Name: Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique ratiométrique pour étudier l'activité neuronale HSN chez Caenorhabditis elegans en comportement. Cette méthode permet de corréler l'activité calcique intracellulaire avec les changements comportementaux.

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Ce travail a été financé par une bourse de NINDS au KMC (R01 NS086932). LMN a été financée par une subvention du programme NIGMS IMSD (R25 GM076419). Les souches utilisées dans cette étude, c. elegans Centre de génétique, qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Nous remercions James Baker et Mason Klein de discussions utiles.

1. souches, de la Culture médiatique et montage d’animaux
<ol><li>Poussent vers c. elegans à 20 ° C sur standard 60 mm moyen de croissance de nématode (NGM) boîtes de gélose ensemencées avec OP50 e. coli alimentaire bactérienne19.</li>
	<li>Préparer deux plasmides pour chaque promoteur de cellule spécifique d’intérêt : l’un, expression de GCaMP5 d’enregistrement intracellulaire Ca2 +et le second, expression de mCherry pour permettre ratiométrique quantification des changements de fluorescence GCaMP5 de conduite au volant et simplifier la mesure et la constatation de l’objet. Remarque : GCaMP5:mCherry ratiométrique imagerie corrige les fluctuations GCaMP5 fluorescence qui résultent de l’évolution de mouvement focus et animal, pas de réelle évolution Ca intracellulaire2 +.</li>
	<li>Injecter des plasmides exprimant de GCaMP5 et de mCherry ainsi que le plasmide pL15EK de marqueur visible de sauvetage dans les gonades de LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X animaux mutants et récupérer non-Muv lin-15(+) animaux exprimant GCaMP5 et mCherry d’un transgène haute-copie20,21,22. L’arrière-plan mutant lite-1 permet de réduire l’évitement de la lumière bleue comportement23,24.</li>
	<li>Intégrer les transgènes aux chromosomes à réduire un mosaïcisme et simplifier la génération de souches mutantes composé25. Remarque : La souche LX2004 décrite ici porte un transgène haute-copie intégrée qui exprime GCaMP5 et mCherry dans les HSNs provenant du promoteur de la PNL-3 (voir Table des matières)26,27, 28 , 29. le promoteur de la PNL-3 a été trouvé à forte expression de lecteur dans les HSNs L4 fin des animaux adultes sans causer des défauts importants en développement HSN ou le comportement de ponte par rapport aux autres promoteurs testés (e.g.,tph-1, EGL-6et unc-86). Cette souche et autres qui expriment GCaMP5 et mCherry dans les neurones moteurs épinière ventrale (VC), muscles vulvaires et uv1 cellules neuroendocrines sont disponibles depuis le centre de génétique de Caenorhabditis et détails de sa construction ont été décrites 27.</li>
	<li>Appliquer OP50 alimentaire bactérienne d’une gélose ensemencée au NGM au fond d’un ver platine pick et utilisez-la pour transférer ~ 20 animaux L4 LX2004 fin qui expriment GCaMP5 et mCherry dans les HSNs provenant du promoteur de la PNL-3 . Veiller à ce que la vulve en développement apparaît dans un stéréomicroscope comme une tache claire sombre entourée d’un croissant blanc. Incuber les animaux à 20 ° C pendant 24 à 40 h.</li>
	<li>Après l’incubation, appliquer OP50 le prélèvement et le transfert ~ 3 vers à une plaque non ensemencée de NGM, laissant une petite quantité de nourriture derrière pour les vers à se nourrir pendant la formation image. Assurer une alimentation suffisante, car trop peu de nourriture bactérienne va encourager les vers à errer loin du centre de la plaque alors que trop de nourriture augmentera la fluorescence de fond et provoquer une hypoxie.</li>
	<li>Utilisez une spatule plate arrondie pour couper un ~ 20 x 20 mm, morceau de la plaque portant les vers et transférer le morceau face vers le bas sur le centre d’un lamelle couvre-objet propre 24 x 60 mm #1.5 (Figure 1). Démarrez l’application d’un côté pour empêcher les bulles d’être piégés sous la lamelle et interférant avec l’imagerie. Appliquer une lamelle de 22 x 22 mm #1 vers le haut du segment pour réduire le collage et l’évaporation.</li>
</ol>2. configuration matΘrielle et Instrumentation
<ol><li>Placer la mise en scène, vers transgéniques sur la scène d’un microscope inversé avec un ≥ 0,7 numérique ouverture Plan-Apochromat 20 x stade XY objectif, motorisé contrôlable avec un joystick, un diviseur de l’image et fluorescence filtres pour GCaMP5 simultanée et mCherry excitation et d’émission, caméras pour fond de fluorescence et infrarouge clair d’imagerie et un système d’éclairage à la Diode électroluminescente (del)-triggerable (Figure 2A). Remarque : Un séparateur de faisceau de 80/20 envoie 80 % du signal image de la caméra à fluorescence et 20 % à la caméra fond clair. Un microscope vertical peut également être utilisé, mais le morceau NGM doit être placé entre une lame de verre et la grande lamelle en l’espèce.<ol>
<li>Les oculaires binoculaires permet de sélectionner un ver pour l’imagerie. Lorsqu’un animal est sélectionné, faites glisser le filtre infrarouge en place au-dessus du condenseur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déclencheurs de transistor-transistor logic (TTL)<ol>
<li>Fixez les câbles coaxiaux de chacune des trois lignes de sortie TTL déclencheur sur la caméra à fluorescence. Connectez la première sortie à l’entrée BNC #3 du système d’éclairage LED.</li>
		<li>Connectez la sortie deuxième à un adaptateur BNC « banane » vert et bruns fils du connecteur 8 broches GPIO au GPIO entrée #3 (4 broches) et sol (broche 5) de la caméra infrarouge, respectivement.</li>
		<li>Connectez la sortie de troisième à l’adaptateur BNC « banane » avec des fils de raccordement à l’entrée numérique #8 et au sol dans le dispositif d’acquisition numérique (Figure 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispositif d’acquisition numérique (DAQ)<ol>
<li>Connectez la carte microcontrôleur DAQ (voir Table des matières) à l’ordinateur via un câble USB. Mise à jour le firmware avec la norme Firmata protocole (voir Table des matières) et configurer le port USB pour communiquer à 57600 bauds.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LEDs<ol>
<li>Lancez le logiciel de contrôleur de LED (voir Table des matières). Changez le Mode de déclenchement de « continue à « Fermé » et sélectionner le déclencheur canal 3' pour les deux LEDs nm 470 et 590.</li>
		<li>Allumez et entrez les voyants d’alimentation pour chaque LED (p. ex., ensemble le 470 nm LED à 20 % et la LED nm 590 à 40 %).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez le script « XY-scène-final » en bonsaï (voir Table des matières) de communication série-stade30. Cliquez sur le nœud « CsvWriter » gris, puis sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer l’enregistré X et Y organiser des informations (Figure 3). Appuyez sur la flèche verte dans la barre d’outils pour initialiser le DAQ. Remarque : Le script démarre l’enregistrement de la position X et Y de scène quand la caméra à fluorescence envoie un signal TTL. Ce script affiche quatre colonnes de données : encadrer le nombre, X position (µm), la position Y (µm) et l’intervalle entre les images (s).</li>
	<li>Dans la caméra infrarouge, logiciel d’enregistrement (voir Table des matières) sous « Modes de vidéo personnalisée », sélectionnez « Mode 1 » (binning 2 x 2, 1 024 x 1 024 pixels), et « Pixel Format Raw 8". Sous ' Trigger / Strobe ", la ligne d’entrée de déclenchement (GPIO) la valeur « 3 », la polarité à « High », « Mode » à « 14 ». Activer/désactiver « Activer » pour arrêter l’acquisition de cadre jusqu'à la réception d’un signal de déclenchement TTL.<ol>
<li>Laisser cette fenêtre ouverte, cliquez sur le bouton rouge de « Record » sur la barre d’outils de la vue caméra principale. Sélectionnez le dossier pour les séquences d’images être sauvé. Sélectionnez le mode d’enregistrement « Tamponnée » et enregistrez des « Images » au format JPEG. Cliquez sur « Start Recording » pour initialiser l’acquisition.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appareil photo et image répartiteur de fluorescence NOTE : GCaMP5 et mCherry canaux fluorescence doit être prélevés en même temps pour assurer l’enregistrement d’image adapté pour le dosage ratiométrique. Un séparateur d’image permet l’acquisition de deux canaux de la fluorescence GCaMP5 et mCherry sur un capteur.<ol>
<li>Dans l’onglet « Capture » du logiciel d’acquisition de l’image (voir Table des matières), temps d’exposition défini à 10 ms, binning à x 4 et profondeur de l’image 16 bits. Sélectionnez un sous-tableau de caméra centrée de 512 pixels de large par 256 pixels de haut. Cliquez sur « Afficher les Options de déclenchement sortie » et définissez tous les déclencheurs de « Positif ». Remarque : L’acquisition de données ne peut parfois manquer de TTL déclencheurs s’ils sont 10 ms ou moins.</li>
		<li>Vérifiez que « Trigger 1' et « Trigger 2' sont sur « Exposition » tandis que « Trigger 3"a la valeur « Programmable » avec une « période » de Mme 25 sous l’onglet « Séquence », sélectionnez « Time Lapse » avec un « champ Delay1 » de 50 ms pour recueillir des images à 20 Hz. Sélectionnez « Enregistrer sur tampon temporaire ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMT acquérir et laser intensité durant l’imagerie confocale trois canaux<ol>
<li>Régler le gain PMT pour la fluorescence de fond est à un niveau juste au-dessus du minimum (niveau de noir). Augmenter la puissance de laser (vert) 561 nm jusqu'à ce qu’un seul pixel saturé de 12 bits ou 16 bits est observé à l’extrémité présynaptique dans le canal de mCherry.</li>
		<li>Régler intensité de laser (bleu) 488 nm afin que GCaMP5 fluorescence est visible à l’extrémité présynaptique au-dessus de fond. Ce paramètre faible empêche la saturation des pixels GCaMP5 lorsque la fluorescence augmente en réponse aux transitoires de forte Ca2 + . Ouvrir le trou d’épingle confocal complètement afin de maximiser la lumière capture.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ratiométrique Ca2 + imagerie et enregistrement de comportement
<ol><li>Sous l’onglet « Séquence » dans le logiciel d’acquisition de fluorescence, cliquez sur « Démarrer » lancer l’enregistrement. Suivre le ver avec le joystick, gardant les cellules et les synapses d’intérêt en bref et dans le centre du champ de vision (FOV). Cliquez sur le bouton « Statistiques » dans la fenêtre d’histogramme pour afficher les statistiques de pixel de chaque canal.</li>
	<li>Ajuster la puissance de LED afin d’assurer une fluorescence maximale pixel unique mCherry à l’extrémité présynaptique de ≥ 8 000 chefs d’accusation (~ 4 000 photoélectrons), donnant un ~ 12 bits plage dynamique plus haut fond (~ 100 photoélectrons). GCaMP5 signaux au terminus présynaptique au cours du repos Ca (faible)2 + devrait être autour de ~ 2 500 counts - juste visibles au-dessus d’un fond.</li>
	<li>Enregistrement jusqu'à un état actif Ponte ; en général, cela produit toutes les 20-30 min dans un ver de type sauvage7. Enregistrez un sous-ensemble de 10 min (12 001 cadres), 6 000 cadres avant et après le premier événement de Ponte (cadre 6 001). N’oubliez pas de garder le même sous-ensemble d’images de fond clair de ver, comportement et points de position allure XY, ou la synchronisation précise des flux de données seront perdue.</li>
	<li>Utilisez ImageJ et le plugin BioFormats (voir Table des matières) pour convertir des séquences d’images au format Image Cytometry Standard (.ics) afin qu’il puisse être importé dans le logiciel ratiométrique quantification.</li>
</ol>4. l’image Segmentation et analyse Quantitative
<ol><li>Importer des séquences d’images dans le logiciel ratiométrique dosage (voir Table des matières). Cliquez sur « Auto contraste » dans le menu « Outils » et régler le contraste de chaque canal d’établir noir approprié (~ 1 800) et blanc niveaux (10 000). Sélectionnez « Modifier les couleurs... » dans le menu outils pour confirmer que les affectations de couleur pour le canal GCaMP5 et mCherry sont correctes (Figure 4A - C).<ol>
<li>Faites un clic droit sur la série chronologique dans l’onglet « Séquence » et mettre à 20 images/s et 1,25 µm/pixel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez « Ratio » dans le menu « Outils » et sélectionnez « GCaMP5 » pour « Canal A » et « mCherry » pour « Canal B ». Cliquez sur « Calculer » à côté de « Seuil » pour soustraire l’arrière-plan de chaque séquence d’images. Sélectionnez « Appliquer un arc-en-ciel LUT au canal ratio ». Remarque : Pour un enregistrement avec un ratio de base moyenne de 0,3 (faible Ca2 +) et un ratio maximum de 2-3 (forte Ca2 +), une table de recherche appropriée serait de 0 (bleu) de 1 (rouge).</li>
	<li>Générer un canal de Ratio de moduler l’intensité à l’aide de la chaîne de mCherry (Figure 4D). Le canal de Ratio d’intensité modulée est une image des millions-de-couleurs où la couleur du ratio est mappée sur la luminosité du canal mCherry.</li>
	<li>Sous l’onglet « Mesures », créez un protocole de recherche d’objet en faisant glisser l’outil « Trouver des objets à l’aide d’intensité » pour le volet « Protocole ». Cliquez sur le « pignon » pour définir la fenêtre de mCherry valeurs d’intensité et de trouver des objets.<ol>
<li>Sélectionner l’intensité des valeurs ≥ 2 déviations standard (SD) au-dessus de fond (par exemple, le seuil de ~ 2 500, limite supérieure de 65 535). Vérifiez que la terminaison présynaptique est détectée et que « mettre à jour automatiquement vos commentaires » est sélectionné dans le menu de mesures. Remarque : Le logiciel peut également identifier des objets par leur écart d’arrière-plan à l’aide d’un protocole connexe « SD intensité. » Toutefois, si un objet particulièrement lumineux pénètre dans le champ de vision, il peut considérablement changer l’intensité moyenne pendant ces intervalles, affectant les seuils d’intensité utilisées pour trouver le HSN. Cette variabilité n’aura pas lieu si les valeurs d’intensité brute sont utilisées pour trouver des objets.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter des filtres supplémentaires ciblant uniquement le canal mCherry (taille, intensité Max, etc.) si nécessaire afin d’exclure les objets indésirables comme la tête, la queue et gut fluorescence. Sélectionnez « Rendre mesure Item » dans le menu de Mensurations et choisissez « Tous les points. » Remarque : Cela s’exécute le protocole, toutes les mesures d’écriture dans un fichier de valeurs séparées par des virgules (.csv) qui doit être exporté à l’aide de la commande « export » dans le menu fichier.</li>
	<li>Ouvrir le fichier exported.csv et copiez validant, zone (µm2), moyenne (rapport / canal), centre de gravité X (µm) et données centroïde Y (µm) dans une nouvelle feuille. A.csv fichier d’exportation sans en-têtes de colonne. Le logiciel ratiométrique quantification peut qualifier un ou plusieurs objets par validant une cellule d’intérêt.<ol>
<li>Pour recombiner ces objets, utiliser un script personnalisé « AnalzyeGCaMP_2017.m ». Remarque : Le script aussi identifie Ca2 + (ratio) des pics dans les données et enregistre le fichier a.csv de leurs points, les amplitudes de pic et largeur des pics. Il génère également des fichiers postscript pour les traces de ratio brut et annoté. Avec cette information, Ca2 + transitoire amplitude et intervalle inter transitoire doivent être déterminées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter la sortie X et Y les valeurs centroïde de chaque objet de fluorescence aux valeurs X et Y enregistrés par le script de XY-stade de bonsaï. Utiliser la position XY nette pour générer une trace de locomotion ver et pour calculer le déplacement de la cellule et de la vitesse qui accompagnent un comportement différent États31.</li>
	<li>Importer les images de fond clair enregistré dans ImageJ comme une pile virtuelle. Annoter les événements de ponte et autres comportements. Comparez le calendrier de ces événements avec Ca2 + pics de la trace de ratio.</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’aucun intérêts contradictoires n’existent.

Transgènes :
Parce que mCherry expression a été améliorée par l’insertion de codon-optimisation et intron (et plus disponible GCaMP journalistes ne l’ont pas), injecter ~ 4 fois le montant du plasmide exprimant le GCaMP5 afin d’assurer un niveau comparable de GCaMP5 fluorescence lors de forte Ca 2 + transitoires. Sauvetage de la mutation lin-15(n765ts) permet la récupération facile des animaux transgéniques avec des effets minimes sur la ponte et autres comportements35. Transgènes devrait être intégrée afin d’assurer une expression uniforme et imagerie conditions entre différents animaux25. Les marqueurs optionnels dont la résistance aux antibiotiques36,37 et le sauvetage de thermosensibles létaux38 devraient également fonctionner, mais, parce que les animaux non transgéniques sont morts, confirmation de l’intégration du transgène et homozygotie est plus difficile par rapport aux marqueurs qui présentent un phénotype visible25. Des marqueurs dominants qui perturbent la locomotion normale et diminuent de remise en forme, telles que rol-6(dm), devraient être évitées39. Imagerie dans le lite-1 mutant fond est essentiel de réduire réponses bleue légère fuite lors d’imagerie23,40,41. Mutation supplémentaire de gur-3, qui agit en parallèle au lite-1, peut réduire davantage le comportement résiduel et des changements physiologiques causés par la lumière bleue42. Idéalement, gur-3, 1-liteet lin-15 sont toutes situées sur la moitié droite du chromosome X, qui devrait simplifier la construction de nouvelles souches de Ca2 + imagerie et expériences d’optogenetic.
Parce que le temps d’exposition sont courtes et les images sont recueillies à 20 Hz, signaux GCaMP5 et mCherry doivent être lumineux. L’explication la plus plausible pour bruyant Ca2 + enregistrements est dim fluorescence provoquée par l’expression du Rapporteur faible. Promoteurs devraient aussi être raisonnablement spécifiques pour la région étant imagée. Parce que le corps cellulaire HSN et synapses sur les muscles vulvaires sont au centre du corps, expression supplémentaires provenant du promoteur de la PNL-3 dans la tête et la queue est généralement en dehors du champ de vision et ne peut être exclue à l’aide de filtres supplémentaires dans le Logiciel de quantification ratiométrique. Faire en sorte que les changements observés dans GCaMP5 résultat de fluorescence de changements réels dans intracellulaire Ca2 +, contrôle transgènes exprimant des GFP au lieu de GCaMP5 doivent être préparés de manière indépendante et analysé26. Plus récent Ca2 + reporters avec différentes sensibilités2 + Ca, cinétique et couleurs ont élargi le choix des outils disponibles d’imagerie, mais chaque nouveau journaliste doit être validée à l’aide du Ca2 +-indépendante de la variante fluorescent14 ,,16.
Médias :
Plaques NGM pour l’imagerie doivent être établis avec l’agar de haute qualité. Gélose de qualité inférieure ne se dissoudront pas complètement à l’autoclavage, laissant de petites particules éparpille la lumière au cours de l’imagerie et en augmentant la fluorescence de fond. Biologie moléculaire grade agarose peut être utilisé à la place, mais la quantité ajoutée devrait être réduite afin de maintenir la fermeté de la plaque équivalent.
Comparaisons à d’autres méthodes de montage :
Approches précédentes à l’activité d’image dans le circuit de comportement de Ponte ont utilisé vers immobilisée avec colle à un coussin de gel d’agarose. Sous ces conditions, l’activité du circuit et la comportement de Ponte ne sont pas favorisées sans réduction de milieux de culture d’osmolarité8,10,44,45. Récentes indiquent que plusieurs comportements de ver sont modulés par l’état de la locomotion, suscitant des interrogations sur la relation de l’activité des cellules observées chez les animaux immobilisés à celle observée en comportement librement les animaux. Nous avons récemment démontré que l’activité circuit Ponte est inopinément progressivement avec locomotion26,27. De même, compartimentée Ca2 + signalisation dans l’interneurone RIA intègre l’activité des neurones sensoriels et des motoneurones tête au cours de mouvements46de recherche de nourriture. Comportement de défécation est également accompagnée d’un changement de locomotion qui permet aux animaux de s’éloigner de leur place en quête de nourriture avant d’expulser les déchets47précis et stéréotypé. Ensemble, ces résultats suggèrent que les enregistrements brèves de l’activité de circuit d’animaux immobilisés peuvent être fondamentalement différents de ceux obtenus en comportement librement les animaux.
Bien qu’il soit directement sous un lamelle couvre-objet, comportement du ver ressemble à celle observée sur des plaques NGM standard. Allument œufs à éclore, et la petite quantité d’aliments déposés permet à la larve L1 à devenir des adultes (données non présentées). La taille de segment grande agar permet les échanges gazeux raisonnable et résiste à la déshydratation, bien que trop de nourriture augmentera la fluorescence de fond. Tandis que cette méthode fonctionne mieux pour les adultes, la technique peut également servir aux animaux L4 image. Cependant, l’épaisseur de la couche aqueuse entre le segment et la lamelle est telle que les larves plus petites ont du mal à ramper et peuvent souvent être retenus à la suite d’un mouvement adulte.
Une limitation de cette technique de montage qu’une stimulation mécanique ou chimique directe à des régions précises du corps est difficile. Développements récents dans les techniques d’illumination à motifs permettent la détection de la fluorescence de la GCaMP/mCherry dans le rappot48,49et l’excitation séparée de tête ou de queue-exprimé des opsines microbiennes avec éclairage séparé. Par conséquent, il peut être possible de surmonter ce problème en utilisant des approches optogenetic.
Comparaisons avec les autre Ca 2 + Méthodes d’imagerie :
Cette méthode fonctionne très bien pour l’enregistrement des changements cytoplasmiques Ca2 + du monophasé, résolu de cellules et leurs régions synaptiques. Imagerie en temps réel, volumétrique des neurones dans la tête a récemment obtenu à l’aide de la position des noyaux de la cellule pour l’identification de la cellule et à quantifier les changements de calcium nucléoplasmique50,51,52. On ne sait pas la relation entre nucléaire et synaptique Ca2 + . Nos résultats suggèrent que les variations plus remarquables HSN intracellulaire Ca2 + se produisent à des terminaisons présynaptiques loin le soma de la cellule (Figure 4). Les terminus présynaptiques de la RSH et les neurones de VC sont incorporés dans les muscles vulvaire postsynaptique26. On ne sait ne pas s’il y aurait une résolution suffisante dans la dimension Z même avec tourne disque ou techniques de la nappe de lumière d’attribuer les signaux présynaptiques de Ca2 + des cellules sans dépendre d’une certaine façon calcium somatique pour identification de la cellule . En utilisant les techniques décrites ici, chaque 10 min, les deux canaux d’enregistrement avec 12 001 256 x 256 images au format TIFF 16 bits de pixel est ~ 4 GB. Le ratio modulé ratio et l’intensité des canaux double la taille du fichier à ~ 8 GB. Une expérience typique d’enregistrement 10 animaux de chacun des deux génotypes (sauvage et expérimentales) génère près de 150 Go de données primaires et requiert 20 h pour recueillir et analyser. Analyses de volumétrie avec 10 tranches de Z par validant exigerait un ordre de grandeur plus de données et de temps analytique, à expliquer pourquoi si peu de ces études ont été réalisées.
Matériel :
Nous enregistrer et analyser les séquences d’images sur les stations de double processeur de hautes performances cartes graphiques (par exemple, les jeux), 64 Go de RAM, et disques de SSD hautes performances (voir Table des matières). Données devraient être stockées sur le réseau baie redondante de disques indépendants (RAID) et sauvegardées sur le nuage dans un centre de données hors site.
Nous recommandons l’utilisation haute puissance collimaté LEDs pour l’excitation de fluorescence pulsé sur halogénures métalliques ou de sources lumineuses à base de mercure. Il existe plusieurs systèmes de LED multicolores disponibles dans le commerce. Alors que certains de ces systèmes de LED ont un coût initial plus élevé, ils ont une longue durée (> 20 000 h) peuvent, en même temps exciter quatre ou plusieurs fluorophores différents et offrent un contrôle temporel précis à l’aide d’une série ou l’interface TTL avec une faible latence (passer de 10 à 300 µs temps). Déclenchement, s’assure que l’échantillon s’allume uniquement lorsque les données sont recueillies en fait. En général, nous utilisons une exposition de 10 ms toutes les 50 ms (taux de douane de 20 %). Cela réduit la phototoxicité et flou de mouvement lors de la capture de l’image, comme indiqué précédemment43.
Nous utilisons des caméras de sCMOS pour leur vitesse et leur large gamme de pixels petits, sensibles. Une caméra CCD-EM est une solution plus coûteuse, mais les effets « bloom » peuvent se traduire par des photoélectrons capturés de se jeter dans les pixels adjacents. Nouvelles caméras sCMOS rétro-éclairé ont une photosensibilité similaire des EM-CCD à un coût considérablement réduit. Sans se soucier capteur qui est utilisé, les canaux GCaMP5 et mCherry doivent être obtenus simultanément. Séquentiel capture en se déplaçant vers se traduira impropres à être ratiométrique dosage mal enregistrés images. L’imagerie bicanal est possible sur une seule caméra après fractionnement de canaux à l’aide d’un séparateur d’image (Figure 2) ou à l’aide de deux caméras identiques. La plage dynamique des images 16 bits est préférable à des images 8 bits pour le dosage précis ratiométrique. Pour les images de fond clair de comportement de ver, nous capturons utilisant une caméra 1 po 4,1 MP proche infrarouge USB3 pour intercepter les grandes séquences de 1 024 x 1 024 8-bit image jumelées 2 x 2 après compression JPEG. Le champ de vision plus grand disponible sur les modèles plus récents de microscope permet un ver adulte à visualiser à 20 x après 0,63 x demagnification avec seulement léger vignettage (Figure 4E).
Nous recommandons l’utilisation des signaux de tension TTL standard pour synchroniser l’illumination et la capture de l’image. En raison de latences potentiels dans les différents logiciels, nous vous recommandons d’utilisateurs configurer la caméra à fluorescence avec sorties maître avec sorties TTL conduite tous les autres appareils. De cette façon, les informations de position fond clair et stade seront recueillies pour chaque mesure de Ca2 + .
Fente ou résonantes point à balayage confocal microscopes on trouves généralement dans la salle de bains commune confocale donnent également excellente performance au cours de ratiométrique Ca2 + imagerie. Ces instruments peuvent servir à capturer deux ou plusieurs canaux de fluorescence avec fond clair24. Dans ce cas, il convient d’ouvrir le trou d’épingle confocal à son diamètre maximal, et un détecteur spectral doit être utilisé pour séparer les signaux infrarouges fond clair, mCherry et GCaMP5. Cela maximise la collecte lumineuse d’une épaisse (~ 20 µm) tranche tout en autorisant le rejet de la fluorescence d’out-of-focus. Un inconvénient est le champ de vision plus petit et davantage de restrictions pour la personnalisation de matériel et de logiciels.
Logiciel :
La plupart des fabricants livrer et installer leurs caméras et microscopes avec un logiciel propriétaire, y compris la configuration de déclenchement des entrées et sorties. Les caractéristiques et les performances de ce logiciel au cours de l’enregistrement peuvent varier. Parce que le déplacement rapide vers peut être difficile à suivre, image affichage pendant l’enregistrement doit être lisse et stable à 20 Hz. Pour améliorer les performances, séquences d’images peuvent être temporairement enregistrées dans la mémoire RAM avec des sous-ensembles pertinents sur le plan comportemental, enregistrés à la fin de l’expérience. Ces fichiers de séquence image deux canaux peuvent être convertis au format Image Cytometry Standard ouvert (.ics) à l’importation dans le logiciel ratiométrique quantification. OME-TIFF est un format open source image plus récent, bien que différentes installations peuvent être impossible d’enregistrer des séquences d’images TIFF supérieure à 4 Go.
Un élément clé de l’oléoduc de quantification est la génération de la chaîne de ratio et ensuite une procédure de segmentation d’image impartiale utilisant la fluorescence mCherry pour rechercher les cellules d’intérêt. De chaque objet trouvé, la taille de l’objet, la position du centre de gravité XY et le minimum, moyenne, et on calcule les valeurs d’intensité de fluorescence maximale pour chaque canal (y compris le canal de ratio). Ensemble, ces valeurs sont utilisées pour quantifier les variations intracellulaires Ca2 + à chaque validant dans l’enregistrement. Mesures de l’objet pour chaque validant sont ensuite exportés dans le fichier a.csv pour les analyses suivantes.
Une limitation majeure du protocole décrit ici est la dépendance sur le transfert des données sous différentes formes à travers un patchwork de produits logiciels. Une irritation supplémentaire est que certains des logiciels open source et gratuit alors que d’autres sont fermés, coûteux et inégalement mis à jour. Une amélioration majeure consisterait à utiliser ou développer un morceau de logiciel (idéalement open source) qui fournit des niveaux similaires de performance et de facilité d’utilisation de l’acquisition à l’analyse. Tel que noté ci-dessus, analyse logométrique double la taille du fichier et le temps requis pour compléter une expérience. Génération de pilotes de l’appareil qui peut être intégré dans les cadres personnalisables par l’utilisateur comme Bonsai permettrait aux images et autres flux de données à recueillir et à analyser en débit en temps réel, améliorer considérablement.
Perspectives d’avenir :
Tandis que nous suivons généralement les mouvements ver manuellement, suivi du centroïde ver détecté dans enregistrements infrarouge lumineux - ou fond noir devrait permettre des nœuds qui fournissent le réglage de la boucle fermée de position allure et automatisé de traitement d’image supplémentaire suivi (Figure 3 et données non présentées). La majorité des enregistrements fluorescence obtenus avec cette méthode est foncée et dépourvue de biologiquement intéressantes données. Sur capteur ou en temps réel après l’acquisition image processing techniques qui récolte des séquences d’images d’objets pertinents serait permettant un accroissement de la résolution spatiale et accélérer le pipeline d’analyse de données, en particulier si Z-tranches supplémentaires sont collectées pour chaque validant pour visualiser l’activité au sein de toutes les cellules préalables- et post-synaptiques dans le circuit.

Un objectif central des neurosciences est de comprendre comment les neurones communiquent dans les circuits de comportement animal en voiture. Circuits neuronaux intègrent un éventail de divers indices sensoriels afin de changer l’activité circuit, ainsi conduire les changements de comportement nécessaires aux animaux pour répondre à leurs environnements. Le nématode c. elegans, a un système nerveux simple avec 302 neurones dont les connexions synaptiques ont été entièrement cartographiée1. En outre, les gènes qui codent pour des protéines impliquées dans la neurotransmission sont hautement conservées entre c. elegans et mammifères2. Malgré la simplicité anatomique de son système nerveux, il affiche un Répertoire complex de comportements conservés offrant une plateforme fertile pour comprendre comment les neurones régulent comportement3.
C. elegans est favorable à l’application d’un large éventail d’approches comme la manipulation génétique, l’ablation laser cell, techniques électrophysiologiques, comme in vivo optique d’imagerie4,5. De récentes études ont produit des cartes détaillées de la neurotransmetteur majeur chez c. elegans , y compris les cholinergiques et réseaux de neurones GABAergiques, les systèmes de signalisation. Ces études, ainsi que des études en cours à la carte de l’expression de tous les neurones G-récepteurs couplés aux protéines placent ce modèle dans une position unique pour tirer parti structural très détaillée et la connectivité neuronale fonctionnelle des cartes afin de bien comprendre comment ces signal de neurotransmetteurs différents par le biais de récepteurs différents et les délais de route différents aspects du comportement animal.
Afin d’étudier les profils d’activité neuronale dynamique dans n’importe quel système, une condition préalable essentielle est de développer des méthodologies robustes pour enregistrer l’activité de neurones individuels ou circuits tout au cours de comportements. Particulièrement importante est la susceptibilité de ces approches optiques pour visualiser l’activité présynaptique qui entraîne la fusion des vésicules synaptiques. Rapides et hautement sensibles reporters fluorescents d’intracellulaire Ca2 +, ainsi que la disponibilité croissante des photo-récepteurs sensibles, ont révolutionné l’enregistrement de la cellule et l’activité synaptique chez l’animal éveillé, vivant au cours de comportement. Parce que des principaux résultats de l’activité synaptique électrique doit régler les canaux Ca2 + , variations intracellulaires Ca2 + sont censées signaler fidèlement les modifications pertinentes sur le plan comportemental dans l’activité des cellules.
Dans cette étude, nous présentons une méthode pour exécuter ratiométrique Ca2 + imagerie dans les neurones sérotoninergiques HSN moteur qui favorisent le comportement de ponte dans c. elegans6,7. Cette approche s’appuie sur des efforts antérieurs de visualiser Ca2 + activité chez c. elegans et le circuit de ponte au cours de comportement5,8,9,10,11 . La méthode permet de corréler simultanément les changements observés dans l’activité cellulaire/circuit avec les événements de Ponte, ainsi que changements dans l’État locomoteur animal. Bien que cette approche nous permet d’étudier l’activité dans les vers adultes, œuvre inédite dans notre laboratoire montre que cette approche peut être étendue aux animaux juvéniles au quatrième (L4) stade larvaire ainsi. Il est probable que l’activité d’autres neurones de c. elegans qui fonctionnent dans les circuits distincts et comportements doit être de même accessible avec cette technique. Autre développé récemment rapide Ca2 + indicateurs avec non-cumul des spectres d’émission12,13,14,15,16, optogenetic outils17 et génétiquement codé optiques indicateurs de tension de membrane18, devrait nous permettre d’effectuer des enquêtes « tout-optique » pénétrants sur comment les changements dans l’activité des circuits neuronaux conduire États un comportement distinct.

<table><tbody><tr><td><forte>C. elegans croissance, culture et montée</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli souche bactérienne, OP50</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>OP50</td><td>Nourriture pour C. elegans. Uracil auxotrophe. E. coli B. Niveau de biosécurité 1</td></tr><tr><td>HSN GCaMP5+mCherry worm strain</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>LX2004</td><td>Transgène intégré utilisant le promoteur nlp-3 pour piloter l’expression de GCaMP5 et mCherry dans HSN. Génotype complet :&nbsp ; vsIs183 [nlp-3p ::GCaMP5 ::nlp-3 3'UTR + nlp-3p ::mCherry ::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X</td></tr><tr><td>lite-1(ce314), lin-15(n765ts) souche mutante pour la préparation de transgènes</td><td>auteur</td><td>LX1832</td><td>Souche pour la récupération de transgènes à haute copie après micro-injection avec pL15EK lin-15(n765ts) souche de secours. Porte également la mutation liée lite-1(ce314) qui réduit la sensibilité à la lumière bleue. Disponible auprès de l’auteur sur demande</td></tr><tr><td>pL15EK lin-15a/b plasmide de sauvetage génomique</td><td>auteur</td><td>pL15EK</td><td>Plasmide de sauvetage pour la récupération d’animaux transgéniques après injection dans la souche LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X. Disponible auprès de l’auteur sur demande</td></tr><tr><td>Plasmide pKMC299 Plasmide</td><td></td><td>pKMC299</td><td>pour l’expression de mCherry dans les HSN du promoteur nlp-3. Has nlp-3 3' région non traduite</td></tr><tr><td>pKMC300 auteur du plasmide</td><td></td><td>pKMC300</td><td>Plasmide pour l’expression de GCaMP5 dans les HSN à partir du promoteur nlp-3. A nlp-3 3' région non traduite</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium Monobasique</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium Dibasique</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium Heptahydrate</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Alfa Aesar</td><td>12312</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211820</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Agar, bactériologique de type A, Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 60 mm</td><td>VWR</td><td>25384-164 ;</td><td>Pour la préparation des plaques NGM</td></tr><tr><td>24 verres de protection micro de 60 mm, #1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td>Verre de protection à travers lequel les vers sont imagés</td></tr><tr><td>Verres de protection 22 x 22 mm, #1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Verre de couverture qui couvre le haut du morceau de gélose</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope avec base en lumière transmise</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Microscope de dissection pour l’entretien, la mise en scène et le montage</td></tr> du <tr><td>fil d’iridium de platine, (80:20), 0,2 mm</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA39526-BW</td><td>Pour le transfert de ver</td></tr><tr><td>Microscope d’imagerie calcique</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Table à air anti-vibration</td><td>TMC</td><td>63-544</td><td>Table de laboratoire Micro-g' Table anti-vibration 30 » x 48 » avec CleanTop M6 de 4 » sur le dessus</td></tr><tr><td>Microscope composé inversé</td> de 25 mm <td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Axio Observer.Z1 inversé microscope</td></tr><tr><td>Sideport L80/R100 (3 positions)</td><td>Zeiss</td><td>425165-0000-000</td><td>Pour détourner 20 % de la sortie vers la caméra à fond clair (CMOS), 80 % vers la caméra à fluorescence (sCMOS)</td></tr><tr><td>Incline Back Éclairage Carrier</td><td>Zeiss</td><td>423920-0000-000</td><td>Pour l’imagerie infrarouge/comportementale</td></tr><tr><td>Boîtier de lampe 12V/100W avec collecteur</td><td>Zeiss</td><td>423000-9901-000</td><td>Pour l’imagerie infrarouge/comportementale</td></tr><tr><td>Lampe halogène 12V/ 100W</td><td>Zeiss</td><td>380059-1660-000</td><td>Pour l’imagerie infrarouge/comportementale. Les LED à lumière blanche n’émettent pas de lumière infrarouge significative, elles ne permettront donc pas l’imagerie en fond clair après le filtre passe-bande infrarouge</td></tr><tr><td>32 mm Filtre passe-bande infrarouge (750-790 nm) pour lampe halogène</td><td>Zeiss</td><td>447958-9000-000</td><td>BP 750-790 ; DMR 32mm, pour l’éclairage infrarouge pour les champs clairs et le comportement</td></tr><tr><td>Tourelle de condenseur à 6 filtres (LD 0.55 H/DIC/Ph), motorisée</td><td>Zeiss</td><td>424244-0000-000</td><td>Pour l’imagerie infrarouge/comportementale</td></tr><tr><td>Condenseur & Obturateur</td><td>Zeiss</td><td>423921-0000-000</td><td>Pour l’imagerie infrarouge/comportementale</td></tr><tr><td>Oculaire binoculaire avec phototube pour caméra CMOS infrarouge</td><td>Zeiss</td><td>425536-0000-000</td><td>Pour l’imagerie infrarouge/comportementale</td></tr><tr><td>Oculaire 10x, 23mm</td><td>Zeiss</td><td>444036-9000-000</td><td>Pour la localisation des vers sur le morceau de gélose</td></tr><tr><td>Adaptateur de monture C Grossissante 2/3" 0,63x</td><td>Zeiss</td><td>426113-0000-000</td><td>Monture pour Caméra CMOS infrarouge</td></tr><tr><td>Caméra CMOS pour fond clair et comportement infrarouge (capteur 1")</td> <td>FLIR (anciennement Point Grey Research)</td><td>GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>Caméra pour l’imagerie en fond clair</td></tr><tr><td>Carte contrôleur hôte USB 3.0</td><td>FLIR (anciennement Point Grey Research)</td><td>ACC-01-1202</td><td>Fresco FL1100, 4 ports</td></tr><tr><td>8 broches, câble GPIO de 1 m, connecteur circulaire Hirose HR25</td><td>FLIR (anciennement Point Grey Research)</td><td>ACC-01-3000</td><td>Câble pour déclenchement TTL. Le fil vert se connecte à GPIO3 / Broche 4 et le fil marron se connecte à la terre / Broche 5</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td>Meilleure combinaison de grossissement, d’ouverture numérique et de distance de travail</td></tr><tr><td>Tourelle réflecteur à 6 cubes, motorisée</td><td>Zeiss</td><td>424947-0000-000</td><td>Pour l’imagerie de fluorescence</td></tr><tr><td>Train de lumière à fluorescence, motorisé</td><td>Zeiss</td><td>423607-0000-000</td><td>Pour l’imagerie par fluorescence</td></tr><tr><td>Obturateur de fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>423625-0000-000</td><td>Pour l’imagerie par fluorescence</td></tr><tr><td>GFP et mCherry double excitation et cube de filtre d’émission (pour microscope)</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>FL Jeu de filtres 62 HE BFP+GFP+HcRed pour l’imagerie par fluorescence</td></tr><tr><td>Système d’éclairage LED</td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Système LED Colibri.2 déclenchable pour éclairage fluorescent</td></tr><tr><td>Module LED GFP (470 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td>Colibri.2 LED pour excitation de fluorescence GFP</td></tr><tr><td>Module LED mCherry (590 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9082-000</td><td>Colibri.2 LED pour excitation de fluorescence mCherry</td></tr><tr><td>Curseur d’arrêt de l’iris pour équipement d’éclairage incident</td><td>Zeiss</td><td>000000-1062-360</td><td>Iris d’ouverture de champ pour limiter l’éclairage LED au champ de vision</td></tr> <tr><td>de la caméraAdaptateur monture C 1" 1.0x</td><td>Zeiss</td><td>426114-0000-000</td><td>Adaptateur pour séparateur d’images et caméra à fluorescence sCMOS</td></tr><tr><td>Séparateur d’images</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Gemini W-View, d’autres séparateurs d’images peuvent être utilisés, mais ils peuvent ne pas être optimisés pour la grande taille du capteur des caméras sCMOS</td></tr><tr><td>GFP / mCherry miroir dichroïque (séparateur d’images)</td><td>Semrock</td><td>Di02-R594-25x36</td><td>Séparation GCaMP5 de mCherry et infrarouge signaux</td></tr><tr><td>Filtre d’émission GFP (séparateur d’image)</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30-25</td><td>Capture de la fluorescence GCaMP5</td></tr><tr><td>mCherry/ Filtre d’émission (séparateur d’image)</td><td>Semrock</td><td>FF01-647/57-25</td><td>Ce filtre est nécessaire pour exclure la lumière infrarouge utilisée pour l’imagerie en fond clair</td></tr><tr><td>Caméra sCMOS pour fluorescence (capteur 1")</td> <td>Hamamatsu</td><td>A12802-01 / C11440-22CU</td><td>Orca FLASH 4.0 V2. Les modèles plus récents permettent des paramètres d’acquisition d’images séparés sur des moitiés distinctes du capteur, permettant l’acquisition d’images à deux canaux en combinaison avec un séparateur d’images</td></tr><tr><td>Motorisé XY Stage</td><td>M&auml ; rzh&auml ; BALAYAGE utilisateur</td><td>IM 130 x 100</td><td>Mouvement de la platine ; la résolution XY de cette platine est de 0,2 & micro ; m par étape&nbsp ;</td></tr><tr><td>Contrôleur de scène XY avec joystick</td><td>LUDL</td><td>MAC6000, joystick XY</td><td>Suivi manuel des vers. MAC6000 contrôleur doit être connecté au PC via le port série (RS-232) configuré sur 115200 bauds</td></tr><tr><td>Carte d’acquisition numérique (DAQ)</td><td>Arduino</td><td>Uno</td><td>La réception des déclencheurs TTL de la caméra sCMOS. L’Uno doit être chargé avec le boîtier standard Firmata et le port USB de l’ordinateur configuré pour 57600 bauds</td></tr><tr><td>BNC Câble mâle vers BNC mâle - 6 pieds</td><td>Hosa Technology</td><td>HOBB6</td><td>Connecteurs BNC pour déclenchement TTL</td></tr><tr><td>Câble coaxial BNC mâle vers SMA mâle plaqué or (8.8")</td><td>uxcell</td><td>608641773651</td><td>Pour connecter les sorties de déclenchement de la caméra de fluorescence</td></tr><tr><td>BNC adaptateur de tête tournante</td><td>Hantek</td><td>RRBNCTH21</td><td>Adaptateur BNC vers prise banane (4mm)</td></tr><tr><td>Connecteur BNC femelle vers femelle</td><td>Diageng</td><td>20130530009</td><td>Adaptateur BNC femelle vers femelle pour connecter la sortie BNC de la caméra à la prise banane</td></tr><tr><td>Fils de liaison flexibles sans soudure</td><td>Z & T</td><td>GK1212827</td><td>Pour connecter les sorties de déclenchement BNC à l’ADQ Arduiono.&nbsp ; D’homme à homme.</td></tr><tr><td>Station de travail haute performance</td><td>HP</td><td>Z820</td><td>Windows 7, 64 Go de RAM, double processeur Xeon, disque SSD C :, port série (RS-232), plusieurs emplacements PCIe3 pour la connectivité Ethernet, cartes USB 3.0 et disques SSD supplémentaires</td></tr><tr><td>Disque SSD M.2</td><td>Samsung</td><td>MZ-V5P512BW</td><td>Streaming et analyse des données d’image Adaptateur</td></tr> de <tr><td>disque SSD M.2 pour stations de travail</td><td>Lycom</td><td>DT-120</td><td>Adaptateur M.2 vers PCIe 3.0 4 voies</td></tr><tr><td>Stockage en réseau</td><td>Synology</td><td>DS-2415+</td><td>Stockage et analyse de données d’imagerie</td></tr><tr><td>Disques durs</td><td>Western Digital</td><td></td><td>WD80EFZX RED 8 To, 5400 tr/min Classe SATA 6 Gb/s 128 Mo Cache 3,5 pouces. Stockage des données d’imagerie (10 disques + 2 disques redondants)</td></tr><tr><td><Logiciel >fort</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition de fluorescence Hamamatsu</td><td></td><td>HCImage DIA</td><td>Enregistrement de séquences d’images de fluorescence à deux canaux (GCaMP5 et mCherry) à 20 ips Acquisition</td></tr> en <tr><td>fond clair</td><td>FLIR (anciennement Point Grey Research)</td><td>Flycapture</td><td>Enregistrement de séquences</td></tr> <tr><td>d’images JPEG en fond clairStage Serial Port Reader</td><td>Bonsai</td><td>https://bitbucket.org/horizongir/bonsai</td><td>Facilite le suivi des vers pendant le comportement Logiciel de</td></tr><tr><td>contrôleur LED</td><td>Zeiss</td><td>Micro Toolbox Test 2011</td><td>Pour configurer l’intensité et les entrées de déclenchement pour les différentes LED de l’unité Colibri.2</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp ;</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td>Examen simple des séquences d’images et des modifications de formatage pour l’importation dans le logiciel de quantification ratiométrique</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>. 2002984-001-000001</td><td>Pour générer des sous-ensembles de données de valeurs séparées par des virgules à partir de la volocité pour l’analyse MATLAB</td></tr><tr><td>Recherche de pics</td><td>MATLAB</td><td>R2017a</td><td>Script utilisé pour le calcul des caractéristiques de pic de rapport</td></tr><tr><td>Quantification ratiométrique</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Facilite le calcul des canaux d’image ratiométriques, la segmentation d’images pour la recherche d’objets et la mesure du rapport des objets trouvés</td></tr><tr><td>Scripts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY-stage-final.bonsaï</td> Le <td>lecteur de port série de DAQ et de position de scène déclenché par Bonsai TTL</td><td></td><td>enregistre la position de la scène X et Y (en microns) lorsque l’Arduino connecté reçoit un signal TTL positif de la caméra sCMOS pendant l’exposition de l’image. Le script écrit un fichier .csv avec quatre colonnes : numéro d’image, position X (microns), position Y (microns) et temps écoulé entre les images (généralement ~50 ms lors d’un enregistrement à 20 ips).&nbsp ; Les positions de scène X et Y de cette sortie (colonnes 2 et 3, respectivement) sont ajoutées aux positions du centroïde X et Y du script MATLAB AnalyzeGCaMP_2017.m (colonnes 4 et 5, respectivement), afin de donner les positions X et Y finales de l’objet fluorescent pour l’enregistrement.</td></tr></tbody></table>

imagerie ratiométrique calcium des neurones individuels en comportement caenorhabditis elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Il est devenu de plus en plus évident que l’activité circuits neuronaux en comportement animaux diffère considérablement de celle observée chez les animaux anesthésiés ou immobilisés. Très sensibles, génétiquement encodés reporters fluorescents de Ca2 + ont révolutionné l’enregistrement de la cellule et l’activité synaptique en utilisant des approches optiques non invasif chez les animaux de se comporter. Lorsqu’il est combiné avec la génétique et optogenetic techniques, les mécanismes moléculaires qui modulent l’activité cellulaire et circuit au cours d’un comportement différent États peuvent être identifiés.
Nous décrivons ici les méthodes ratiométrique Ca2 + imagerie des neurones en comportement librement vers Caenorhabditis elegans . Nous démontrons une technique de montage simple qui doucement vers de superpositions de plus en plus sur une gélose de nématode croissance Media (NGM) standard bloquent avec une lamelle de verre, permettant des animaux à être enregistré à haute résolution au cours de la libre circulation et le comportement. Avec cette technique, nous utilisons le sensible Ca2 + journaliste GCaMP5 pour enregistrer les modifications en intracellulaire Ca2 + dans l’Hermaphrodite spécifique des neurones sérotonergiques (HSNs) car ils roulent le comportement de ponte. En exprimant co mCherry, un Ca2 +-indépendante de la protéine fluorescente, nous pouvons suivre la position de la rsh dans ~ 1 µm et correcte des fluctuations causées par les changements de focus ou mouvement de fluorescence. L’imagerie simultanée, infrarouge fond clair permet pour comportement d’enregistrement et de suivi des animaux à l’aide d’une platine motorisée. En intégrant ces techniques microscopiques et les flux de données, nous pouvons enregistrer Ca2 + activité dans le circuit de Ponte de c. elegans comme il progresse entre les États actif et inactif de comportement sur des dizaines de minutes.

La technique de montage simple décrite ici (Figure 1) provoque des changements minimes à l’environnement de la culture de L4 et adultes c. elegans tout en permettant à haute résolution d’enregistrement en comportement animal par une lamelle de verre (Figure 4). Synchronisation des sources de lumière LED, contrôleurs de scène et expositions de caméra permettant des recherches pour l’acquisition de plusieurs cours d’eau à 20 images/s jusqu'à 1 h. intermédiaire grossissement (x 20) avec les objectifs d’ouverture numérique élevée (0,7-0,8) fournit bonne résolution spatiale de la région synaptique dans le circuit de comportement Ponte, même avec 4 x 4 pixels binning (1,25 µm/pixel). Acquisition simultanée de signaux de fluorescence GCaMP5 et mCherry (Figure 4A, B) est utilisée pour générer une chaîne de pixels ratio qui compense les changements dans les mouvements des animaux et de se concentrer (Figure 4D). La terminaison présynaptique HSN est aussi grande que les nombreux organismes de cellule neuronales chez c. eleganset variations présynaptiques HSN Ca2 + peuvent être clairement visualisées. Le grand champ de vision de la caméra infrarouge fond clair permet au ver de s’être suivis manuellement pendant l’enregistrement (Figure 4E). Pour chaque animal, changements Ca intracellulaire2 + peut être corrélée avec les comportements évidents en fond clair imagerie, y compris la libération des œufs et des changements dans la locomotion (Figure 4E).
Dosage du HSN Ca2 + et vitesse confirme que vers changent leur locomotion selon leur transition au comportement de ponte. Il y a des différences significatives dans la vitesse de la vis sans fin avant, pendant et après l’état actif Ponte (Figure 5A). Ce n’est pas causé par le bruit inhérent à l’imagerie ou le système de suivi. Zoom dans un événement de Ponte, on observe une forte variation GCaMP5 de fluorescence (ΔF/F) avant l’événement Ponte alors que mCherry fluorescence est relativement inchangé (Figure 5B). Les changements mesurés dans le rapport de GCaMP5:mCherry (ΔR/R) montrent clairement un HSN Ca2 + transitoire ~ 4 avant s Ponte (Figure 5B). Parallèlement à la contraction musculaire vulvaire, un ralentissement évident de locomotion ver se produit que se termine avec le œuf libère. Les résultats précédents ont montré que les neurones cholinergiques du moteur VC, qui sont innervés par les HSNs, montrent pic d’activité durant les contractions du muscle vulvaire fort et au cours de le œuf version 8,10,27. Nous avons également montré qu’optogenetic activation des neurones VC entraîne un ralentissement immédiat de la locomotion, ce qui suggère que les neurones VC peuvent être activées par la contraction musculaire vulvaire, ralentissant ainsi locomotion jusqu'à la réception des commentaires de Ponte27 .
L’imagerie et suivi de système décrite permet la visualisation de l’organisation spatiale du comportement de Ponte (Figure 5C). Comme précédemment indiqué, vers entrez pistes soutenues de locomotion avant juste avant l' état actif32. Les vers passent la majorité de leur temps à chercher leur nourriture sur les bactéries au centre du segment agar. Avant l’entrée dans l’état actif, worms s’éloigner de la nourriture, ce qui coïncide avec l’apparition des transitoires de rares HSN Ca2 + . Activité HSN transitions puis en tir rafale, avecplusieurs très rapprochées HSN Ca 2 + transitoires qui soutiennent des événements de ponte. Les vers puis souvent demi-tour, reprendre la locomotion avant et pondent des œufs sur le chemin du retour vers leur position de départ près de la bactérie OP50. Nous supposons que changements dans local O2 et/ou la concentration de CO2 peuvent être influencer où les vers décident de jeter des œufs33,,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> La figure 1. C. elegans montage technique d’imagerie à haute résolution de l’activité circuit et du comportement de ponte. Haut, le montage final du côté. En bas, le montage final vu à travers le fond de la grande lamelle. Les flèches indiquent OP50 alimentaire bactérienne, vers c. elegans et oeufs, pris en sandwich entre le bloc de gélose NGM et la lamelle de grand 24 x 60 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> Figure 2 . Widefield ratiométrique Ca2 + imagerie et le comportement d’enregistrement sur un microscope à épifluorescence inversé. (A) position de la vis sans fin et le comportement est capturée en fond clair via un 20 x (NA 0,8) objectif Plan-Apochromat utilisant la lumière infrarouge (750-790 nm) (flèches violettes) émise par une lampe halogène à travers le morceau NGM. Une manette de jeu et la platine motorisée contrôleur sert à maintenir le ver dans le champ de vision pendant l’enregistrement. Position d’allure (Δx, Δy) est envoyée au PC par le port série. GCaMP5 et mCherry des protéines exprimées dans le ver sont excités à l’aide de 470 nm (flèches bleues) et 590 nm (flèches jaunes) Diodes électroluminescente (del). Émis GCaMP5 (vert flèches) et mCherry (flèches orange) fluorescence avec la lumière infrarouge passe à travers un miroir Dichroique multibande (voir Table des matières). Un séparateur de faisceau de 80/20 envoie 20 % de la lumière à travers un demagnifer x 0,63 pour capture sur une caméra CMOS de sensible à l’infrarouge (flèche violette). Les 80 % restants de la lumière est envoyé à travers l’orifice latéral du microscope à un répartiteur d’image qui sépare le GCaMP5 et mCherry fluorescence sur séparer les deux moitiés d’une caméra sCMOS tout en éliminant la lumière infrarouge fond clair. Les données de ces deux caméras sont transférées à un PC via câble USB3. Les ports de déclencheur de l’appareil de sCMOS de fluorescence (bleu) sont utilisées pour envoyer + 5V TTL déclenche le système d’éclairage LED, la caméra CMOS infrarouge fond clair, et le dispositif d’Acquisition numérique (DAQ). (B) Trigger 3 sortie signaux TTL sont détectés par l’acquisition de données sur la broche numérique #8 et envoyés à l’ordinateur via une connexion USB. Ces entrées numériques déclenchent un ' où XY' commande série depuis un script de logiciel de Bonsai (XY-stade final) qui se lit position pour chaque image de fluorescence/infrarouge GCaMP5/mCherry capturé en scène X et Y. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> Figure 3 : Mise en page du script Bonsai communication série-stade XY-stade final. Le haut DigitalInput nœud (rose) lit déclencheurs TTL entrée en broche #8 de l’acquisition de données. Pour chaque tension TTL positive (verte), l’acquisition de données rend un timestamp (bleu) et écrit une chaîne de « Où XY ? » (rose) pour le contrôleur de scène via le port série (gris). Le nœud SerialStringRead (rose) lit que x et Y coordonnent la réponse du contrôleur de stage. Cette chaîne est ensuite convertie en microns et séparée en X et Y coordonnées de scène. Enfin, ces quatre filières sont combinées à l’aide d’un nœud de zip (bleu) et un fichier quatre column.csv est écrit : un nombre d’images des signaux TTL a reçu (nœud de la gamme, rose), les coordonnées X et Y et l’intervalle entre les points suivants (généralement ~ 50 ms Lorsque enregistrement à 20 Hz). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> Figure 4 : Représentant microscopie de fluorescence HSN et animaux fond clair lors de comportement de ponte. (A–D) Ratiométrique simultanée imagerie de fluorescence GCaMP5 et mCherry dans les HSNs juste avant la ponte. Termini présynaptique HSN est indiqués avec les pointes de flèches. (C) fusion de GCaMP5 et mCherry de fluorescence. Ratio (D) GCaMP5:mCherry modulé en intensité ; un rapport élevé (rouge) indique haute intracellulaire Ca2 + dans la terminaison présynaptique. (E) fond clair image du ver tout juste après que les œufs ont été pondus. Pointes de flèches indiquent les moitiés antérieures et postérieures de la vulve dont les œufs sont pondus. Barre d’échelle pour toutes les images est 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> Figure 5 : Enregistrement de HSN Ca2 + et locomotion vitesse durant le comportement de ponte. (A) les Traces de GCaMP5:mCherry des changements de rapport en réponse aux intracellulaire Ca2 + transitoires (ΔR/R ; rouge) ainsi que de la vitesse instantanée ver (µm/s, bleu). Événements Ponte sont indiqués par les flèches. (B) des Traces de fluorescence HSN GCaMP5 (vert ; ΔF/F), mCherry fluorescence (rouge ; ΔF/F), rapport de fluorescence GCaMP5:mCherry (black ; ΔR/R) et ver la vitesse (bleu) autour du moment de la ponte. (C) l’organisation spatiale des comportements de ponte et de la locomotion durant tout l’enregistrement de 10 min. La piste de ver a été obtenue d’après les informations de stade XY qui a été ajoutées au poste de centre de gravité de la HSN obtenu à partir de l’enregistrement de fluorescence mCherry. Le timing des transitoires HSN (cercles rouges), événements de Ponte (flèches noires) et le début et fin de l’enregistrement (losanges vert et bleu) sont indiqués. Barre d’échelle est 1 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit l’utilisation de codé génétiquement Ca2 + reporters de consigner les changements dans l’activité neuronale en comportement vers Caenorhabditis elegans .

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une imagerie calcique ratiométrique des effets du neurone spécifique hermaphrodite, ou activité HSN, sur le comportement de Caenorhabditis elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences comportementales sur la façon dont l’activité des circuits neuronaux produit des changements dans le comportement des animaux lorsque les animaux alternent entre les états comportementaux. Cette technique permet d’enregistrer les changements dans l’activité intracellulaire du calcium avec un rapport signal/bruit élevé, tout en suivant simultanément le comportement et la locomotion des animaux.Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’activité neuronale chez C. elegans, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes modèles transparents, y compris les larves de drosophile et les poissons zèbres. Les étudiants de Collin Labs feront une démonstration de la procédure avec moi : Richard Kopcock, Pravat Dhakal et Layla Nassar. Pour monter les animaux, appliquez d’abord de la nourriture bactérienne OP50 à partir d’une plaque de gélose de milieu de croissance de nématode à graines au fond d’une pioche à vers de platine et utilisez la pioche pour transférer environ 20 L quatre L à X 2 000 pour les animaux exprimant le rapporteur de calcium sensible GCaMP5 et mCherry dans HSN à partir du promoteur N-L trois P sur une plaque de milieu de croissance de nématode à graines.Confirmez la présence de la vulve en développement au microscope stéréoscopique sous la forme d’une tache sombre claire entourée d’un croissant blanc et incubez les vers à 20 degrés Celsius pendant 24 à 40 heures. À la fin de l’incubation, appliquer OP50 sur une nouvelle pioche et transférer trois vers dans une plaque de milieu de croissance de nématodes non ensemencée, laissant une petite portion de nourriture sur la nouvelle plaque pour que les vers se nourrissent pendant l’imagerie. Ensuite, à l’aide d’une spatule plate arrondie, coupez un morceau de 20 x 20 millimètres dans la plaque non ensemencée et placez le morceau, côté ver vers vers le bas, sur un bord d’une lamelle propre de 24 x 60 millimètres numéro 1,5.Ensuite, glissez soigneusement le morceau de gélose au centre de la lamelle et placez une lamelle numéro un de 22 x 22 millimètres sur le dessus de la pièce de gélose pour réduire le collage et l’évaporation. Pour configurer l’imageur, placez les vers sur la platine d’un microscope inversé et sélectionnez le 20x subjectif. Utilisez les oculaires binoculaires pour sélectionner un ver pour l’imagerie, faites glisser le filtre infrarouge et placez-le au-dessus du condenseur.Ouvrez un programme d’analyse vidéo approprié et exécutez le script de communication final de l’étape série XY. Cliquez sur CsvWriter et sélectionnez un dossier pour enregistrer les informations enregistrées sur les étapes X et Y. Ensuite, cliquez sur la flèche verte pour initialiser le dispositif d’acquisition numérique.Dans les paramètres du logiciel d’enregistrement par caméra infrarouge, sélectionnez Activer/désactiver la boîte de dialogue de contrôle de la caméra. Sélectionnez ensuite le menu Modes vidéo personnalisés, puis le mode 1 et le format Pixel Raw huit. Sous Trigger Stroke, réglez la ligne d’entrée de déclenchement sur trois, la polarité sur élevée et le mode sur 14.Bascule Activez cette option pour arrêter l’acquisition de l’image jusqu’à ce que le signal de déclenchement de tension soit reçu de la caméra fluorescente. Avec la fenêtre d’affichage des images ouverte, cliquez sur Enregistrer et sélectionnez le dossier d’enregistrement des séquences d’images. Sélectionnez le mode d’enregistrement tampon et enregistrez les images au format JPEG.Cliquez ensuite sur Démarrer l’enregistrement pour initialiser l’acquisition. Ensuite, ouvrez l’onglet Capture dans le logiciel d’acquisition de fluorescence et réglez le temps d’exposition sur 10 millisecondes, le binning sur quatre X et la profondeur d’image sur 16 bits. Sélectionnez un sous-réseau de caméra centré de 512 pixels de large sur 256 pixels de haut.Le programme divisera automatiquement l’image large en deux pour générer les canaux de fluorescence séparés. Cliquez sur Afficher les options de déclencheur de sortie et définissez tous les déclencheurs sur positif. Vérifiez que le premier déclencheur et le deuxième déclencheur sont réglés sur Exposition et que le troisième déclencheur est défini sur Programmable avec une période de 25 millisecondes.Ensuite, sous l’onglet Séquence, sélectionnez Time Lapse Sous Paramètres de balayage, réglez Field Delay one sur 50 millisecondes pour collecter des images à 20 hertz. Sélectionnez Enregistrer dans la mémoire tampon temporaire. Pour l’imagerie calcique ratiométrique, sous l’onglet Séquence, cliquez sur Démarrer pour commencer l’enregistrement et suivre le ver avec le joystick en gardant les cellules et les synapses de l’intérêt au centre du champ de vision.Au moment où l’enregistrement de la fluorescence est lancé, des déclencheurs sont envoyés à la caméra à fond clair en attente et au contrôleur de scène qui commencent à collecter des images synchronisées et la position de la scène. Cliquez sur le bouton Statistiques dans la fenêtre Histogramme pour afficher les statistiques de pixels pour chaque canal. Ajustez la puissance de la LED pour assurer un pixel unique maximal de floraison de mCherry à l’extrémité présynaptique supérieur ou égal à 8 000 points dans le canal rouge, ce qui donne une plage dynamique d’environ 12 bits au-dessus de l’arrière-plan.Les signaux rapporteurs de calcium à l’extrémité présynaptique au repos ou à un faible taux de calcium devraient être d’environ 2 500 dans le canal vert. Enregistrez le comportement jusqu’à ce qu’un état actif de ponte d’œuf soit atteint. Ensuite, enregistrez un sous-ensemble de 10 minutes contenant 6 000 images avant et 6 001 images après la première ponte.Prenez soin de conserver le même sous-ensemble d’images en fond clair du comportement du ver et des points temporels de la position de l’étage X-Y, sinon la synchronisation précise des flux de données sera perdue. Pour la segmentation d’image, importez les séquences d’images dans un logiciel de quantification ratiométrique approprié et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la série chronologique dans l’onglet séquence pour définir la série chronologique à 20 images par seconde et 1,25 micromètre par pixel. Dans le menu Outils, sélectionnez Ratio, puis mCherry pour le canal A et GCaMP5 pour le canal B, puis cliquez sur Calculer pour soustraire l’arrière-plan de chaque séquence d’images.Sélectionnez Appliquer une table de recherche arc-en-ciel au canal de rapport et utilisez le canal mCherry pour générer un canal de rapport modulé en intensité afin de mapper la couleur du rapport sur la luminosité du canal mCherry. Cliquez sur Rapport pour générer les deux canaux. Pour créer un protocole de recherche d’objets, faites glisser l’outil Rechercher des objets à l’aide de l’intensité sous l’onglet Mesures vers le volet du protocole et cliquez sur la roue dentée pour définir la fenêtre des valeurs d’intensité mCherry et pour Rechercher des objets.Sélectionnez des valeurs d’intensité supérieures ou égales à deux écarts-types au-dessus du bruit de fond, en prenant soin de détecter le corps cellulaire et la terminaison présynaptique. Ajoutez des filtres supplémentaires ciblant le canal mCherry uniquement si nécessaire pour exclure les objets indésirables, tels que la tête, la queue ou la fluorescence intestinale. Ensuite, ouvrez le menu Mesures et sélectionnez Créer un élément de mesure et choisissez tous les points temporels pour exécuter le protocole d’analyse de quantification d’image.L’acquisition simultanée des signaux de floraison GCaMP5 et mCherry est utilisée pour générer un canal de rapport pixel par pixel qui compense les changements de mouvement et de mise au point de l’animal. Pour chaque animal, les changements dans le calcium HSN intracellulaire présynaptique peuvent être corrélés avec des comportements évidents dans l’imagerie en fond clair, y compris la libération d’œufs et les changements dans la locomotion. En effet, des différences significatives de vitesse du ver avant, pendant et après l’état actif de ponte peuvent être observées.En zoomant sur un événement de ponte, on constate un changement robuste de la florescence de GCaMP5 avant l’événement de ponte. Alors que la florescence de mCherry reste relativement inchangée. De plus, les changements mesurés dans le rapport GCaMP5 :mCherry montrent clairement un transitoire de calcium HSN environ 4 secondes avant la libération de l’œuf.La contraction du muscle vulvaire qui se produit est évidente d’un ralentissement clair de la locomotion du ver qui se termine par la libération de l’œuf. De plus, l’imagerie et le suivi des vers, tels qu’ils viennent d’être démontrés, permettent de visualiser l’organisation spatiale du comportement de ponte des œufs à partir de la recherche de nourriture, des changements transitoires du calcium HSM et de l’activité HSN qui se transforme en tir en rafale avant la locomotion vers le lieu de ponte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en une heure ou deux, si elle est exécutée correctement.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de rester concentré sur les cellules d’intérêt et leurs terminaisons présynaptiques pendant les étapes d’imagerie. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’activation optogénétique, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont le HSN répond à la stimulation présynaptique. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer le fonctionnement du circuit de ponte chez C. elegans.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’imagerie calcique ratiométrique de HSN chez Caenorhabditis elegans actif.

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