Utilisant un système d’enrichissement immunoprécipitation complète afin d’identifier un profil endogène Modification post-traductionnelle des protéines cibles

L’objectif global de ce protocole expérimental est de permettre à des chercheurs inexpérimentés de déterminer efficacement si leur protéine cible est modifiée de manière endogène par un ou plusieurs PTM à l’aide d’un seul système complet. Cette méthode améliorera l’investigation dans le domaine de la modification post-traductionnelle en permettant la détection des PTM clés et de la diaphonie potentielle pour toute protéine cible à l’aide d’un système unique et simplifié. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de détecter si une protéine est modifiée de manière endogène par un ou plusieurs PTM dans leur système modèle.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode en étudiant les mécanismes de régulation de plusieurs voies de signalisation cellulaire, et nous avons découvert que nos kits ou systèmes conviviaux n’étaient pas vraiment disponibles pour l’étude des PTM non phospho. Commencez cette procédure par la préparation des cellules A431, comme décrit dans le protocole texte. Préparez également la lyse du blaster dans des tampons de dilution avec des inhibiteurs.

Videz le milieu de culture et placez les cellules sur de la glace. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Retirez autant de PBS que possible avant d’ajouter un tampon de lyse blaster pour maximiser la lyse cellulaire.

Ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse de blaster à chaque plaque de 150 millimètres. La quantité de tampon est basée sur le rendement protéique attendu. Ensuite, lysez les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire.

Le lysat deviendra visqueux en raison de la lyse nucléaire. À l’aide d’une pointe de pipette d’un millimètre, elle transfère le lysat brut dans un filtre blaster placé dans un tube de collecte de 15 millilitres. Utilisez le piston de filtre fourni pour comprimer complètement le filtre de sablage et recueillir le flux de lysat, y compris les bulles, dans un tube de 15 millilitres.

Le filtre blaster simple et efficace élimine l’ADN génomique, plutôt que de le cisailler comme on le voit dans d’autres méthodes couramment utilisées. Diluez le lysat clarifié avec un tampon de dilution blaster jusqu’à un volume final de trois millilitres pour chaque plaque de 150 millimètres. Le volume final est basé sur le rendement protéique attendu.

Cette étape est importante, car la composition finale du tampon affectera la rigueur de la réaction de précipitation des aminés. Ensuite, préparez le test de quantification des protéines, comme décrit dans le protocole textuel. Mesurez l’absorbance de l’échantillon de lysat à 600 nanomètres et calculez la concentration en protéines.

Retournez plusieurs fois le tube de réactif d’origine pour vous assurer que les billes sont complètement remises en suspension dans le tube. Pour chaque test IP, aliquote la suspension de billes dans des microtubes à centrifuger séparés de 1,5 millilitre sur de la glace. Ici, ajoutez 20 microlitres de billes d’affinité d’ubiquitine, 30 microlitres de billes d’affinité de phosphotyrosine, 40 microlitres de billes d’affinité SUMOylation 2/3 ou 50 microlitres de billes d’affinité d’acétylation dans les microtubes de centrifugation individuels.

Retournez plusieurs fois les tubes de réactifs contenant les billes de contrôle IP d’ubiquitination et les billes de contrôle IGG pour vous assurer que les billes sont complètement remises en suspension dans le tube. Ensuite, aliquote les billes de contrôle par réaction de contrôle pour déterminer la liaison non spécifique. Ici, ajoutez 20 microlitres de billes de contrôle de l’ubiquitine, 30 microlitres de billes de contrôle de la phosphotyrosine, 40 microlitres de billes de contrôle SUMOylation 2/3 ou 50 microlitres de billes de contrôle de l’acétylation dans des micro-tubes de centrifugation individuels de 1,5 millilitre sur de la glace.

Conservez 20 microlitres de lysat pour l’exécuter en tant que contrôle du lysat d’entrée par transfert Western. Ajoutez cinq microlitres de tampon d’échantillon 5x au lysat réservé et faites bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez du lysat dans chaque tube IP et contrôlez le tube IP.

Ici, un milligramme de lysat a été utilisé par réaction IP et de contrôle, ce qui a donné un total de huit réactions IP. Incuber les tubes sur une plate-forme rotative à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, recueillir les billes par centrifugation à une fréquence de trois à 5 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius.

Aspirez autant de surnageant que possible sans déranger les billes, puis lavez les billes dans un millilitre de tampon de lavage blaster pendant cinq minutes sur une plate-forme rotative à quatre degrés Celsius et collectez les billes par centrifugation comme précédemment. Après la centrifugation, aspirez autant de surnageant que possible sans déranger les billes et répétez l’étape de lavage deux fois de plus. Après le lavage final et la centrifugation, aspirez la majorité au niveau du surnageant tampon, puis éliminez le surnageant résiduel à l’aide d’une pointe de chargement de protéines à alésage fin.

Une perturbation minimale de la bille de bille est acceptable. Assurez-vous que tout le tampon de lavage a été retiré tout en minimisant les perturbations de la pastille de battement afin de maximiser la récupération de vos protéines PTM. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de tampon d’élution de billes et remettez les billes en suspension en tapotant doucement ou en effleurant le côté du tube.

N’utilisez pas de pipette à ce stade. Incuber les billes remises en suspension à température ambiante pendant cinq minutes. Coupez l’extrémité de la pointe de la pipette de transfert et transférez doucement chaque suspension de bille dans une colonne de centrifugation de 1,5 millilitre qui a été placée dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Centrifugez l’échantillon entre neuf et 10 000 fois G à partir d’une minute à température ambiante pour prélever l’échantillon IP, puis ajoutez deux microlitres de 2-mercaptoéthanol à chaque échantillon et mélangez bien. Placez les échantillons dans un bain-marie à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 fois G pendant une minute à température ambiante.

Enfin, passez à l’exécution de SDS PAGE, au transfert et à l’analyse du transfert de Western comme décrit dans le protocole texte. Du lysat cellulaire A431 non traité et traité à l’EGF a été ajouté à des billes d’ubiquitine, de phosphotyrosine, de SUMO 2/3 et d’affinité d’acétyllysine. Un anticorps-L1 a été utilisé pour l’analyse par immunotransfert Western afin de déterminer si la protéine-L1 était modifiée par ces quatre PTM en réponse à la stimulation par EGF.

Les résultats représentatifs présentés ici indiquent que cette méthode identifie efficacement les modifications endogènes de-L1 par PTM. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à 4 heures et demie si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter la PTM énogène ou la diaphonie de votre protéine cible ou de votre voie de signalisation en utilisant ce système complet de détection PTM.