récupérant d’abord des séquences d’ARNt ou des gènes codant pour l’ARNt. Après avoir coupé les CCA à trois extrémités premières conservés s’ils sont codés et généré le complément inverse, ordonnez les sondes en fonction des 70 premiers nucléotides. Pour effectuer l’impression en matrice, décongelez la plaque à 96 puits à température ambiante.

Avec un stylo diamant, étiquetez les lames de verre revêtues d’amine. Ensuite, placez les diapositives dans une unité d’indexation. En suivant les placements de la grille, trempez soigneusement les broches du réplicateur dans les puits.

En utilisant une pression minimale, imprimez doucement le réseau sur les lames de verre. Continuez à imprimer sans nettoyer l’arrayer jusqu’à ce que vous ayez terminé avec le bloc A.It faut un peu de pratique pour pouvoir imprimer de manière cohérente. Nous vous recommandons de ne pas imprimer plus de huit à 10 tableaux par session.

Comptez 10 à 15 minutes par tableau. Il est facile de perdre le fil de la séquence de motifs d’impression, alors consacrez toute votre attention à la tâche et désactivez toutes les distractions. Lorsque vous êtes prêt à passer au bloc suivant, trempez le réplicateur dans de l’eau de Javel à 5 % et secouez doucement.

Appuyez sur le réplicateur pour le placer dans du papier absorbant. Ensuite, trempez le réplicateur dans de l’eau distillée, secouez-le doucement et pressez-le dans du papier. Répétez cette étape une fois.

Ensuite, trempez le réplicateur dans de l’isopropanol, secouez-le doucement et pressez-le dans le papier. Faites sécher le réplicateur sur le ventilateur pendant environ 20 secondes avant de passer au bloc suivant de la plaque à 96 puits. Passez au nombre d’impressions souhaité.

Ensuite, laissez sécher les lames. Placez les lames séchées face vers le haut sur une surface propre dans un réticulant UV de 254 nanomètres. Réglez le niveau d’énergie sur 999, 990 microjoules par centimètre carré, puis appuyez sur Démarrer.

Transférez les matrices dans 450 millilitres de solution de blocage et incubez-les à température ambiante sur un agitateur magnétique, sous agitation lente pendant la nuit. Lavez les lames dans 500 millilitres d’eau distillée à température ambiante, deux fois pendant cinq minutes chacune. Séchez les lames en les centrifugeant dans une centrifugeuse à microréseau à température ambiante pendant 10 secondes.

Stockez les matrices dans un endroit sec et sombre jusqu’à six mois. Avant l’hybridation, rincez les lames à l’eau bouillante et séchez-les par centrifugation. Placez le réseau à l’intérieur d’une cassette d’hybridation et chargez l’échantillon d’ARN radiomarqué.

Analysez les échantillons sur une station automatisée d’hybridation-lavage pour une reproductibilité maximale selon le protocole texte. En fin de course, séchez les lames par centrifugation. Enveloppez les lames avec du plastique fin.

Ensuite, utilisez un compteur Geiger sur son réglage le plus sensible pour vérifier que les lames ne contiennent pas de signal radioactif. Exposez les diapositives sur un écran de stockage au phosphore dans une cassette d’exposition à température ambiante pendant 10 à 90 heures selon l’intensité du signal. Le temps d’exposition, qui peut durer de quelques heures à quelques jours, dépend directement du signal du réseau.

Il faut un peu de pratique pour pouvoir traduire les comptages sur le compteur Geiger en temps d’exposition. Numérisez la diapositive à une résolution de 50 micromètres à l’aide d’un imageur phosphorescent. Quantifiez et soustrayez les intensités de radioactivité à chaque point de la sonde à l’aide du logiciel gratuit ImageJ mis à niveau avec un profileur de microréseaux.

Générez des cartes thermiques selon le protocole texte. Ici, on voit des macroréseaux de bactéries, de souris et d’humains scannés. Les réseaux de M. smegmatis n’utilisent que 43 sondes au lieu de 48 utilisées pour la souris et l’homme.

En conséquence, le réseau bactérien affiche 40 points vides qui se fondent dans l’arrière-plan. Trois répétitions biologiques indépendantes montrent que dans les conditions de croissance testées, tous les ARNt de M. smegmatis sont exprimés au-dessus du niveau de fond. Dans cette expérience particulière, l’écart-type observé pour chaque sonde est compris entre 2 % d’arginine TCT et 22 % de cystéine GCA avec une médiane de 5 %.

Par exemple, tous les isoaccepteurs d’alanine sont exprimés à des niveaux similaires, tandis que les ARNt acceptant l’arginine les plus élevés et les plus faibles diffèrent de trois fois. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 24 heures environ si elle est exécutée correctement et si le signal spot est adéquat. Notre méthode est applicable à tous les organismes dont le génome est disponible pour la conception de sondes.

Les organismes modèles cultivés in vitro sont des candidats idéaux pour le marquage métabolique. Le protocole présenté ici est optimisé pour Mycobacterium smegmatis, mais il a également été utilisé avec succès pour profiler l’ARNt chez E. coli, la levure, la souris et les cellules humaines cultivées. Notre technique est reproductible et spécifique.

Sa large plage dynamique et son seuil facilement ajustable permettent de profiler des espèces peu abondantes, telles que les ARNt associés à des polysomes, simplement en prolongeant les temps d’exposition des réseaux.