Name: Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez un criblage RNAi à haut débit pour identifier les facteurs hôtes qui modulent la réplication des virus oncolytiques. Cette méthode permet d'améliorer les thérapies antitumorales de manière complète et impartiale.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut ontarien pour la recherche sur le Cancer, la Fondation canadienne pour l’Innovation, la Fondation Cancer région d’Ottawa et l’Institut de recherche Terry Fox. K.J.A. a été soutenu par une bourse supérieures du Canada Vanier, un Canadian Institute for Health Research-maîtrise Award et une bourse d’études supérieures de l’Ontario.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici un protocole pour l’emploi de criblage à haut débit Arni pour identifier les cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques. Ceci a été testé avec succès avec oncolytiques vaccinia virus et Maraba oncolytiques, mais, comme indiqué, il peut être adapté pour être utilisé avec d’autres virus oncolytiques ou autres virus généralement pour identifier les gènes de l’hôte qui modulent la réplication du virus. Le protocole de dépistage vise également à identifier les gènes qui...

Criblage à haut débit pangénomique Arni s’est avéré pour être un outil précieux pour révéler des connaissances biologiques dans divers domaines d’études dont la biologie du virus. Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont entrepris sur les cellules à grande échelle Arni dépistage pour identifier les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus (révision1,2,3,4 largement , 5 , 6 , 7). il est intéressant, un grand nombre de ces écrans ont été mené dans les cellules cancéreuses et plusieurs avec les virus qui sont des candidats de virus oncolytiques actuels y compris vaccinia virus8,9,10 , Myxome virus11, herpès simplex virus12, virus de la stomatite vésiculeuse13,14et Maraba virus15. Alors que la majorité de ces études portait sur l’identification des facteurs de l’hôte qui influent sur certains aspects de la réplication du virus et ne pas sur l’identification des produits biothérapeutiques cibles pour améliorer virales oncolytiques, données précieuses pourraient être exploitées de ces ensembles de données dans cet égard. Il est clair que le puissant potentiel d’identifier des objectifs d’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques n’a pas été pleinement exploité.
Une multitude de plates-formes de virus oncolytiques sont actuellement à l’essai dans les études précliniques et cliniques, y compris les virus herpes simplex virus, réovirus et vaccine, qui ont eu des succès tangibles dans les essais cliniques de stade avancé. Pour la majorité de ces plates-formes, des efforts ont été dirigées vers modifier les génomes de virus afin d’améliorer la thérapie. Par exemple, pour augmenter la spécificité de la tumeur, les gènes des virus spécifiques ont été supprimés ou mutés pour restreindre considérablement la réplication virale dans les cellules normales, mais pas dans les cellules tumorales. Dans certains cas, les transgènes ont été ajoutés comme GM-CSF (granulocyte and macrophage colony-stimulating factor) pour potentialiser la réponse immunitaire ou NIS (symporteur de l’iodure de sodium) pour permettre à l’imagerie in vivo et l’absorption cellulaire radioiodure pour thérapeutique fins. Cependant, il y a eu très peu de travail axé sur la manipulation des gènes de l’hôte/tumeur et explorer l’impact des gènes de l’hôte/tumeur sur la réplication du virus oncolytiques. Avec l’avènement de la technologie de criblage à haut débit, il est maintenant possible de sonder les interactions hôte-virus à l’échelle du génome et de déchiffrer les possibilités de manipuler le génome de l’hôte pour améliorer virales oncolytiques (revu en16, 17,,18).
Nous avons signalé la première étude mettant en évidence de validation pour l’utilisation de haut-débit génétique de dépistage pour identifier les cibles d’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques. Pour découvrir les gènes hôtes qui modulent Maraba virus oncolysis, un rhabdovirus oncolytiques actuellement testée en phase I et II des essais, nous avons mené écrans Arni Génome-large à travers trois lignées de cellules tumorales différentes en double avec un siARN (abrégé interférant RNA) bibliothèque de ciblage de gènes 18 12015. Analyse de la voie de succès identifiés dans les écrans a révélé enrichissement des membres des voies de réponse de stress ER (réticulum endoplasmique). Nous avons sélectionné 10 hits dans ces voies pour validation secondaire à l’aide de siARN avec des séquences de ciblage différentes de celles de l’écran principal. Dans le cadre de la validation tertiaire, nous avons réalisé une expérience de sauvetage avec IRE1α (nécessitant de l’inositol alpha enzyme 1) pour confirmer que le coup était sur la cible. In vitro et in vivo , essais à l’aide d’un inhibiteur de la petite molécule de IRE1α a entraîné oncolytiques considérablement amélioré l’efficacité.
Workenhe et al. 12 a également mené un écran de RNAi de Génome-large à l’aide d’une mise en commun shARN des gènes (abrégé hairpin RNA) Bibliothèque ciblant des gènes 16 056 afin d’identifier les facteurs de l’hôte limitant le virus de l’herpès humain de type 1 (HSV-1) mutant KM100-mediated oncolysis du sein cellules cancéreuses. Dans l’écran principal, ils ont identifié des 343 gènes la précipitation de qui conduisent à la cytotoxicité accrue de cellules infectées par le KM100 au-dessus des cellules infectées par un simulacre ; ils ont sélectionné 24 de ces gènes pour la validation secondaire. Sur les 24 gènes, 8 gènes ont été confirmés dans l’écran secondaire avec l’un d'entre eux étant SRSF2 (riche en sérine/arginine épissage facteur 2) qui a ensuite été confirmée à l’aide d’une expérience de sauvetage génétique lors de la validation tertiaire. Le groupe a ensuite pour identifier un ADN topoisomerase inhibiteur chimiothérapeutique réduit la phosphorylation de SRSF2 et a montré que le traitement de combinaison de HSV-1 KM100 avec cet inhibiteur d’avance à une survie prolongée des souris de tumeur-roulement TUBO.
Dans les études susmentionnées, un flux de travail similaire a été suivie. Chacun a commencé avec un écran de RNAi pangénomique primaire suivi d’un écran secondaire sur un certain nombre de possibilités identifiées dans l’écran principal. Ceci a été suivi par des études tertiaires validation incluse confirmant que le coup était sur la cible en effectuant génétique sauver des expériences in vitro avec ultime validation effectuée en manipulant la cible de produit génique in vivo. Dans cet article, nous fournissons tout d’abord un protocole général pour le développement et la validation d’un test de siARN-criblage haut débit, qui consiste à déterminer les conditions optimales de transfection, quantité de virus et la durée de l’infection. Nous offrons également un protocole détaillé pour effectuer un primaire un écran siARN haut débit ainsi qu’une description générale de la méthode pour effectuer la validation de l’écran secondaire et tertiaire validation.

<table><tbody><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>library GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-well plate</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 384-well</td><td>plate Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars Negative Control siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome Non-targeting siRNA Pool #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HIGH Glucose</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin</td><td>Serum Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine 100X solution</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de résazurine</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde (37 % en poids)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles de 500 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>Film</tr><tr><td>d’étanchéité adhésif 430282 pour microplaques</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>Feuille de thermoscellage pelable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select Cassette distributrice</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Catalog Numéro</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select (distributeur de liquide)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120621</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT lecteur de plaques</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera Imaging and</td> Analysis <td>Instrument PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>Bras robotique KiNEDx</td><td>Analyse et automatisation des pics (anciennement Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur automatisé série Cytomat 24C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS Station de travail automatisée</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>Carrousel</td><td>à plaques Analyse et automatisation des pics (anciennement Peak Robotics)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alps 3000 scelleuse</td> <td>de plaquesThermo Fisher Scientific</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les virus oncolytique thérapie

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Haut débit pangénomique Arni (interférence ARN) dépistage technologie a été largement utilisée pour découvrir les facteurs de l’hôte qui ont une incidence de réplication du virus. Nous présentons ici l’application de cette technologie à découvrir sur hôte cibles qui modulent spécifiquement la réplication du virus de Maraba, un rhabdovirus oncolytiques et virus de la Vaccine dans le but d’améliorer la thérapie. Alors que le protocole a été testé pour une utilisation avec oncolytiques vaccinia virus et Maraba oncolytiques, cette approche est applicable à d’autres virus oncolytiques et peut également être utilisée pour identifier des cibles d’hôte qui modulent la réplication virale dans les cellules de mammifère en général. Ce protocole décrit le développement et la validation d’un test de criblage à haut débit Arni dans les cellules de mammifères, les considérations clés et des étapes de préparation importantes pour la réalisation d’un écran de RNAi haut débit primaire et un guide étape par étape pour réalisation d’un écran de RNAi haut débit primaire ; en outre, il décrit globalement les méthodes pour effectuer la validation de l’écran secondaire et les études de validation tertiaire. L’avantage de l’ARNi haut-débit, présélection, c’est qu’il permet de répertorier, de manière approfondie et impartiale, facteurs de l’hôte qui modulent n’importe quel aspect de la réplication du virus pour lesquels on peut se développer un test in vitro , tels que l’infectiosité, éclatement de taille, et la cytotoxicité. Il a le pouvoir de découvrir imprévues biothérapeutiques cibles basées sur les connaissances actuelles.

Une vue d’ensemble du flux de travail pour identifier des cibles pour améliorer virales oncolytiques hôte est présenté dans la Figure 1.
Tel qu’illustré à la Figure 1, la première étape essentielle à la réalisation d’un écran de RNAi de haut débit est développement de dosage. Figure 2 a fournit une disposition de plaque d’échantillon pour l...

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

L’objectif global de ce protocole est d’identifier des cibles hôtes qui peuvent être manipulées pour améliorer la thérapie virale oncolytique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie virale oncolytique, telles que les facteurs spécifiques de l’hôte et les voies cellulaires qui modulent la réplication du virus oncolytique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier des cibles hôtes qui peuvent être manipulées pour améliorer la thérapie virale oncolytique de manière complète et impartiale.Ce protocole peut également être utilisé pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent la réplication du virus en général. Après avoir mis au point un test de criblage à haut débit conformément au protocole de texte, retirez un lot de plaques de microtitration du congélateur et laissez-les décongeler pendant 20 à 30 minutes. Pendant ce temps, remplissez deux bouteilles avec de l’éthanol à 70 %, puis remplissez deux tubes coniques de 50 ml avec du PBS et un avec de l’eau distillée.Immergez le tube du distributeur de liquide dans une bouteille d’éthanol à 70 %, puis placez un morceau de ruban adhésif autour du tube pou

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Facteurs de l'hôte roman impliqués dans l'infection virale peuvent être identifiés par la cellule basée échelle du génome perte de fonction ARNi dépistage.

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La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

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Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

Des méthodes d’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des molécules d’ARN ciblant les étapes post-intégration du cycle de réplication du VIH-1 sont décrites. Ces méthodes sont utiles pour cribler de nouvelles molécules et optimiser le format des molécules existantes.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

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Identification et caractérisation des facteurs métastatiques par transfert de gènes dans le RIP de roman-Tag ; RIP-tva modèle murin

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

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Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

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Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).

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Découvrez un criblage RNAi à haut débit pour identifier les facteurs hôtes qui modulent la réplication des virus oncolytiques. Cette méthode permet d'améliorer les thérapies antitumorales de manière complète et impartiale.

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

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