Quantification de l’endogène auxine et cytokinine durant la Culture entre-nœud d’ipéca

L’objectif général de cette procédure est de décrire comment les niveaux de phytohormones endogènes changent lors de la formation de pousses adventives chez l’ipéca. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la régénération des tissus dans la roue de culture des tissus végétaux. Le principal avantage de cette technique est que le niveau endogène d’acide indole-3-acétique et les cytokinines peuvent être simplement analysées avec une grande sensibilité.

L’implication de cette technique s’étend tout au long de l’établissement de la dégénérescence des tissus végétaux, car les changements dans le niveau de phytohormones endogènes déclenchent la formation de pousses adventices. Pour commencer, préparez un milieu B5 sans phytohormones et ajoutez 0,2 % de gomme gellane. Ensuite, autoclavez le milieu pour le stériliser.

À l’aide d’un scalpel chirurgical sur une plaque acrylique stérile, coupez des segments internodaux de huit millimètres de plantules d’ipéca et placez-les sur le support. Ensuite, cultivez les segments d’ipéca à 24 degrés Celsius sous 15 micromoles par mètre carré de lumière dans un cycle de lumière de 14 heures et d’obscurité de 10 heures pendant cinq semaines. Après avoir cultivé les segments d’ipéca, identifiez les régions un à quatre de chaque segment.

Une fois par semaine, utilisez un microscope pour compter le nombre de pousses adventives dans chaque région. Tout d’abord, placez une perle de zircone de cinq millimètres dans quatre tubes d’échantillon de deux millilitres. Ensuite, utilisez un scalpel chirurgical sur une plaque acrylique stérile pour couper les segments d’ipéca dans les régions I à IV. Ensuite, collectez huit segments de chaque région dans un tube d’échantillon.

Pesez chacun des échantillons et congelez-les dans de l’azote liquide. Ensuite, utilisez un homogénéisateur à base de billes pour écraser les échantillons congelés. À l’aide d’un mélangeur vortex, suspendre les échantillons dans un millilitre d’acétonitrile avec 500 picogrammes de chaque étalon interne de bœufs et de CKs.

Placez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifugez les échantillons à 3500 G pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez la pastille dans du nitrile acétal à 80 % avec 1 % d’acide acétique.

Répétez ensuite la centrifugation et utilisez un tube de classe jetable pour combiner les surnageants. Ajoutez 600 microlitres d’eau avec un pour cent d’acide acétique au surnageant combiné. Utilisez ensuite un concentrateur sous vide pour évaporer l’acétal nitrile.

Chargez les solutions d’échantillonnage dans des cartouches HLB équilibrées individuelles. Et lavez les cartouches avec un millilitre d’eau avec un pour cent d’acide acétique. Ensuite, faites allusion à toutes les hormones avec deux millilitres d’acétylnitrile à 80 % avec un pour cent d’acide acétique dans un tube de verre.

À l’aide d’un concentrateur sous vide, évaporez l’acétal nitrile pour obtenir l’extrait dans de l’eau avec un pour cent d’acide acétique. Chargez les solutions d’échantillon dans des cartouches MCX équilibrées individuelles et lavez les cartouches avec un millilitre d’eau avec un pour cent d’acide acétique. Ensuite, faites allusion à l’IAA dans un tube de verre, avec deux millilitres de nitrile acétal à 30 pour cent avec un pour cent d’acide acétique.

Ensuite, lavez les cartouches avec deux millilitres de nitrile acétal à 80 % avec 1 % d’acide acétique. Ensuite, lavez les cartouches avec deux millilitres d’eau et un millilitre d’eau avec cinq pour cent d’ammoniac aqueux dans une chambre de tirage. Faites allusion aux CKs dans un tube de verre avec deux millilitres de nitrile acétal à 60 % avec cinq pour cent d’ammoniac aqueux dans une chambre de tirage au sort.

Utilisez ensuite un concentrateur sous vide pour évaporer le solvant de chaque fraction hormonale. Remuez les échantillons à moins trente degrés Celsius jusqu’à l’analyse LCMSMS. Tout d’abord, dissolvez chaque extrait hormonal dans un tube avec 600 microlitres de méthanol.

Transférez ensuite la solution dans un flacon à récupération totale à col à vis et utilisez un concentrateur sous vide pour évaporer le solvant. Dissoudre la fraction IAA dans 20 microlitres de nitrile acétal à 30 % et les fractions CK dans 20 microlitres d’eau avec 1 % d’acide acétique. Ensuite, utilisez un système MS triple quadripôle équipé d’un système HPLC pour analyser les échantillons en mode ions positifs.

Enfin, quantifier l’AIA endogène dans les niveaux de CK par rapport à une courbe standard du rapport entre les étalons non marqués et les étalons marqués au deutérium. Dans ce protocole, la cytokinine oxydante endogène dans les goulottes adventices a été mesurée via LCMSMS pendant cinq semaines. Au cours de la première semaine, aucune goulotte fortuite ne s’est formée et les premières petites goulottes sont apparues au cours de la deuxième semaine.

Au cours des troisième et quatrième semaines, le nombre de goulottes a augmenté principalement chez les régents un et deux. Au cours de la cinquième semaine, le nombre de chutes était d’environ sept dans la région un et de cinq dans la région deux. Avant la culture, le niveau d’AIA était légèrement plus élevé dans la première région que dans les régions deux, trois et quatre.

Au cours de la première semaine, le niveau d’AIA a considérablement augmenté dans la région quatre et a légèrement diminué dans les régions un, deux et trois. Après cinq semaines de culture, un gradient de concentration d’AIA est apparu. Avec des niveaux augmentant de la région un à la région quatre.

Avant la culture, il n’y avait que des traces de la plupart des CK. Au cours de la première semaine, le niveau de tZR a augmenté à 13,8 picogrammes par milligramme dans la région deux. Et 18,1 picogrammes par milligramme dans la région trois.

En revanche, les niveaux de tZ, iP et iPR n’ont que légèrement changé au cours de la culture. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’hormone de la partie endogène est stable. Après avoir été développée chez l’homme, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la culture de tissus végétaux.

Explorer la formation fortuite dans d’autres organismes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser l’acide indole-3-acétique endogène et les cytokinines.