Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une imagerie calcique ratiométrique des effets du neurone spécifique hermaphrodite, ou activité HSN, sur le comportement de Caenorhabditis elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences comportementales sur la façon dont l’activité des circuits neuronaux produit des changements dans le comportement des animaux lorsque les animaux alternent entre les états comportementaux. Cette technique permet d’enregistrer les changements dans l’activité intracellulaire du calcium avec un rapport signal/bruit élevé, tout en suivant simultanément le comportement et la locomotion des animaux.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’activité neuronale chez C. elegans, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes modèles transparents, y compris les larves de drosophile et les poissons zèbres. Les étudiants de Collin Labs feront une démonstration de la procédure avec moi : Richard Kopcock, Pravat Dhakal et Layla Nassar. Pour monter les animaux, appliquez d’abord de la nourriture bactérienne OP50 à partir d’une plaque de gélose de milieu de croissance de nématode à graines au fond d’une pioche à vers de platine et utilisez la pioche pour transférer environ 20 L quatre L à X 2 000 pour les animaux exprimant le rapporteur de calcium sensible GCaMP5 et mCherry dans HSN à partir du promoteur N-L trois P sur une plaque de milieu de croissance de nématode à graines.

Confirmez la présence de la vulve en développement au microscope stéréoscopique sous la forme d’une tache sombre claire entourée d’un croissant blanc et incubez les vers à 20 degrés Celsius pendant 24 à 40 heures. À la fin de l’incubation, appliquer OP50 sur une nouvelle pioche et transférer trois vers dans une plaque de milieu de croissance de nématodes non ensemencée, laissant une petite portion de nourriture sur la nouvelle plaque pour que les vers se nourrissent pendant l’imagerie. Ensuite, à l’aide d’une spatule plate arrondie, coupez un morceau de 20 x 20 millimètres dans la plaque non ensemencée et placez le morceau, côté ver vers vers le bas, sur un bord d’une lamelle propre de 24 x 60 millimètres numéro 1,5.

Ensuite, glissez soigneusement le morceau de gélose au centre de la lamelle et placez une lamelle numéro un de 22 x 22 millimètres sur le dessus de la pièce de gélose pour réduire le collage et l’évaporation. Pour configurer l’imageur, placez les vers sur la platine d’un microscope inversé et sélectionnez le 20x subjectif. Utilisez les oculaires binoculaires pour sélectionner un ver pour l’imagerie, faites glisser le filtre infrarouge et placez-le au-dessus du condenseur.

Ouvrez un programme d’analyse vidéo approprié et exécutez le script de communication final de l’étape série XY. Cliquez sur CsvWriter et sélectionnez un dossier pour enregistrer les informations enregistrées sur les étapes X et Y. Ensuite, cliquez sur la flèche verte pour initialiser le dispositif d’acquisition numérique.

Dans les paramètres du logiciel d’enregistrement par caméra infrarouge, sélectionnez Activer/désactiver la boîte de dialogue de contrôle de la caméra. Sélectionnez ensuite le menu Modes vidéo personnalisés, puis le mode 1 et le format Pixel Raw huit. Sous Trigger Stroke, réglez la ligne d’entrée de déclenchement sur trois, la polarité sur élevée et le mode sur 14.

Bascule Activez cette option pour arrêter l’acquisition de l’image jusqu’à ce que le signal de déclenchement de tension soit reçu de la caméra fluorescente. Avec la fenêtre d’affichage des images ouverte, cliquez sur Enregistrer et sélectionnez le dossier d’enregistrement des séquences d’images. Sélectionnez le mode d’enregistrement tampon et enregistrez les images au format JPEG.

Cliquez ensuite sur Démarrer l’enregistrement pour initialiser l’acquisition. Ensuite, ouvrez l’onglet Capture dans le logiciel d’acquisition de fluorescence et réglez le temps d’exposition sur 10 millisecondes, le binning sur quatre X et la profondeur d’image sur 16 bits. Sélectionnez un sous-réseau de caméra centré de 512 pixels de large sur 256 pixels de haut.

Le programme divisera automatiquement l’image large en deux pour générer les canaux de fluorescence séparés. Cliquez sur Afficher les options de déclencheur de sortie et définissez tous les déclencheurs sur positif. Vérifiez que le premier déclencheur et le deuxième déclencheur sont réglés sur Exposition et que le troisième déclencheur est défini sur Programmable avec une période de 25 millisecondes.

Ensuite, sous l’onglet Séquence, sélectionnez Time Lapse Sous Paramètres de balayage, réglez Field Delay one sur 50 millisecondes pour collecter des images à 20 hertz. Sélectionnez Enregistrer dans la mémoire tampon temporaire. Pour l’imagerie calcique ratiométrique, sous l’onglet Séquence, cliquez sur Démarrer pour commencer l’enregistrement et suivre le ver avec le joystick en gardant les cellules et les synapses de l’intérêt au centre du champ de vision.

Au moment où l’enregistrement de la fluorescence est lancé, des déclencheurs sont envoyés à la caméra à fond clair en attente et au contrôleur de scène qui commencent à collecter des images synchronisées et la position de la scène. Cliquez sur le bouton Statistiques dans la fenêtre Histogramme pour afficher les statistiques de pixels pour chaque canal. Ajustez la puissance de la LED pour assurer un pixel unique maximal de floraison de mCherry à l’extrémité présynaptique supérieur ou égal à 8 000 points dans le canal rouge, ce qui donne une plage dynamique d’environ 12 bits au-dessus de l’arrière-plan.

Les signaux rapporteurs de calcium à l’extrémité présynaptique au repos ou à un faible taux de calcium devraient être d’environ 2 500 dans le canal vert. Enregistrez le comportement jusqu’à ce qu’un état actif de ponte d’œuf soit atteint. Ensuite, enregistrez un sous-ensemble de 10 minutes contenant 6 000 images avant et 6 001 images après la première ponte.

Prenez soin de conserver le même sous-ensemble d’images en fond clair du comportement du ver et des points temporels de la position de l’étage X-Y, sinon la synchronisation précise des flux de données sera perdue. Pour la segmentation d’image, importez les séquences d’images dans un logiciel de quantification ratiométrique approprié et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la série chronologique dans l’onglet séquence pour définir la série chronologique à 20 images par seconde et 1,25 micromètre par pixel. Dans le menu Outils, sélectionnez Ratio, puis mCherry pour le canal A et GCaMP5 pour le canal B, puis cliquez sur Calculer pour soustraire l’arrière-plan de chaque séquence d’images.

Sélectionnez Appliquer une table de recherche arc-en-ciel au canal de rapport et utilisez le canal mCherry pour générer un canal de rapport modulé en intensité afin de mapper la couleur du rapport sur la luminosité du canal mCherry. Cliquez sur Rapport pour générer les deux canaux. Pour créer un protocole de recherche d’objets, faites glisser l’outil Rechercher des objets à l’aide de l’intensité sous l’onglet Mesures vers le volet du protocole et cliquez sur la roue dentée pour définir la fenêtre des valeurs d’intensité mCherry et pour Rechercher des objets.

Sélectionnez des valeurs d’intensité supérieures ou égales à deux écarts-types au-dessus du bruit de fond, en prenant soin de détecter le corps cellulaire et la terminaison présynaptique. Ajoutez des filtres supplémentaires ciblant le canal mCherry uniquement si nécessaire pour exclure les objets indésirables, tels que la tête, la queue ou la fluorescence intestinale. Ensuite, ouvrez le menu Mesures et sélectionnez Créer un élément de mesure et choisissez tous les points temporels pour exécuter le protocole d’analyse de quantification d’image.

L’acquisition simultanée des signaux de floraison GCaMP5 et mCherry est utilisée pour générer un canal de rapport pixel par pixel qui compense les changements de mouvement et de mise au point de l’animal. Pour chaque animal, les changements dans le calcium HSN intracellulaire présynaptique peuvent être corrélés avec des comportements évidents dans l’imagerie en fond clair, y compris la libération d’œufs et les changements dans la locomotion. En effet, des différences significatives de vitesse du ver avant, pendant et après l’état actif de ponte peuvent être observées.

En zoomant sur un événement de ponte, on constate un changement robuste de la florescence de GCaMP5 avant l’événement de ponte. Alors que la florescence de mCherry reste relativement inchangée. De plus, les changements mesurés dans le rapport GCaMP5 :mCherry montrent clairement un transitoire de calcium HSN environ 4 secondes avant la libération de l’œuf.

La contraction du muscle vulvaire qui se produit est évidente d’un ralentissement clair de la locomotion du ver qui se termine par la libération de l’œuf. De plus, l’imagerie et le suivi des vers, tels qu’ils viennent d’être démontrés, permettent de visualiser l’organisation spatiale du comportement de ponte des œufs à partir de la recherche de nourriture, des changements transitoires du calcium HSM et de l’activité HSN qui se transforme en tir en rafale avant la locomotion vers le lieu de ponte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en une heure ou deux, si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de rester concentré sur les cellules d’intérêt et leurs terminaisons présynaptiques pendant les étapes d’imagerie. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’activation optogénétique, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont le HSN répond à la stimulation présynaptique. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer le fonctionnement du circuit de ponte chez C. elegans.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’imagerie calcique ratiométrique de HSN chez Caenorhabditis elegans actif.