Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

L’objectif global de ce protocole est de générer une culture à haut rendement de neurones induits à partir de fibroblastes de peau humaine adulte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles neurologiques, car elle permet la dégénérescence d’un système neuronal basé sur le patient qui maintient l’âge de la cellule. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet de générer des neurones induits à partir de personnes de tout âge de manière très standardisée et efficace en seulement 25 jours.

Il permet un large éventail d’applications biomédicales, notamment la modélisation des maladies, la toxicologie, le diagnostic, ainsi que des tests de dépistage de médicaments à très grande échelle. Shelby, étudiante au doctorat au sein de l’unité d’entraînement cérébral, ainsi que Karlonia, de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, décongelez les fibroblastes dermiques humains adultes à l’aide d’un système automatisé de décongélation cellulaire.

Après avoir compté le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, ensemencez deux cent mille cellules par fiole T-75 contenant 10 millilitres de milieu de fibroblaste. Maintenir à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez l’ancien milieu par un milieu de fibroblastes frais.

Continuez à changer le milieu de fibroblaste tous les trois à quatre jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 95 % de confluence. Une heure avant de reprogrammer les fibroblastes dermiques humains adultes, enduire chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 250 microlitres de gélatine à 0,1 %. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius.

Aspirez le milieu fibroblastique de la fiole et lavez-le une fois avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Après le lavage, lyser les cellules avec 1,5 millilitre de trypsine à 0,05 % par fiole T-75 à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu fibroblastique pour neutraliser la solution de trypsine.

Refroidissez les cellules détachées dans un tube de 15 millilitres en rinçant deux fois les cellules du ballon. Ensuite, centrifugez les cellules à 400 G pendant cinq minutes. Expulsez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de fibroblaste.

Ensuite, préparez une suspension cellulaire de 1 320 000 cellules dans 13,2 millilitres de milieu fibroblastique afin d’obtenir 100 000 cellules par millilitre de milieu. Après avoir aspiré la gélatine de la plaque, lavez deux fois la plaque avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Ajoutez ensuite 500 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Chaud 13,2 millilitres de fibroblaste moyen à 37 degrés Celsius. Ensuite, décongelez le vecteur lentiviral dans le capuchon laminaire à température ambiante. Ajoutez le volume requis de lentivirus nécessaire pour infecter les fibroblastes dermiques humains adultes à une multiplicité d’infection de 20 au milieu sans aucun amplificateur de transduction.

Remplacez ensuite le milieu par 500 microlitres de milieu fibroblastique avec l’ajout du vecteur lentiviral. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu contenant le lentivirus par un milieu de fibroblastes frais sans vecteur lentiviral.

Le troisième jour après la transduction virale, retirez le milieu de fibroblaste et ajoutez 500 microlitres de milieu de conversion neuronale précoce. Deux ou trois fois par semaine, remplacez 225 microlitres de milieu ancien de chaque puits par 250 microlitres de milieu de conversion neuronale précoce frais. Le 18e jour après la transduction virale, retirez le milieu de conversion neuronale précoce et remplacez-le par 500 microlitres de milieu de conversion neuronale tardive.

Continuez à changer de milieu tous les deux à trois jours comme auparavant jusqu’au 25e jour ou au point final expérimental. Utilisez une pipette de 1000 microlitres pour retirer le fluide. Ajoutez ensuite deux 250 microlitres d’agent dissociant cellulaire dans chaque puits et laissez la plaque dans l’incubateur pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent et flottent comme des cellules uniques.

En attendant, préparez le tampon FACS. Triturer avec une pipette de 1000 microlitres. Incuber un peu plus longtemps s’il reste des amas de cellules.

Transférez la suspension unicellulaire obtenue dans un tube de 1,5 millilitre. Rincez les puits deux fois avec un milieu de conversion neuronale tardive et transférez-les dans le même tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez à 400 G pendant cinq minutes et jetez le surnageant.

Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon FACS. Encore une fois, faites tourner les cellules à 400 G pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans le tampon FACS et centrifuger.

Répétez l’opération deux fois de plus. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 50 microlitres de tampon FACS contenant l’anticorps CD56 humain à une concentration de un à 50 pendant 15 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière. Centrifugez les cellules à 400 G pendant cinq minutes et dissolvez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon FACS pour laver les cellules.

Encore une fois, centrifugez les cellules à 400 G pendant cinq minutes. Lavage avec un tampon FACS deux fois suivi d’une centrifugation. Enfin, remettre en suspension dans 200 microlitres de tampon FACS contenant 10 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium.

Triez les cellules positives NCAM et négatives à l’iodure de propidium à l’aide du gate sur la base du niveau d’intensité de fluorescence des échantillons de contrôle qui n’ont pas été colorés avec l’anticorps NCAM ou l’iodure de propidium. Utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter le nombre de cellules et ensemencez 50 000 cellules par centimètre carré sur une plaque recouverte de fibronectine et de laminine Poly-L-ornithine avec un milieu de conversion neuronale tardive. Continuez à changer la moitié du milieu deux à trois fois par semaine avec le milieu de conversion neuronale tardive jusqu’au point final expérimental.

Des images représentatives en contraste de phase montrent les changements morphologiques dans les cellules au cours de la période de conversion. Une transformation significative de la morphologie cellulaire est visible dès le cinquième jour. Au 22e jour, environ la moitié des cellules se sont converties en neurones.

Des images représentatives d’aminofluorescence montrent la présence de marqueurs neuronaux standard dans les cellules. Au 25e jour, les cellules obtiennent la morphologie neuronale et expriment des marqueurs neuronaux tels que MAP2 et TAU. Les noyaux sont colorés au DAPI.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des neurones induits à partir de fibroblastes humains adultes. Et cela comprend le placage des cellules pour la reprogrammation, la transduction virale, l’entretien des cellules, ainsi que le tri FACS pour la purification. Le développement de cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des troubles neurologiques pour étudier différentes caractéristiques associées à la maladie ainsi que des thérapies potentielles.

Et cela peut être fait dans un système qui n’est pas seulement un système neuronal humain, mais qui peut être à la fois spécifique au patient et à la maladie.