Name: Surveillance de cellule à cellule Transmission des agrégats de protéine Prion chez Drosophila Melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Découvrez une méthode de surveillance de la transmission intercellulaire des agrégats de protéines prion chez Drosophila melanogaster. Cette technique permet d'observer in vivo la propagation des agrégats dans le système nerveux central intact.

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Nous remercions les membres des laboratoires Kopito, Luo et Pearce pour les nombreuses discussions utiles au cours du développement de ces méthodes. Nous remercions également Brian Temsamrit pour une lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Fonds de l’Université des Sciences et des fiducies de bienfaisance W.W. Smith.

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<li>Jucker, M., Walker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-propagation+of+pathogenic+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).</li>
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<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).</li>
<li>Zeineddine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOD1+protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+in+neurons+to+facilitate+their+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation.</a> Mol Neurodegener. 10, 57(2015).</li>
<li>Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+SOD1+misfolding+and+motor+neuron+disease+spread+along+neuroanatomical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways.</a> Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).</li>
<li>Clavaguera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+homogenates+from+human+tauopathies+induce+tau+inclusions+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).</li>
<li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+pathology+in+a+model+of+early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cerebral+beta-amyloidosis%3A+intracerebral+versus+systemic+Abeta+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338 (6109), 949-953 (2012).</li>
<li>Meyer-Luehmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).</li>
<li>Rey, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transneuronal+propagation+of+alpha-synucleinopathy+triggered+in+olfactory+bulb+mimics+prodromal+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease.</a> J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).</li>
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<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+polyglutamine+aggregates+in+neuronal+cells+occurs+in+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes.</a> J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).</li>
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<li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17487202">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme le nombre de patients souffrant de maladies neurodégénératives ne cesse d’augmenter, il y a un besoin urgent d’augmenter la compréhension de la pathogenèse moléculaire de ces maladies, afin que les meilleurs traitements peuvent être développées. Nous décrivons ici des méthodes qui permettent de surveiller la transmission de prion-comme des agrégats de protéine pathogène entre différents types de cellules dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster. Nous avons récemment utilisé cette méthode pour démon...

L’hypothèse de prion stipule que l’agent infectieux responsable pour les encéphalopathies spongiformes transmissibles (p. ex., maladie de Creutzfeldt - Jakob chez les humains, la tremblante du mouton, maladie du dépérissement chronique chez les cerfs et de wapitis et « maladie de la vache folle » chez les bovins ) est uniquement composé de protéines et dépourvu d’acides nucléiques1. Dans les maladies de prion, la protéine prion cellulaire (PrPC) suppose un pli non indigènes, stable (PrP-Sc) qui est hautement bêta feuille riche et peut se propager autonome en convertissant et recruter des molécules monomères de PrPC pour amyloïde stable agrégats. PrPSc agrégats utilisent ce mécanisme auto-répliquant de répartir entre les différentes cellules dans l’organisme et même entre des organismes individuels2.
Repliement et agrégation est également un élément central de la plupart des maladies neurodégénératives (maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA))3. Formation des assemblées intra - ou extra-cellulaires protéines agrégées dans ces maladies est étroitement associée à la cytotoxicité4 et progresse le long de chemins très reproductibles et propres à la maladie à travers le cerveau au cours du temps5, 6. ces schémas de propagation suggèrent que des agrégats pathogènes associés à ces troubles ont des propriétés de type prion. Fort soutien existe maintenant pour la transmission de prion-comme des agrégats associés à annonce, PD, HD et ALS - elles s’étendent de cellule-cellule et modèle le changement conformationnel de formes monomères de la même protéine dans les cellules affectées précédemment7, 8.
La plupart des études portant sur la propagation du prion comme des agrégats de protéine à ce jour ont été effectuée à l’aide de modèles de culture de cellules de mammifères, où agrégats transvaser dans le cytoplasme des cellules naïves de l’espace extracellulaire ou d’une autre cellule cytoplasme9,10,11,12,13,14,15, ou en injectant des matériaux contenant de l’agrégat dans le cerveau de souris et surveillance agréger l’apparence à l’extérieur de l’injection site16,17,18,19,20,21,22, 23. plus récemment, les animaux transgéniques ont été utilisés pour démontrer que des agrégats intracellulaires se propager à d’autres cellules dans le cerveau intact24,25,26,27, 28,29,30. Nous décrivons ici une méthode pour une visualisation directe de cession globale entre différentes cellules dans le cerveau intact de Drosophila melanogaster. Modèles de drosophile de HD/polyglutamine (polyQ) maladies ont été développés tout d’abord il y a près de vingt ans31,32 et ont fourni beaucoup de précieux conseils sur les mécanismes pathogènes qui sous-tendent ces troubles 33. HD est une maladie neurodégénérative héréditaire causée par une mutation autosomique dominante du gène codant pour la protéine huntingtine (Htt)34. Cette mutation se traduit par l’élargissement d’un tronçon de polyQ près aminée de Htt au-delà d’un seuil pathogène de ~ 37 glutamate, causant les protéines à repliement et agrégation35,36. Protéines de Htt sauvage contenant < 37 glutamate dans ce tronçon atteindre leur giron natif, mais peuvent être induites à global sur le contact physique direct avec un Htt globale « graine »12,27,37. Nous exploitons cette homotypique, nucléée agrégation de Htt sauvage comme une lecture pour le transfert de type prion et entrée cytoplasmique de mutant Htt agrégats originaires d’autres cellules.
Détermination des mécanismes de quels agrégats prion comme voyage entre les cellules peut conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives incurables. Nous prenons l’avantage du cycle de vie rapid, facilité d’utilisation et la traçabilité génétique de Drosophila melanogaster de définir des mécanismes moléculaires de la cellule-cellule propagation du mutant Htt agrégats. Notre stratégie expérimentale utilise deux systèmes d’expression binaire disponibles dans drosophile, le bien établi Gal4 spécifiques en amont activant séquence (Gal4-UAS) système38 et le récemment développés QF-QUAS système39. Ces deux systèmes indépendants de couplage permet de restreindre l’expression de transgènes Htt mutant et sauvage aux populations cellulaires distincts au sein de la même mouche40. En utilisant cette approche, nous examinons prion comme propagation du mutant Htt en surveillant la redistribution des cytoplasmique Htt sauvage de son état normalement diffuse, soluble à un état agrégé, conséquence directe d’un contact physique avec un mutant pré-formé Htt agrégat « semence ». Conversion de type sauvage Htt par mutant Htt peut être confirmée en utilisant biochimiques ou de transfert de techniques biophysiques qui signalent des interactions protéine-protéine, tels que l’énergie de résonance de fluorescence (FRET)9,27,41 .
Ce qui est important, nous pouvons également accéder à un grand nombre d’outils génétiques chez la drosophile pour identifier des gènes et/ou des voies qui véhiculent la propagation du prion comme des agrégats de protéine. Nous avons récemment utilisé cette approche pour dévoiler un rôle clé pour le récepteur scavenger surface des cellules,42,Draper43, en transférant mutant Htt agrégats d’axones neurones à proximité glia phagocytaire chez la drosophile central système nerveux (SNC)27. Ainsi, l’approche génétique et d’imagerie dotés que nous décrivons ici peut révéler des informations biologiques base importantes concernant un phénomène maladie pertinents dans le simple à utiliser mais puissant organisme, drosophile.

<table><tbody><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10X, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Dilué à 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20 % de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal (NGS), filtré</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquote et congélation à la réception</td></tr><tr><td>Poulet anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Utilisation à une dilution de 1:500</td></tr><tr><td>Lapin anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Utilisation à une dilution de 1:2000 ; peut reconnaître les protéines fluorescentes à base de DsRed (par exemple mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td></tr><tr><td>Souris anti-Bruchpilot</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Utilisation à une dilution de 1:100 ; marquera les structures pré-synaptiques actives dans tout le cerveau de la mouche</td></tr><tr><td>FITC anti-poulet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Utilisation à une dilution de 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-lapin</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Utilisation à une dilution de 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorps anti-souris</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td>Utilisation à dilution 1:250</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Réactif</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope (25 x 75 x 1,0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Pinces, Style 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td> à <td>utiliser dans une main non dominante</td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>utilisation dans la main dominante</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images LAS X Logiciel</td><td></td> d’analyse d’images Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance de cellule à cellule transmission des agrégats de protéine prion chez drosophila melanogaster

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Agrégation des protéines est un élément central de la plupart des maladies neurodégénératives, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie de Huntington (MH), la maladie d’Alzheimer (ma) et maladie de Parkinson (MP). Agrégats de protéines sont étroitement associées à la neuropathologie dans ces maladies, bien qu’on ne connaît pas le mécanisme exact par lequel agrégation de protéines aberrantes perturbe l’homéostasie cellulaire normale. Nouvelles données fort appuyer l’hypothèse qu’agrégats pathogènes en AD, PD, HD, et ALS ont beaucoup de similitudes aux prions, qui sont des protéines uniquement les agents infectieux responsables des encéphalopathies spongiformes transmissibles. Prions répliquent par la création de modèles la conversion des versions nativement plié de la même protéine, entraînant la propagation du phénotype agrégation. Comment prions et protéines de type prion dans AD, PD, HD et ALS déplacer d’une cellule à l’autre est actuellement un domaine de recherche intense. Ici, un modèle de Drosophila melanogaster qui permet une surveillance de transmission de prion-like, cellule-cellule des agrégats de la huntingtine mutante (Htt) associé à HD est décrite. Ce modèle tire parti des outils puissants pour manipuler l’expression du transgène dans de nombreux tissus différents de drosophile et utilise une protéine cytoplasmique fluorescent-étiquetées directement rapport à prions comme transfert de mutant Htt agrégats. Ce qui est important, l’approche que nous décrivons ici peut servir à identifier de nouveaux gènes et voies qui médient propagation d’agrégats de protéines entre diverses cellules types in vivo. Information obtenue grâce à ces études étendra la compréhension limitée des mécanismes pathogènes qui sous-tendent les maladies neurodégénératives et révéler de nouvelles possibilités d’intervention thérapeutique.

Les méthodes décrites ici produisent des données robustes témoignant de prion comme transfert des agrégats de protéine Htt de population d’une cellule à l’autre chez la mouche intacte CNS. Conversion de type sauvage Htt du diffus au ponctuée observe par fluorescence directe de cette protéine de fusion YFP glia bénéficiaire à la suite de HttQ91-mCherry expression dans donateurs Orn (A-C de laFigure 2et Figure 4<st...

Accumulation de preuves souscrit l’idée qu’agrégats de protéine pathogène est associée aux maladies neurodégénératives répartis entre les cellules ayant des propriétés prion. Nous décrivons ici une méthode qui permet la visualisation de cellule à cellule propagation des agrégats de type prion dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster.

Surveillance de cellule à cellule Transmission des agrégats de protéine Prion chez Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

L’objectif global de cette procédure est de surveiller la propagation des agrégats de protéines in vivo, de type prion. Utilisation de mouches transgéniques qui expriment une protéine sujette à l’agrégation dans une version soluble de la même protéine dans des populations cellulaires isolées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire dans les domaines de la neurodégénérescence, telles que la mythologie de l’agrégation des protéines ou d’autres transferts de matériaux d’une cellule à l’autre dans le cerveau.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’imager la propagation d’agrégats de protéines d’un opossum à un autre dans un système nerveux central intact. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la maladie de Huntington et d’autres maladies neurodégénératives de type prion. Parce que la propagation des agrégats semble être un mécanisme commun sous-jacent à la progression de ces troubles mortels.En utilisant des conditions de culture standard, générer des lignées transgéniques de drosophila melanogaster contenant des pilotes Gal4 ou QF spécifiques aux tissus. Ainsi que des lignées contenant des gènes trans de huntingtine de type sauvage ou mutants en aval du Gal4-UAS ou du QF-QUAS. Collectez la progéniture du génotype du désir et vieillissez-la jusqu’à ce qu’elle soit prête à être disséquée.Pour vous préparer à la dissection cérébrale, recueillez les solutions nécessaires et refroidissez-les sur de la glace, ainsi que le plat multipuits en verre, les pointes de pipette et une paire de pinces. Ensuite, anesthésiez les mouches adultes à l’aide de dioxyde de carbone et transférez-les dans un puits de la boîte en verre. Ensuite, ajoutez environ un demi-millilitre de PBST dans le puits avec les mouches et dans un puits adjacent.Ensuite, sous un microscope à dissection, faites la mise au point sur une seule mouche et éclairez-la des deux côtés avec des lumières à col de cygne. Placez ensuite un mouchoir plié sous le plat pour nettoyer les outils de dissection. Maintenant, à l’aide de la pince numéro trois dans la main non dominante, transférez une seule mouche dans le puits contenant le PBST.Immobilisez la mouche en saisissant son abdomen avec la face ventrale vers le haut et immergez-la complètement. Maintenant, insérez une dent d’une pince numéro cinq sous la cuticule dans le petit espace adjacent à la trompe. Ensuite, fixez la prise sur la tête en pinçant l’œil des deux côtés et écartez la pince pour détacher la tête.Jetez le corps de la mouche sur le tissu plié tout en maintenant la tête immergée dans le PBST. Ensuite, insérez une dent de la pince numéro trois dans le même espace de l’autre côté de la trompe et écartez doucement la cuticule de la tête pour exposer le cerveau. Avant de continuer, jetez le résidu de cuticule sur un tissu de laboratoire.Lors de l’ablation de la cuticule, évitez d’entrer en contact direct avec le cerveau afin de ne pas l’endommager avec une pince. Maintenant, retirez le cerveau disséqué du PBST, soit en saisissant une trachée attachée, soit en l’aspirant dans l’espace entre les pointes des pinces à l’aide d’une action capillaire. Ensuite, transférez le cerveau de la mouche dans un tube de microcentrifugation contenant une solution fixatrice sur de la glace.Observez attentivement pour surveiller si le cerveau se libère de la forceps. Une fois que tous les cerveaux ont été disséqués, transférez le tube de prélèvement dans un nutator à température ambiante et enveloppez-les pendant environ cinq minutes. Après la période de fixation, retirez la majorité de la solution fixatrice à l’aide d’une pipette p1000 et jetez-la, en faisant très attention de laisser les cerveaux dans les tubes.Cela nécessite une aspiration douce et une observation attentive. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBST frais dans le cerveau. Couvrez le tube et laissez-le basculer sur le nutateur pendant environ une minute pour laver le fixateur restant.Retirez ensuite la solution et répétez cette courte étape de lavage. Faites suivre les deux courts lavages d’un lavage de cinq minutes, puis de trois lavages de 20 minutes et enfin d’un seul lavage d’une heure. Après le dernier lavage, retirez soigneusement la majeure partie du PBST et immergez les cerveaux dans 30 microlitres de réactif anti-décoloration à base de glycérol.Ensuite, incubez les cerveaux à 4 degrés Celsius dans l’obscurité sans mouvement pendant une à 24 heures. Plus tard, retirez les cerveaux du tube de prélèvement à l’aide d’une pointe de pipette émoussée et transférez-les sur une lame de microscope. Ensuite, orientez doucement les cerveaux au besoin pour l’imagerie à l’aide d’une pince.Plusieurs échantillons peuvent être montés sur la même lame en rangées séparées. Ensuite, retirez l’excès de réactif anti-décoloration de la lame à l’aide du coin d’un tissu de laboratoire plié. Ne laissez pas les tissus entrer en contact avec le cerveau.Laissez ensuite les échantillons dans l’obscurité pendant cinq à 10 minutes pour laisser les cerveaux adhérer à la lame. Ensuite, prenez de petits morceaux de verre de couverture brisé et positionnez-les autour des cerveaux couvrant une zone d’environ 19 millimètres carrés, puis abaissez doucement un verre de couverture de 22 millimètres carrés sur la mosaïque de cerveaux et de verre pour faire un pont de montage. Ensuite, distribuez lentement le réactif anti-décoloration frais sous la lamelle afin qu’il remplisse les espaces vides.Faites-le très soigneusement pour que la cervelle et le verre restent en place. Scellez ensuite la lamelle avec du vernis à ongles. Tout d’abord, il suffit de l’appliquer dans les coins.Laissez sécher les tampons de coin de cinq à 10 minutes avant de terminer le scellement le long des bords. Le cerveau doit être imagé dès que possible. Imagez les cerveaux montés à l’aide d’un microscope confocal équipé d’un objectif à huile 40X ou 63X pour collecter des tranches Z dans la région du cerveau où les gènes trans sont exprimés.Ensuite, analysez les données en quantifiant le ponctué dans les tranches Z individuelles ou après avoir rendu les tranches en trois dimensions. Pour quantifier les agrégats de huntingtine mutants qui sont bien séparés et ont peu de signal de fond, ouvrez la série confocale Z en mode de visualisation 3D. Ensuite, utilisez l’assistant d’analyse pour identifier des points individuels dans un canal sélectif.Dans les paramètres, ajustez le seuillage et les filtres pour représenter avec précision tous les agrégats de taille hétérogène en tant qu’objets individuels dans l’image. Ensuite, activez les objets divisés sous le préfiltre de traitement binaire pour séparer les agrégats étroitement associés. Les informations quantitatives sur les objets identifiés par le logiciel sont rapportées sous les mesures.Après avoir compté les points de contrôle, caractérisez-les davantage dans un logiciel d’analyse d’images. Par exemple, prendre des mesures pertinentes des taches ou des surfaces pour obtenir des informations sur le diamètre, le volume ou l’intensité de l’agrégat. Certains agrégats de huntingtine de type sauvage peuvent être quantifiés en se déplaçant manuellement dans la pile Z et en comptant les points verts qui se distinguent du signal diffus environnant.Veillez à ne pas compter deux fois les agrégats simples lorsqu’ils apparaissent dans plus d’une tranche. Une autre analyse intéressante consiste à déterminer la fréquence de colocalisation entre les agrégats de huntingtine Q25-YFP et de huntingtine Q91-mCherry. Pour ce faire, utilisez le comptage manuel en déplaçant tranche par tranche dans une pile Z confocale.Une sélection minutieuse des moteurs génétiques et des fusions de gènes trans de protéines fluorescentes permet une détection claire des protéines huntingtine mutantes et de type sauvage dans les populations cellulaires qui ne se chevauchent pas. La conversion de la huntingtine de type sauvage de diffuse à ponctuée est observée par fluorescence directe de la protéine de fusion YFP dans la glie réceptrice à la suite de l’expression de la huntingtine Q91-mCherry dans les neurones récepteurs olfactifs du donneur. Une sélection minutieuse des moteurs génétiques et des fusions de gènes trans de protéines fluorescentes permet une détection claire des protéines huntingtine mutantes et de type sauvage dans les populations cellulaires qui ne se chevauchent pas.Les agrégats de huntingtine mutants et de type sauvage peuvent être quantifiés en tant qu’objets ponctués, soit manuellement, soit à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les agrégats peuvent être mesurés et caractérisés davantage en tant que populations et en fonction de leur fréquence de colocalisation. Les points colocalisés peuvent être analysés plus en détail par transfert d’énergie de résonance de fluorescence ou FRET pour démontrer la proximité des fusions de protéines fluorescentes.Une fois maîtrisées, la dissection et l’imagerie cérébrales peuvent être effectuées du début à la fin en moins de huit heures, si elles sont effectuées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de bien distinguer les objets agrégés ponctués des autres structures fluorescentes du même tissu à l’aide de contrôles appropriés. Cette procédure peut être modifiée pour inclure d’autres méthodes telles que l’inactivation de gènes afin de déterminer les mécanismes moléculaires de transfert d’agrégats entre différents types de cellules.Merci et bonne chance dans vos expériences.

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JoVE Journal

Neuroscience

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