Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

L’objectif global de ce protocole est d’identifier des cibles hôtes qui peuvent être manipulées pour améliorer la thérapie virale oncolytique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie virale oncolytique, telles que les facteurs spécifiques de l’hôte et les voies cellulaires qui modulent la réplication du virus oncolytique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier des cibles hôtes qui peuvent être manipulées pour améliorer la thérapie virale oncolytique de manière complète et impartiale.

Ce protocole peut également être utilisé pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent la réplication du virus en général. Après avoir mis au point un test de criblage à haut débit conformément au protocole de texte, retirez un lot de plaques de microtitration du congélateur et laissez-les décongeler pendant 20 à 30 minutes. Pendant ce temps, remplissez deux bouteilles avec de l’éthanol à 70 %, puis remplissez deux tubes coniques de 50 ml avec du PBS et un avec de l’eau distillée.

Immergez le tube du distributeur de liquide dans une bouteille d’éthanol à 70 %, puis placez un morceau de ruban adhésif autour du tube pour marquer le point en dessous duquel le tube peut être considéré comme stérile. Utilisez environ 25 ml d’éthanol à 70 % pour amorcer le tube. Versez de l’éthanol supplémentaire dans la bouteille pour remplacer le volume perdu, puis laissez le tube reposer dans de l’éthanol pendant au moins cinq minutes.

Après avoir préparé le capot de culture cellulaire, centrifugez les plaques scellées et les durcissez à 1026 fois G à température ambiante pendant deux minutes. Ensuite, retirez les joints des plaques. Ensuite, pipetez la quantité requise de réactif de transfection dans les tubes coniques contenant le diluant de réactif de transfection préchauffé.

Commencez à essayer de tester les cellules en aspirant le milieu de chaque plaque. Utilisez neuf ml de PBS pour rincer les cellules, puis pipetez trois ml de trypsine par plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes.

Ensuite, utilisez 22 ml de milieu pour remettre les cellules en suspension en pipetant 10 fois de haut en bas. Combinez la suspension cellulaire de chaque plaque de culture tissulaire dans une bouteille stérile et mélangez la suspension cellulaire en inversant la bouteille. Ensuite, pipetez un mL d’aliquats dans la suspension cellulaire dans deux tubes microfuges séparés.

Retirez l’échantillon de chaque tube de microfuge et comptez les cellules. Calculez ensuite le volume de suspension cellulaire requis pour la densité requise et préparez suffisamment de suspension cellulaire diluée pour la distribuer sur un lot de plaques. Pendant la préparation des cellules, videz le tube du distributeur de liquide d’éthanol.

Utilisez environ 25 ml de PBS pour amorcer le tube, puis videz le tube. Assurez-vous que la partie de la tubulure qui sera immergée dans le réactif de transfection, et plus tard dans la suspension cellulaire, est maintenue stérile. Séparez les plaques qui peuvent être faites en toute sécurité avec un tube conique de solution de réactif de transfection.

Pipetez les solutions de réactif de transfection vers le haut et vers le bas 10 fois. Utilisez ensuite la solution pour amorcer le tube avant de distribuer 5 microlitres par puits. Centrifugez les plaques à 1026 fois G à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, incubez les plaques à température ambiante pendant le temps prescrit pour le réactif de transfection utilisé. Pendant l’incubation, videz le tube de la solution de réactif de transfection et placez-le dans un tube conique plein de 50 ml contenant du PBS. Utilisez ensuite environ 25 ml de PBS pour rincer le tube en l’amorçant puis en le vidant.

Mélangez le flacon contenant la suspension cellulaire, puis placez le tube dans la suspension et amorcez suffisamment le tube pour voir que chaque embout distribue correctement. Distribuez 30 microlitres par puits de suspension cellulaire sur toutes les plaques. Videz la suspension cellulaire du tube, puis rincez le tube avec environ 25 ml de PBS suivi d’environ 50 ml d’eau distillée.

Laissez les plaques reposer à température ambiante pendant 45 à 60 minutes à partir du moment de l’ensemencement cellulaire. Ensuite, incubez les plaques dans un incubateur non perturbé pendant la durée souhaitée de silençage génique. Pour gagner du temps, la veille de l’infection des cellules, pipetez dans des flacons stériles la quantité précise de milieu nécessaire pour infecter chaque lot de plaques, y compris le milieu pour les puits non infectés.

Réchauffez le milieu à 37 degrés Celsius, puis remplissez deux bouteilles avec de l’éthanol à 70 %, deux tubes coniques de 50 ml avec du PBS et un avec de l’eau distillée. Stérilisez le tube avec de l’éthanol à 70 % comme démontré précédemment. Pendant que le tube est assis dans l’éthanol, faites d’abord un vortex sur le virus, puis pipetez le volume précis de virus requis dans le flacon de milieu d’infection.

Rincez ensuite le tube en utilisant 25 ml de PBS pour l’amorcer, puis videz-le. Après avoir retiré les plaques de l’incubateur, placez-les dans le capot de culture tissulaire. Utilisez un milieu pour amorcer le tube, puis versez 40 microlitres de milieu dans les puits de contrôle non infectés.

Videz le tube du fluide et utilisez 25 ml de PBS pour le rincer. Après avoir mélangé le virus, placez le tube dans la bouteille contenant le virus, distribuez 40 microlitres de virus sur les plaques. Centrifugez les plaques à 400 fois G à température ambiante pendant 30 minutes.

Incuber les plaques pendant la durée préalablement déterminée. La veille de la fixation, préparez une bouteille de solution de fixation et de repos contenant quatre pour cent de formaldéhyde et de PBS pour chaque lot de plaques, mais omettez la coloration Hoechst. Conservez la solution dans l’armoire inflammable à l’abri de la lumière.

Le lendemain, utilisez de l’éthanol à 70 % et du PBS pour rincer le tube comme démontré précédemment. Répartissez 30 microlitres de solution sur toutes les plaques, puis placez les plaques dans l’incubateur pendant 30 minutes. Après l’incubation, appliquez les joints sur les plaques et stockez-les à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière.

Effectuer des images et des analyses selon le protocole texte. On voit ici 786 cellules O colorées au Hoechst 33342 après une incubation de 72 heures avec un diluant de réactif de transfection seul. Réactif de transfection et diluant, siRNA non ciblant, et avec siRNA ciblant PLK1.

Le graphique de survie présenté ici indique que 22 % des cellules transfectées avec un siRNA PLK1 ont survécu, et 94 % des cellules transfectées avec un siRNA non ciblé ont survécu. Ce graphique illustre les résultats de l’évolution en temps réel de 786 cellules O infectées par le virus oncolytique de la vaccine exprimant une GFP accrue à divers MOI. Des images représentatives de cellules infectées à un moment d’inertie de 0,05 sur une trajectoire en temps réel sont présentées ici.

Une période d’incubation de 21 heures permettrait de détecter des augmentations et des diminutions de la propagation, car le point temporel se situe à l’intérieur d’une plage linéaire. Après des criblages d’ARNi à l’échelle du génome sur trois lignées cellulaires tumorales, 1008 occurrences communes à au moins deux lignées cellulaires cancéreuses sur trois ont été identifiées à l’aide de la méthode MAD. 10 occurrences dans les voies UPR et ERAD ont été sélectionnées pour une validation secondaire via siRNA avec différentes séquences de ciblage.

Lors de la distribution de réactifs, il est essentiel que vous disposiez du bon lot de plaques, que vous ayez sélectionné le bon volume pour la distribution et que le tube ait été rempli avec le bon réactif et qu’il soit toujours entièrement immergé dans le réactif. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un criblage ARNi à haut débit pour identifier les cibles de l’hôte qui peuvent être manipulées pour améliorer la thérapie virale oncolytique, ou pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent la réplication du virus en général.