Name: Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Découvrez la production de vecteurs lentiviraux intégrase déficients pour l'édition génique CRISPR/Cas9 dans les cellules en division. Cette méthode optimise la livraison d'outils d'édition génique avec une sécurité accrue.

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Nous tenons à remercier le département de neurobiologie, Duke University School of Medicine et Décanat en sciences fondamentales, Université Duke. Nous remercions également les membres du noyau Duke vecteur Viral pour commentaires sur le manuscrit. Plasmide pLenti CRISPRv2 était le cadeau de Feng Zhang (Broad Institute). Le système de LV-emballage, y compris le psPAX2 de plasmides, VSV-G, pMD2.G et pRSV-Rev était un gentil cadeau de Didier Trono (EPFL, Suisse). Soutien financier à ce travail a été fourni par l’Université d’école de médecine en Caroline du Sud, accorder RDF18080-E202 (BA).

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</ol>

USC-499-P de brevet (1175) a été déposée par la University of South Carolina, en ce qui concerne les travaux décrits dans ce manuscrit.

IDLVs ont commencé à émerger en tant que véhicule de choix pour l’in vivo gene-édition, en particulier dans le contexte des maladies génétiques, due en grande partie au faible risque de mutagenèse associée à ces vecteurs par rapport à l’intégration de plateformes de livraison22 , 28. dans le manuscrit actuel, nous avons cherché à détailler le protocole lié à la production de l’all-in-one jusque-CRISPR/Cas9 système amélioré qui a été récemment mis au poin...

Gène précis édition constitue la pierre angulaire des grandes avancées biomédicales qui impliquent le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre les maladies génétiques. À l’avant-garde des technologies de modification génétique est la méthode en s’appuyant sur l’utilisation de la clustered regularly -jenterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / système de Cas9 qui a été initialement identifié dans le cadre de l’immunité contre l’invasion virale matériel génétique (révisé dans les références1,2) bactérienne. Un avantage majeur du système CRISPR/Cas9 autres gène-montage des outils, tels que les nucléases de doigt de zinc (ZFNs) et les nucléases d’effecteur comme activateur de transcription (TAPS) (révisés en référence3), est la relative simplicité de conception de plasmide et construction des composants de CRISPR — une caractéristique qui a alimenté l’expansion du gène-montage de quelques laboratoires spécialisés à une communauté de recherche beaucoup plus large. En outre, la simplicité de programmation CRISPR/Cas9 et sa capacité de reconnaissance de cible multiplexé ont alimenté plus sa popularité comme une technologie rentable et facile à utiliser. Parmi les diverses méthodes disponibles aux chercheurs de livrer ces composantes de l’édition de gène aux cellules, vecteurs viraux demeurent de loin le plus populaire et efficace système.
Vecteurs LENTIVIRAUX (LVs) sont apparus comme le véhicule de choix pour fournir les composants de CRISPR/Cas9 système in vivo pour diverses applications4,5,6,7. Les principales fonctionnalités font LVs un choix populaire pour ce processus, y compris leur capacité à infecter des cellules en division et non de division, faible immunogénicité tant minime toxicité cellulaire (revu en référence8). Ainsi, la thérapie génique induite par le LV a été employée dans le traitement de maladies infectieuses comme le VIH-1 et HSV-1, HBV, ainsi que dans la correction des défauts sous-jacents des maladies héréditaires humaines, telles que la fibrose kystique et la dégénérescence maculaire neo-vasculaire 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. par ailleurs, LVs ont été effectivement modifiées pour effectuer des retouches de gène multiplex locus génomiques distincts à l’aide d’un vecteur unique système12.
Cependant, la propriété inhérente de LVs à intégrer dans le génome hôte peut être mutagène et handicape souvent leur utilité comme vecteurs de transgène, notamment dans les milieux cliniques. En outre, depuis intégrée de façon stable LVs expriment leur transgènes durablement élevés, ce système est inadapté pour la livraison de gène-montage de composants tels que les CRISPR/Cas9 ; la surexpression de l’ARN Cas9-guide (gRNA) et des protéines semblables tels que ZFNs, sont associées à des niveaux élevés d’effets hors cible, incluent des mutations indésirables13,14,15,16 , 17 et peut potentiellement améliorer la cytotoxicité18. Par conséquent, pour atteindre précis édition de gène avec des effets minimes hors cible, il est impératif de concevoir des systèmes qui permettent l’expression transitoire du gène montage des composants.
Ces dernières années, une variété de plates-formes de diffusion ont été développés pour exprimer transitoirement CRISPR/Cas9 dans cellules16,19,20,21 (revu en référence22). Il s’agit de méthodes qui dépendent directement introduire Cas9 purifiée ainsi que le guide approprié ARN dans des cellules, qui s’est avéré plus efficace à l’édition de gène ciblé par rapport à médiation plasmidique transfection16. Des études ont démontré que la ribonucléoprotéine (RNP) complexes comprenant guident RNA/Cas9 particules sont rapidement remis après médiation de clivage de l’ADN à leurs cibles, ce qui suggère que l’expression à court terme de ces composants est suffisante pour atteindre gène robuste édition16. En théorie, sans intégration des plates-formes de vecteurs viraux tels que les vecteurs viraux adéno-associés (AAVs) peuvent fournir une alternative viable pour livrer les machines édition de gène aux cellules. Malheureusement, les capsides AAV possèdent significativement plus faible capacité de l’emballage que LVs (< 5 Ko), qui entrave gravement leur aptitude pour empaqueter le toolkit CRISPR multicomposants au sein d’un unique vecteur (revu en référence8). Il est à noter qu’ajout de composés qui inhibent les histones désacétylases (p. ex., le butyrate de sodium23) ou entraver le cycle cellulaire (p. ex., caféine24) ont été montré pour augmenter des titres des gènes. Malgré les progrès récents, les systèmes d’expression transitoire développés jusque sont encore entravés par plusieurs défauts, tels que l’efficacité de la production plus faible, conduisant à des titres viraux réduits et efficacité faible transduction des vicitimes du virus ces approches25.
Vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient (IDLVs) représentent une avancée majeure dans le développement de véhicules de livraison-gène, car ils combinent la capacité de l’emballage de LVs avec l’avantage supplémentaire d’entretien épisomiques AAV-comme dans les cellules. Ces fonctionnalités permettent IDLVs de contourner en grande partie les principaux enjeux rattachés à l’intégration des vecteurs, surexpression continue vis-àvis des éléments potentiellement génotoxiques et mutagénicité induite par l’intégration. Il a été précédemment démontré que IDLVs peuvent être modifiées avec succès pour améliorer l’expression de gène épisomiques26,27. En ce qui concerne la livraison de médiation jusque CRISPR/Cas9, titres de production faible et plus faible expression des génomes épisomes-la charge par rapport aux systèmes des gènes intégrase-proficient limite leur utilité comme outils de bona fide pour la livraison du génome-montage constructions transgéniques. Nous avons récemment démontré que transgene expression tant des titres viraux associés à production jusque sont considérablement renforcés par l’inclusion de sites pour le facteur de transcription Sp1 dans l’expression virale cassette28de liaison. Les IDLVs mis à jour le fermement appuyé gènes CRISPR édition aussi bien in vitro (dans les cellules HEK-293 t) et in vivo (dans les neurones du cerveau post-mitotiques), tout en induisant des mutations hors cible minimales par rapport à la médiation ICLV correspondant 28de systèmes. Dans l’ensemble, nous avons développé un roman, compact, tout-en-un toolkit CRISPR exploite une plateforme jusqu’et décrit les divers avantages d’utiliser un tel véhicule de livraison pour l’édition de gène amélioré.
Ici, le protocole de production du système jusque-CRISPR/Cas9 est décrit, y compris les différentes étapes impliquées dans l’Assemblée, purification, concentration et titrage de IDLVs, ainsi que des stratégies pour valider l’efficacité de gène-édition de ces vecteurs. Ce protocole est facilement évolutif pour répondre aux besoins des différents enquêteurs et est conçu pour générer avec succès les vecteurs LV avec des titres dans l’ordre de 1 x 1010 unités (TU) de transduction / mL. Les vecteurs des vicitimes du présent protocole peuvent être utilisés pour infecter efficacement plusieurs types de cellules différentes, y compris de difficile-à-transduce les cellules souches embryonnaires, les cellules hématopoïétiques (les cellules T et les macrophages) et mis en culture et en vivo- neurones injectés. En outre, le protocole est également bien adapté pour la production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase-compétente en quantités similaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> Figure 1 : emballage jusque. (a) schéma du type sauvage intégrase protéine (b) le plasmide modifié a été dérivé de psPAX2 (voir méthodologie, construction plasmidique pour plus de détails). Image de gel d’agarose représentant des clones sélectionnés pour les clones de l’intégrase muté. Des échantillons d’ADN préparés à l’aide d’un mini-kit isolement ADN plasmidique standard ont été analysés par digestion avec EcoRV et SphI. Le clone correctement digérés (numéro 5, boîte rouge en pointillés) a été davantage vérifié par séquençage direct (Sanger) pour la substitution de D64E en INT. La cassette de l’intégrase déficients en emballage s’appelait pBK43. (c) schéma du protocole de transfection transitoire utilisées pour générer des vecteurs jusque-CRISPR/Cas9, montrant des cellules 293 t transfectées avec VSV-G, emballage et cassettes transgène (Sp1-CRISPR/Cas9 tout-en-un plasmide). Les particules virales qui bourgeonnent en dehors de la membrane cellulaire contiennent l’ARN pleine longueur du vecteur (exprimé de la cassette du transgène). La deuxième génération du système d’emballage jusqu’a été utilisée, qui comprend les protéines régulatrices Tat et expression Rev Rev. est complétée d’une cassette séparée (RSV-REV-plasmide). ABBREV: virus de répéter, VSV-G, la stomatite vésiculeuse LTR-Long-terminal G-protéine, promoteur du CMVp-cytomégalovirus ; Promoteur de sarcome de Rous de virus (VRS) ; RRE-(élément de réponse de Rev). Autres éléments régulateurs sur la cassette d’expression comprennent des sites de liaison du Sp1, élément Rev Response (RRE), Woodchuck Hepatitis Virus post-transcriptionnel réglementation élément (WPRE), un promoteur de 1α facteur core-élongation (EFS-NC), l’emballage de vecteur élément ψ (lb/po2), promoteur de cytomégalovirus (hCMV) humain et humain promoteur U6. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R centrifugeuse</td><td>de table Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>xMark Lecteur de plaques d’absorption</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&mu ; Unité de filtration m, 500mL</td><td>Corning</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’ultracentrifugation à fond conique</td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateurs de tubes coniques</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti rotor à godets oscillants</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50mL coniques tubes à centrifuger</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits à haute liaison</td><td>Corning</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire traitées TC 150 mm avec grille de 20 mm</td> Boîte de culture <td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>100mm Boîte de culture traitée TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu ; Unité de filtration M, 1L</td><td>Corning</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de culture tissulaire, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de culture tissulaire, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de culture tissulaire, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre avec lamelles</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td><Nom>fort</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Réactifs de culture cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellules de rein embryonnaire humain 293T (HEK 293T) Cellules</td><td></td><td></td> ATCC CRL-3216 <td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, média à haute teneur en glucose</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau cosmique</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique, 100X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acide aminé non essentiel (NEAA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>Média RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,05 %</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>BES (N, N-bis (2-hydroxyéthyl)-2-amino-éthanesulfonique)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>p24 Réactifs ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-p24 programme</td> de <td>recherche et de référence sur les anticorps NIH AIDS</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Normes VIH-1</td><td>Programme de réactifs de référence et de recherche sur le sida du NIH</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-p24</td> Programme de <td>réactifs de référence et de recherche sur le sida du NIH</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin peroxydase de raifort IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12-348</td><td>Concentration de travail 1:1500</td></tr><tr><td>Sérum de souris normale, stérile, 500mL</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre, stérile, 10mL</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Concentration de travail 1:1000</td></tr><tr><td>Substrat de peroxydase TMB</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>Concentration de travail 1:10,000</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Plasmides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Restriction enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>Nouvelle-Angleterre Biolabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>Nouvelle-Angleterre Biolabs</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour la production de vecteurs lentiviraux intégrase déficient pour crispr/cas9-mediated gene knockout dans les cellules en division

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Vecteurs LENTIVIRAUX sont un choix idéal pour la prestation des modules d’édition de gène aux cellules en raison de leur capacité pour stablement transduction une vaste gamme de cellules et de médiation de hauts niveaux d’expression de gène. Cependant, leur capacité à s’intégrer dans le génome de la cellule hôte augmente le risque de mutagénicité insertional soulève des questions de sécurité et limite leur utilisation en milieu clinique. En outre, l’expression persistante de gène-montage de composants livrés par ces hausses de vecteurs LENTIVIRAUX capables d’intégration (ICLVs) la probabilité de ciblage de gènes ubiquistes. Comme alternative, une nouvelle génération de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient (IDLVs) a été développée qui aborde un grand nombre de ces préoccupations. Le protocole de production d’une plateforme jusque nouvel et améliorée pour les gènes CRISPR montage et liste les étapes de la purification et de concentration de ces vecteurs est décrite ici transduction et leurs efficacité édition de gène à l’aide de HEK-293 t cellules a été démontrée. Ce protocole est facilement évolutif et peut être utilisé pour générer des IDLVs de titre élevé qui sont capables de faire des cellules in vitro et in vivo. En outre, le présent protocole peut être facilement adapté pour la production de ICLVs.

Validation de l’élimination directe-efficacité des vecteurs jusque-CRISPR/Cas9 Nous avons utilisé les cellules 293 t exprimant GFP comme modèle pour valider l’efficacité de la débouchure de gène CRISPR/Cas9-médiée. GFP + cellules ont été générés par transduction des cellules HEK-293 t avec pLenti-GFP (vBK201a) à un MOI de 0,5 (Figure 3 b, panneau « no-virus »). La cassette de sgRNA-à-GFP/Cas9 tout-en-un vecteur a été emballée en particules...

Nous décrivons la stratégie de production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient (IDLVs) comme des véhicules de livraison CRISPR/Cas9 aux cellules. Avec une capacité de médiation rapide et robuste de gène d’édition dans les cellules, IDLVs présentent une plus sûre et plateforme vector tout aussi efficaces pour la livraison de gène par rapport aux vecteurs capables d’intégrase.

Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire la production et les applications potentielles de vecteurs lentiviraux dépourvus d'intégrase, optimisés et capables de transférer des transgènes CRISPR/Cas9 à des cellules in vivo et in vitro pour une édition génique rapide et efficace. CRISPR/Cas constitue une plateforme hautement efficace pour l'édition et la manipulation des gènes. Voici un aperçu du protocole relatif à la production de vecteurs lentiviraux dépourvus d'intégrase, optimisés et fortement concentrés, destinés à une livraison efficace d'outils d'édition génique CRISPR/Cas.La technique s'est révélée très efficace dans les cellules cultivées et les neurones post-mitotiques. Ensemencez les cellules HEK-293T un jour avant la transfection afin que la confluence atteigne entre 70 et 80 % le lendemain. Avant la transfection, aspirez le milieu ancien des plaques de culture et ajoutez du milieu fraîchement préparé dépourvu de sérum.Dans un tube conique de 15 millilitres, ajouter les quatre plasmides afin de préparer un mélange de plasmides pour la transfection d'une boîte de 15 centimètres. Ensuite, ajouter 312,5 microlitres de chlorure de calcium à une concentration de un molaire au mélange de plasmides et ajuster le volume à 1,25 millilitre avec de l'eau doublement distillée stérile. Continuer à ajouter goutte à goutte la solution tamponnée 2X BES progressivement tout en vortexant.Ensuite, incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter 2,5 millilitres de mélange de plasmide en gouttes à chacune des boîtes de 15 centimètres. Puis, agiter doucement les boîtes et incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois heures.Après trois heures, ajouter 2,5 millilitres de sérum à 10 % dans chaque plaque et poursuivre l'incubation toute la nuit. Utiliser une pipette de culture tissulaire de 10 millilitres pour aspirer soigneusement le surnageant des cellules transfectées ensemencées dans chaque boîte de culture. Ensuite, rassembler l'ensemble du surnageant dans des tubes de centrifugation de 50 millilitres.Placez le tube dans une centrifugeuse de table et démarrez la centrifugation. Ensuite, filtrez le surnageant à l’aide d’un dispositif de filtration sous vide de 0,45 micromètre. Remplissez les tubes coniques de centrifugation ultracentrifugeuse avec des concentrations différentes de saccharose afin de former des couches présentant un gradient de saccharose.Ajouter soigneusement le surnageant contenant le virus au gradient de saccharose. Pour traiter l'intégralité du volume de 100 millilitres de surnageant viral, utiliser six tubes d'ultracentrifugation par rotation. Ensuite, équilibrer les tubes d'ultracentrifugation avec du tampon PBS 1X et centrifuger les échantillons à 70 000 g pendant deux heures à 17 degrés Celsius.Dans des tubes propres, recueillir les fractions de saccharose à 30 % et à 60 % et ajouter du tampon PBS 1X froid pour ajuster le volume à 100 millilitres. Mélanger les échantillons en aspirant et en rejetant plusieurs fois à l’aide d’une pipette. Ensuite, ajouter de 20 à 25 millilitres de la solution virale au-dessus de quatre millilitres de solution de saccharose à 20 % dans le tampon PBS 1X afin de préparer le coussin de saccharose.Ajustez le volume avec du tampon PBS 1X stérile si les tubes sont remplis à moins des 3/4, puis équilibrez-les. Ensuite, faites tourner les échantillons pendant deux heures à 17 degrés Celsius. Puis, versez le surnageant et éliminez le liquide restant en retournant les tubes sur des essuie-tout.Après avoir aspiré les dernières gouttelettes, un culot contenant le virus est à peine visible sous forme d'une tache translucide. Ensuite, resuspendez le culot dans 70 microlitres de PBS 1X en pipetant soigneusement la suspension. Transférez de nouveau la suspension dans un autre tube et mélangez soigneusement afin de dissoudre complètement le culot.Ensuite, rincez le tube avec 50 microlitres supplémentaires de tampon PBS 1X froid et mélangez. Maintenez les échantillons dans une microcentrifugeuse de table et centrifugez à 10 000 g pendant 30 secondes. Après la centrifugation, ajoutez des aliquotes de 10 microlitres du surnageant dans chaque nouveau tube microfuge et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.Revêtez une plaque 96 puits à liaison élevée avec 100 microlitres d'anticorps monoclonal anti-p24 à une dilution de un à 1 500, conformément au programme NIH sur les vaccins contre le SIDA, pour le kit de dosage par capture de l'antigène p24 du VIH-1. Incubez la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez la plaque trois fois avec 200 microlitres de TWEEN-20 à 0,05 % dans du PBS froid.Pour éviter la liaison non spécifique, bloquez la plaque avec 200 microlitres d'albumine sérique bovine à 1 % pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez la plaque trois fois avec 200 microlitres de TWEEN-20 à 0,05 % dans du PBS froid. Puis, préparez les échantillons de vecteur concentrés et non concentrés à une concentration finale de 10 % en diluant le vecteur avec de l'eau doublement distillée et du Triton X-100.Ensuite, préparez les étalons de VIH-1 par dilution sérielle deux fois consécutive, en partant de cinq nanogrammes par millilitre. Après avoir dilué les échantillons viraux concentrés et non concentrés, déposez-les en triplets sur la plaque et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, lavez la plaque, puis ajoutez 100 microlitres d'anticorps polyclonal de lapin anti-p24 dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.Après six lavages, incuber la plaque avec une immunoglobuline de chèvre anti-lapin liée à la peroxydase à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après plusieurs lavages, incuber la plaque avec le substrat de peroxydase TMB à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter de l'acide chlorhydrique normal pour arrêter la réaction. Puis mesurer l'absorbance à 450 nanomètres à l'aide d'un lecteur de plaque à absorbance.Ensemencer les cellules dans une plaque de six puits. Le jour suivant, lorsque les cellules atteignent une confluence de 90 %, transduire avec un virus purifié à une multiplicité d'infection prédéterminée comprise entre un et dix.Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Surveiller les plaques afin de noter les différences des signaux GFP à intervalles réguliers pendant un à sept jours. Rechercher les cellules positives pour la GFP au microscope fluorescent équipé d'un jeu de filtres GFP, avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission respectivement de 470 et 525 nanomètres.Pour différencier la population de cellules positives et négatives pour la GFP, utilisez des cellules non transduites. Un gel d'agarose représentatif montrant le clone d'intégrase muté positif. Le clone doublement digéré avec les enzymes de restriction EcoRV et SPH1, encadré en pointillés rouges, représente le clone d'intégrase muté.Le clone a été ultérieurement séquencé afin de vérifier la mutation de l'acide aspartique en position 64 en acide glutamique. Un histogramme représentatif de l'essai ELISA p24 est présenté, illustrant les titres viraux du vecteur lentiviral dépourvu d'intégrase SP1-CRISPR/Cas9, indiqués par la barre noire, et du vecteur lentiviral SP1-CRISPR/Cas9 compétent pour l'intégration, indiqués par la barre blanche. L'histogramme montre que les titres viraux dépourvus d'intégrase et compétents se situent dans une fourchette allant de un fois 10 à la. Les diagrammes en barres représentent le nombre de copies de particules virales par millilitre.Images fluorescentes représentatives montrant l'intensité fluorescente moyenne des cellules positives pour la GFP sous traitement viral. Les cellules ont été transduites avec des vecteurs lentiviraux compétents pour l'intégration CRISPR ou avec des composants viraux CRISPR vecteurs lentiviraux déficients en intégrase.Une forte réduction du signal GFP a été observée à une multiplicité d'infection de un et de cinq respectivement, après la transduction des composants lentiviraux compétents ou déficients pour l'intégrase, par rapport aux cellules contrôles non transduites. Le principal avantage de cette technique découle de la capacité des vecteurs lentiviraux déficients pour l'intégrase à délivrer de façon transitoire un outil d'édition du génome, ce qui améliore considérablement sa spécificité et sa sécurité. Si elle est correctement réalisée, la mise en œuvre des protocoles devrait prendre une semaine à être complétée.En suivant ce protocole, on doit s'attendre à produire des vecteurs lentiviraux fortement concentrés, dont la concentration se situe entre 10⁹ et 10¹⁰ génomes viraux par mL.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système fournit un outil prometteur pour le génie génétique et ouvre la possibilité d’une intégration ciblée des transgènes. Nous décrivons une fin médiée par homologie rejoindre (HMEJ)-basé de stratégie pour ADN efficace visant l’intégration en vivo et ciblé des thérapies géniques en utilisant CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-médiation ciblée Integration In Vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie

La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Nous décrivons ici un outil d’édition du génome basé sur la stabilisation temporelle et conditionnelle de la protéine 9 (Cas9) associée à la répétition palindromique courte (CRISPR-) groupée régulièrement espacée sous la petite molécule Shield-1. La méthode peut être utilisée pour des cellules cultivées et des modèles animaux.

Une nouvelle boîte à outils pour évaluer les fonctions des gènes à l’aide de la stabilisation cas9 conditionnelle

Le protocole décrit comment générer des myoblastes knock-out à l’aide de CRISPR/Cas9, de la conception des ARN guides au clonage cellulaire et à la caractérisation des clones knock-out.

Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus

À mesure que les protocoles liés à CRISPR deviennent de plus en plus utiles et accessibles, des complications et des obstacles peuvent encore survenir dans des conditions expérimentales spécifiques. Ce protocole décrit la création d’une lignée cellulaire humaine knock-out sérine/thréonine-protéine kinase 1 (RIPK1/RIP1) à l’aide de CRISPR/Cas9 et met en évidence les défis potentiels rencontrés au cours de ce processus.

Génération d’une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l’aide du système CRISPR-Cas9

La méthode présentée décrit la génération d’un gène knock-out médié par CRISPR dans la lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), qui exprime de manière stable des sgRNA ciblant le gène L2HGDH à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace.

Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

Découvrez la production de vecteurs lentiviraux intégrase déficients pour l'édition génique CRISPR/Cas9 dans les cellules en division. Cette méthode optimise la livraison d'outils d'édition génique avec une sécurité accrue.

Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division (Vidéo) | JoVE Journal

Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division

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