Name: Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Découvrez la culture de cellules souches neurales fœtales humaines pour étudier l'infection par le virus Zika. Cette méthode permet d'analyser la survie et la différenciation cellulaires et d'évaluer des stratégies thérapeutiques potentielles.

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Ce travail a été soutenu par des fonds de le S. John Dunn Foundation et l’Institut des infections chez l’homme et de l’immunité de l’University of Texas Medical Branch (P.W.).

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

La capacité de la culture et de manipuler des hNSCs fournit un outil essentiel qui peut être utilisé pour une variété de fins de modélisation des maladies humaines à drogue haut débit préalable10,11,12,14, 15,16,17. Beaucoup de questions restée à traiter comme le cerveau foetal humain comme...

Zika virus (ZIKV) est un flavivirus transmis sexuellement ou par les moustiques Aedes aegypti et Aedes albopictus moustique vecteur. ZIKV a été récemment identifié comme une menace grave de santé publique en raison de sa facilité de transmission et affiliés ainsi qu’avec des symptômes neurologiques1. Un des plus concernant les effets neurologiques est le développement d’une microcéphalie chez les foetus nés de mères infectées enceintes2,3. Microcéphalie est un trouble neurologique du développement où la tête est plus petite que la taille typique pendant le développement du foetus et à la naissance, dont la circonférence est inférieure à 2 écarts-types au-dessous de la moyenne4. Le plus petit tour de tête est généralement accompagné d’une variété de maladies concomitantes telles que les retards de développement, saisies, vision et perte d’audition et difficultés d’alimentation.
Des études récentes ont utilisé des modèles animaux ou induite par les cellules souches pluripotentes pour étudier l’effet de l’infection à ZIKV sur le développement neurologique5,6,7,8. Alors que ces études ont contribué à notre connaissance de ZIKV, l’utilisation d’espèces différentes ou de cellules génétiquement modifiées peuvent être beaucoup de temps et/ou ajouter des variables supplémentaires qui peuvent entraîner l’effet du ZIKV sur le développement neuronal cellules5, 6 , 7 , 8. Toutefois, la difficulté avec la culture de HNS, particulièrement la culture non adhérents Neurosphère décrite dans le présent protocole, est que la culture est très sensible aux méthodes utilisées pour mener la culture9. Tout changement de composants moyens, ou encore la manipulation physique du navire la culture, est suffisant pour déclencher une réaction de la cellules9. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé une culture in vitro humain foetal encéphales cellules souches neurales (hNSCs) pour interroger mécaniquement l’effet du ZIKV sur les cellules souches neuronales foetales. En utilisant notre méthode, hNSCs ont été maintenues pendant plus de 80 passages sans changements phénotypiques apparent10. En outre, des altérations chromosomiques comme la trisomie n’ont aucun ou un minimum de11. Cette culture de HNS se développe comme une culture Neurosphère non adhérents. Un avantage de neurospheres est que les sphères créent une niche environnementale unique dans la culture qui reflète plus en vivo niches par rapport aux cultures deux dimensions9. Un autre avantage de ce protocole est que plusieurs types de cellules peuvent provenir de la culture de la HNS, permettant à un enquêteur d’observer l’impact d’une variable donnée sur HNS survie et la différenciation. Le présent protocole est applicable aux personnes qui cherchent à répondre à des questions mécanistiques concernant le développement du système nerveux central ou un dysfonctionnement. Le protocole suivant décrit comment développer une culture de HNS pour infecter avec ZIKV et par la suite se différencient la hNSCs pour observer l’impact de l’infection sur le processus de différenciation. Il inclut également des méthodes pour stocker hNSCs pour une utilisation à long terme et pour hNSCs se différencient en divers types de neurones qui permettent une investigation des déficits induite par le ZIKV contribuant au cerveau malformation11. Nous croyons que ce protocole est également d’intérêt pour les enquêteurs qui cherchent à comprendre l’impact de tout stimulus environnementaux tels que l’infection ou de toxines sur les cellules souches neurales de survie et la différenciation.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (10 %)</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Corning/cellgro</td><td>25-060-c1</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I4011</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine</td><td>Sigma</td><td>T2036</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Héparine Sigma</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>facteur de croissance des fibroblastes de base</td><td>R& D système</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>facteur de croissance épidermique</td><td>R& Système D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>facteur inhibiteur de la leucémie</td><td>R& Système D</td><td>7734-LF</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine à 2,5 %</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromure (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B-27</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fœtus bovins sérum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco</td><td>Corning/cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin albumine</td><td>Sigma</td><td>A4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>FisherBiotech</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Nestin</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>611659</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Classe III Bêta-tubuline Anticorps (TuJ1)</td><td>Covnce</td><td>MMS-435p</td><td>1:2000 dulution</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>anticorps Millipore</td><td>AB5804</td><td>dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td>dilution 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps ZIKV</td><td>Collection mondiale de référence pour les virus émergents et les arbovirus à l’Université du Texas Medical Branch</td><td></td><td>Dilution 1:2000</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Thermo Forma</td><td>Model# 3110</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>75004221</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte</td> <td>de sécurité biologiqueForma scientific Claas II A/B3</td><td>Modèle# 1284</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur (-80 &deg ; C)</td> <td>Forma scientific,Inc</td><td>modèle# 8516</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (image à contraste de phase)</td> <td>Hp 2230 station de travail</td><td>Produit#NOE25us#Microscope ABA</td><td></td></tr><tr><td>(image épifluorescente)</td>Microscope confocal <td>Nikon Eclipse 80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscope Nikon TE2000-E avec système</td><td></td><td></td> confocal C1si</tr></tbody></table>

zika virus infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Cerveau foetal humain des cellules souches neurales sont un système unique de modèle non génétiquement modifié pour étudier l’impact de divers stimuli sur la neurobiologie du développement humaine. Plutôt que d’utiliser un modèle animal ou cellules pluripotentes induites génétiquement modifiés, des cellules souches neurales humaines constituent un système efficace in vitro pour examiner les effets des traitements, médicaments de l’écran, ou examiner les différences individuelles. Ici, nous fournissons les protocoles détaillés pour les méthodes utilisées pour développer des cellules souches neurales de cerveau foetal humain en culture et médias sans sérum, pour différencier dans divers sous-types neuronales et les astrocytes via des procédures différentes d’amorçage, geler et récupérer ces cellules. En outre, nous décrivons une procédure d’utilisation de cellules souches neurales de cerveau foetal humain pour étudier l’infection par le virus Zika.

HNSCs cultivés dans leur stade prolifératif augmentera comme non adhérents neurospheres (Figure 1). Immédiatement après le passage de la HNS, il y aura beaucoup de cellules individuelles, qui agrègent et commencera à sphères forme dans les prochains jours (Figure 1 a et 1 b). Sphères en bonne santé devraient être environ 1-2 mm de diamètre 9-10 jours suite à un passage (Figure 1). Le...

Cet article décrit les méthodes qui sont utilisés pour étendre le cerveau foetal humain des cellules souches neurales dans la culture, ainsi que comment les différencier en divers sous-types neuronales et les astrocytes, en mettant l’accent sur l’utilisation des cellules souches neurales pour étudier l’infection par le virus Zika.

Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

L'objectif général de cette procédure in vitro est d'observer l'effet de l'infection par le virus Zika sur la survie et la différenciation des cellules souches neurales fœtales humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des cellules souches neurales et des maladies infectieuses, telles que la manière dont l'infection virale influence les réponses immunitaires innées et comment ces modifications affectent la survie et la différenciation des cellules souches neurales. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les cellules utilisées sont humaines et non modifiées génétiquement, ce qui renforce l'applicabilité translationnelle des résultats.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des déficits neurologiques associés au virus Zika, car elle fournit un moyen d'évaluer le mécanisme d'infection et de cribler des thérapeutiques. Après avoir préparé le milieu de culture et ensemencé les cellules souches neurales humaines selon le protocole décrit, sortez de l'incubateur le flacon de cellules à repiquer et placez-le dans la hotte de sécurité biologique, ou BSC. Inclinez doucement le flacon afin de permettre a

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Developmental Biology

Biologie du développement

Source : Contreras, D., et al.. Système de culture cellulaire infectieuse pour le virus Zika et effet prophylactique in vitro des interférons. J. Vis. Exp. (2016)La vidéo montre la détection des intermédiaires d'ARNsd viraux du Zika dans des cellules épithéliales infectées par immunocytochimie. Les cellules infectées sont fixées, puis bloquées avec une solution de blocage. Les anticorps primaire et secondaire sont ajoutés. Les noyaux sont colorés avec un colorant fluorescent. L'ARNsd viral...

Détection des intermédiaires de réplication de l'ARN double brin du virus Zika par immunocytochimie

Cette vidéo montre la méthode permettant de différencier les cellules souches neurales humaines des neurosphères en progéniteurs neuraux et astrocytaires à l’aide d’un traitement enzymatique et d’une culture dans un milieu riche en facteurs de croissance, ce qui conduit finalement à la maturation en cellules progénitrices spécialisées.

Différenciation des cellules souches neurales humaines en progéniteurs neuraux et astrocytaires

Cette vidéo démontre l’établissement d’un modèle in vitro d’infection par le virus Zika dans un cerveau en développement. Les organoïdes cérébraux humains contenant des rosettes de cellules souches, de cellules progénitrices neurales (NPC) et de neurones sont infectés par le virus Zika. Le virus infecte les PNJ et déclenche l’apoptose, perturbant le développement des organoïdes.

Développement d’un modèle in vitro de l’infection par le virus Zika dans les organoïdes cérébraux

Cette vidéo montre une procédure permettant d’infecter des cellules souches neurales fœtales humaines avec le virus Zika. Les cellules infectées peuvent être utilisées pour d’autres études.

Infection par le virus Zika des cellules souches neurales fœtales

virus Zika (ZIKV), un pathogène émergent, est lié à des anomalies du développement fœtal et à la microcéphalie. La mise en place d’un système efficace de culture cellulaire infectieuse est cruciale pour les études sur la réplication du virus Zika ainsi que pour la mise au point de vaccins et de médicaments. Dans cette étude, divers tests virologiques relatifs au virus Zika sont illustrés et discutés.

Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em&gt; In vitro</em&gt; Effet prophylactique des interférons

Ce protocole décrit une technique utilisée pour modéliser l’infection par le virus Zika du cerveau humain en développement. À l’aide de type sauvage ou lignées de cellules de tige machiné, chercheurs peuvent utiliser cette technique pour découvrir les différents mécanismes ou traitements qui peuvent affecter le début infection du cerveau et qui en résulte une microcéphalie chez les embryons de Zika infectées par le virus.

Modélisation d’infection par le Virus de Zika du développement cerveau humain In Vitro à l’aide de cellules souches dérivées cérébrale organoïdes

Nous décrivons ici une méthode pour établir un modèle de Zika Viro-induite microcéphalie chez la souris. Ce protocole inclut des méthodes pour l’inoculation intracérébrale embryonnaire, néonatale et adulte-stade du virus Zika.

Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes

Un protocole pour évaluer les réponses de cellules T spécifiques de l’antigène dans les organes d’immunoprivileged du Ifnar1- / - modèle murin pour l’infection de virus (ZIKV) de Zika est décrite. Cette méthode est essentielle pour étudier les mécanismes cellulaires de la protection et immunopathogenèse des vaccins ZIKV et est également précieuse pour leur évaluation de l’efficacité.

Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris- / -

Les principaux types de cellules adhérentes dérivées du muscle humain sont les cellules myogéniques et les fibroblastes. Ici, les populations cellulaires sont enrichies à l’aide d’un tri cellulaire activé par magnétisme basé sur l’antigène CD56. L’immunomarquage ultérieur avec des anticorps spécifiques et l’utilisation de techniques d’analyse d’images permettent de quantifier les caractéristiques cytoplasmiques et nucléaires dans les cellules individuelles.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Découvrez la culture de cellules souches neurales fœtales humaines pour étudier l'infection par le virus Zika. Cette méthode permet d'analyser la survie et la différenciation cellulaires et d'évaluer des stratégies thérapeutiques potentielles.

Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

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