Name: Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez comment activer les macrophages par le cAMP pour qu'ils sécrètent des facteurs favorisant la croissance des neurites dans des co-cultures avec des neurones DRG. Cette méthode offre un outil précieux pour explorer les mécanismes de régénération neuronale.

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Ce protocole est supporté par une subvention de FRO-2015R1A2A1A01003410 du ministère de la Science, TIC et planification Future, République de Corée.

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par l’utilisation Comité d’Ajou University School of Medicine et un animalier institutionnel.
1. culture préparation du neurone dissociés DRG adulte
<ol><li>Avant la mise en place de la culture, préalablement recouvrir une plaque 6 puits poly-D-lysine et de la laminine. Incuber une plaque 6 puits avec 0,01 % poly-D-lysine à 37° C pendant 2 h ou à 4° C jusqu’au lendemain. Ensuite, laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Incuber la plaque avec la laminine solution à une concentration de 3 µg/mL pendant 2 h à température ambiante et laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée. Sécher la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Euthanasier une souris dans une chambre de2 CO transparente reliée à une bouteille de gaz comprimée CO2 . Inciser la peau recouvrant la colonne vertébrale avec une lame chirurgicale et disséquer les muscles paravertébraux bilatéralement pour exposer l’OS vertébrales. Enlever les os vertébrales méticuleusement à l’aide un rongeur chirurgical de pointe étroite jusqu'à ce que les GHM est entièrement exposés. NOTE : Les neurones adultes DRGs proviennent des souris mâles C57BL6 adultes âgés de 8 semaines à 12 semaines.</li>
	<li>Retirer les DRGs bilatéral de la S1 tout le chemin jusqu’au niveau de la C1 à l’aide de ciseaux iridectomie et pinces à pointe fine sous un microscope à dissection. Essayez de couper les racines entièrement à partir de DRGs afin de minimiser la contamination des cellules de Schwann ou les fibroblastes.</li>
	<li>Stocker les DRGs découpées dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de Dulbecco froid modifié Eagle (DMEM) sur la glace jusqu'à ce que tous les GHM est collectés de 60 mm. Remarque : Il est essentiel de disséquer les DRGs aussi rapidement que possible. La collection des tous les GHM de souris ne devrait pas prendre plue de 30 min. 30 min après l’euthanasie, cesser de collecter les DRGs et procéder à l’étape suivante, même si il sont en restant DRGs.</li>
	<li>Transférer les DRGs à un 1,5 mL tube Eppendorf à l’aide d’un embout de la pipette bleu (1000 µL) avec une extrémité de la ligne de coupure. Enlever le DMEM après un essorage rapide pendant plusieurs secondes en utilisant une centrifugeuse minie. Ajouter 1 mL de DMEM contenant 125 collagénase de XI de type U/mL et incuber le tube pendant 90 min avec une légère rotation (35-40 tr/min) à l’aide d’un agitateur twister dans un incubateur à 37 ° C. Immobiliser le tube sur le plancher de l’agitateur à l’aide de la bande.</li>
	<li>Jetez DMEM contenant collagénase et ajouter 1 mL de DMEM fraîche. Attendez que les DRGs flottants s’enfoncer complètement vers le bas, puis retirez le DMEM avec les débris tissulaires. Répétez cette étape de lavage au moins six fois. Remarque : Ne pas tenter d’éliminer le liquide surnageant complètement. Veillez à ne pas supprimer n’importe quel DRGs avec le surnageant DMEM.</li>
	<li>Transférer les DRGs dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’un embout de la pipette bleu (1000 µL) avec une extrémité de la ligne de coupure. Pipetter puis monte et descend doucement au moins 15 fois à l’aide d’une pointe de bleue (1000 µL) pour produire une suspension cellulaire homogène. Éviter de faire des bulles et essayez de ne pas toucher le fond du tube à fond conique avec un embout de la pipette.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 239 x g pendant 3 min et éliminer délicatement le surnageant avec bris flottants. Ajouter 1 mL de Neurobasal additionné de B27 (2,0 % v/v) et Resuspendre le culot cellulaire en pipettant également doucement et descendre de 5 à 10 fois.</li>
	<li>Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 70 µm placée au-dessus d’un tube conique de 50 mL. Attendez 2 min et puis versez moyenne Neurobasal/B-27 sur la crépine à l’aide d’un pipeteur.</li>
	<li>Plaque de tous les neurones prélevés DRG (un total d’environ 2 x 106 neurones DRG d’une souris) sur deux puits de la plaque 6 puits. Les neurones d’une souris adulte DRG couvrent deux puits dans une plaque 6 puits. Puis placer la plaque dans un incubateur à CO2 à 37 ° C jusqu'à ce que les macrophages des cultures.</li>
</ol>2. la co-culture de P primaires des Macrophages péritonéaux sur Culture de cellules A Insérer
Remarque : Établir les cultures co 4 h après le placage initial des neurones dissociés DRG
<ol><li>Les macrophages péritonéaux primaires sont préparés à partir de souris mâles C57BL6 adultes âgés de 8 semaines à 12 semaines. Euthanasier un animal dans une chambre de CO2 . Inciser la peau abdominale délicatement, exposer le péritoine et éviter de couper le péritoine pour empêcher une fuite de liquide de lavage.</li>
	<li>Perforation du péritoine à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 22G et injecter 10 mL de glacee tampon phosphate salin (PBS) dans la cavité péritonéale. Massez délicatement le péritoine pendant 1-2 min. Ensuite, retirer l’aiguille et faire sortir les PBS à travers le site de ponction de l’aiguille et recueillir le liquide de lavage dans un tube conique de 50 mL. Remarque : Avant utilisation, placer la seringue sur la glace pour maintenir la froideur de la PBS.</li>
	<li>Centrifuger le liquide de lavage à 239 x g pendant 10 min à 4 ° C pour granuler les composants cellulaires. Resuspendre le culot avec 3 mL du tampon de lyse des globules rouges (RBC) pendant 3 min à température ambiante. Centrifuger la suspension cellulaire à nouveau à 239 x g pendant 10 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec 3 mL de PBS et centrifuger la suspension cellulaire à nouveau pour enlever n’importe quel tampon de lyse RBC restante. Remarque : Assurez-vous que le tampon de lyse RBC est totalement supprimé. Dans le cas contraire tampon de lyse RBC restant peut-être être toxique pour les macrophages en culture.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules boulettes dans 1 mL de milieu Neurobasal/B-27. Plaque de la moitié de tous les macrophages prélevés (un total de 3 × 106 6 x 106 cellules) sur un insert de culture cellulaire avec la surface équivalente de 4,2 cm2, qui est placé sur le puits de DRG dissociée. Remarque : Au cours de la période de culture mixte, macrophages sont cultivées dans un milieu de culture pour le neurone Neurobasal/B-27. Survie adéquate des macrophages sous cette condition a été confirmée.</li>
</ol>3. traitement des Db-Camp et Collection de Macrophage CM
NOTE : Commencer le traitement de db-cAMP 4 h après les co-cultures neuron-macrophage.
<ol><li>Ajouter 2 µL de solution de db-cAMP de 100 µM aux co-cultures neuron-macrophage. Ajouter le même volume de PBS pour une expérience de contrôle.</li>
	<li>Après 24h, remplir un puits vide avec 1 mL de milieu de culture de macrophage dans la même plaque 6 puits. Transférer l’insert de culture cellulaire dans les cultures co neuron-macrophage dans le puits vide avec milieu de culture de macrophage. Garder les cellules dans les mêmes conditions pendant 72 h sans changer le support. Remarque : Nous ajoutons seulement 1 mL de milieu de culture de macrophage pendant CM collection faire concentré CM. Lors de la collecte de CM, si nécessaire, nous avons ajouté plus d’efforts pour couvrir complètement les macrophages dans l’insert.</li>
	<li>Après 72 h, centrifuger le macrophage CM à 239 x g pendant 5 min supprimer les composants cellulaires. Passez le liquide surnageant à travers un filtre de 0,2 µm pour éliminer les débris cellulaires restants. Conserver le CM recueillie à-70 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>4. la croissance des neurites dosage avec CM recueillie
<ol><li>Avant de fonder une culture distincte de neurone DRG adulte, pré enduire une lame de 8 puits chambre suivant la même procédure décrite en 1.1 et 1.2.</li>
	<li>Obtenir les neurones adultes dissociés de DRG dans Neurobasal additionné de B27 utilisant les mêmes méthodes décrits de 1.3 à 1.10. Plaque de 5 x 104 cellules / puits sur le toboggan de la chambre de 8 puits revêtus.</li>
	<li>Placez la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 h, permettant aux cellules d’attacher au fond. Ensuite, remplacez le milieu de culture avec la dégelée CM qui est préalablement chauffé à 37 ° C. Remarque : Veillez à ne pas toucher le fond de la diapositive 8 puits chambre lors du retrait du milieu de culture et en ajoutant le CM recueillie.</li>
	<li>15 h après les ensemencements initiaux, retirez le support et laver les cellules avec du PBS une fois. Ensuite, ajouter 200 µL de solution de paraformaldéhyde glacée 4 % dans les puits et incuber les cellules avec la solution de paraformaldéhyde pendant 20 min à 4 ° C Remarque : La culture de neurone DRG pour l’analyse de l’excroissance des neurites doit être précisément limitée à 15 h. Dans ces conditions, il n’y a aucun neurites appréciable.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS glacée et puis exécutez bloquant avec 10 % sérum de chèvre normal (NGS) avec 0,1 % Triton-X pour 30 min. Incuber les cellules fixes avec la solution d’anticorps primaire (anti-Tuj-1) diluée avec 10 % NGS (à une concentration de 1 µg/mL) pendant 4 h à la salle température ou toute une nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS et puis incuber les cellules avec solution (chèvre-anti souris) anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, laver deux fois avec du PBS et monter la lame de la culture avec une lamelle couvre-objet (24 × 50 mm) à l’aide de la solution de montage.</li>
	<li>Prendre des photos à l’aide d’un microscope à fluorescence pour visualiser des neurites.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il y a plusieurs étapes cruciales pour la génération de ce système de culture mixte. Il est important de s’assurer que les neurones de souris DRG et macrophages péritonéaux sont préparés frais et sain. Nous avons vécu activité l’excroissance des neurites diminuée du CM lors de la dissection des tous les GHM a pris plus de 30 min. En outre, la contamination de produits sanguins labiles dans les macrophages péritonéaux a également conduit à une diminution de l’activité de l’excroissance des neurites dans le CM. Afin de sus...

Diverses études ont cherché à améliorer la régénération axonale CNS après les blessures de la moelle épinière ou du cerveau. Des réactions inflammatoires, inévitablement accompagnant les lésions du système nerveux, sont traditionnellement perçues comme de participer à des processus pathologiques secondaires menant à des résultats néfastes1,2. En effet, la méthylprednisolone qui peut supprimer les réactions inflammatoires est le seul traitement approuvé pour médullaires graves blessures3. Toutefois, des études plus récentes ont fourni des preuves que les macrophages, un type de cellules inflammatoires représentative, peuvent participer à la régénération ou la réparation du système nerveux lésé4,5,6. Par exemple, infiltration de macrophages suite à une lentille blessure produits pro-régénérative des molécules pour favoriser la régénération des neurones ganglionnaires rétiniennes7,8. En outre, les neurones transplantés de DRG a augmenté la croissance axonale jusqu'à la région où les macrophages activés par zymosan9. En outre, les macrophages à l’emplacement de la lésion peuvent créer un milieu de croissance-permissive pour les nerfs périphériques blessé10.
Notre travail a également fourni des preuves solides que les macrophages peuvent contribuer à la capacité de régénération des axones des neurones adjacents. Nous avons montré que l’activation des macrophages dans les ganglions de la racine dorsale (GRD) ont été essentiels dans la capacité de régénération améliorée des DRG neurones sensoriels, suite à un périphérique de préconditionnement nerf blessures11. Un autre laboratoire12a été signalée indépendamment des recherches similaires. Nous avons également montré que l’injection intraganglionic de dibutyryl AMP cyclique (AMPc-db), qui est une molécule connue pour renforcer la capacité de régénération axonale13, induit l’activation des macrophages. La désactivation des macrophages aboli les effets du db-cAMP sur l’activité de l’excroissance des neurites. Les œuvres ultérieures identifiées expression induite par la blessure de CCL2 dans les neurones comme un signal pour stimuler des macrophages avec un phénotype pro-régénérative14,15.
Basé sur les résultats expérimentaux ci-dessus, nous avons établi un modèle in vitro ressemblant à des événements moléculaires qui interviennent dans les DRGs suite à une blessure préconditionnement modèle11,14. Dans ce modèle, db-cAMP est appliquée aux cultures neuron-macrophage co suscitant intercellulaires de signalisation qui aboutit à l’activation des macrophages avec un phénotype pro-régénérative. Nous décrivons ici les protocoles détaillés par lequel nous pouvons produire des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires qui favorisent la croissance neuritique (Figure 1). Ce modèle expérimental illustre un concept que macrophages peuvent être stimulées ou amenés à soutenir la régénération axonale après les blessures du système nerveux. Notre modèle sera également utile dans l’étude des mécanismes de signalisation intercellulaire qui aboutit à l’activation des macrophages pro-régénérative.

<table><tbody><tr><td>Insert de culture cellulaire membrane PET transparente 0.4&mu ; m taille des pores</td><td>Corning, Falcon</td><td>353090</td><td>Membrane PET transparente avec 0,4-&mu ; taille des pores M, pour plaque à 6 puits</td></tr><tr><td>70-&mu ; m passoire à cellules en nylon</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Lame de culture à 8 puits</td><td>Biocoat</td><td>354632</td><td>avec une application uniforme de Poly-D-Lysine Tampon de</td></tr><tr><td>lyse des globules rouges</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticumSigma-Aldrich</td><td></td> <td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Contenant 1 % de glutamax et 1 % de supplément de péniciline-streptomycine</td></tr><tr><td>B-27, sans sérum</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>solution extracellulaire</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine Bromhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 3', 5'-monophosphate cyclique, N6,O2'-dibutyryl-, sel de sodium</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10 % Normal Sérum de chèvre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti &beta ; III tubuline (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Anticorps monoclonal de souris</td></tr><tr><td>Anticorps anti-IgG (H+L) de souris Anticorps secondaires</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire CO2 Panasonic</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td> <td>de dissectionCarl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur torsadé</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sérum de veau fœtal)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>Acier inoxydable, 14cm, incurvé, action unique</td></tr><tr><td>Ciseaux fins - Carbure de tungstène & ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #7</td> tranchante et dentelée <td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0,07 x 0,04 mm, incurvée</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>15000-00</td><td>droite, 3mm tranchante,</td></tr><tr><td>tranchante Qualitron DW-41 Micro-centrifugeuse</td><td>Artisan Technology Group</td><td>DW-41</td><td>Tension d’entrée : 115VAC</td></tr></tbody></table>

neurone-macrophage co-cultures d’activer les macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Il y a des preuves solides que les macrophages peuvent participer à la régénération ou la réparation des blessés du système nerveux. Nous décrivons ici un protocole dans lequel les macrophages sont induites au moyen de produits conditionnés (CM) qui favorise la croissance des neurites. Neurones ganglionnaires (DRG) adulte de la racine dorsale sont parfaitement dissociées et plaqués. Après que les neurones sont solidement attachés, les macrophages péritonéaux sont conjointement cultivées sur un insert de culture cellulaire superposé sur le même bien. Dibutyryl QU'AMP cyclique (AMPc-db) est appliquée aux cultures co pendant 24 h, après quoi la culture cellulaire insert contenant les macrophages est déplacé vers un autre puits pour recueillir des CM pendant 72 h. Le CM des cultures co traités avec db-cAMP, lorsqu’il est appliqué à une culture de neurone DRG adulte séparée, présente une activité l’excroissance des neurites robuste. Le CM obtenu à partir des cultures traitées db-cAMP constitué de cellules du même type seul, neurone DRG ou macrophages péritonéaux, ne montrent pas d’activité de l’excroissance des neurites. Cela indique que l’interaction entre les neurones et les macrophages est indispensable pour l’activation des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec activité l’excroissance des neurites en CM. Ainsi, notre paradigme de co-culture sera aussi utile pour étudier la signalisation intercellulaire dans les interactions neurone-macrophage pour stimuler les macrophages à être doté d’un phénotype pro-régénérative.

Les auteurs décrivent un protocole qui peut générer des macrophages capables de sécréter des facteurs moléculaires avec l’activité de l’excroissance des neurites. Le macrophage CM obtenu à partir des co-cultures traités avec db-cAMP a entraîné la croissance des neurites robuste lorsqu’elle est appliquée à une culture distincte du neurone DRG (Figure 2 a). En comparaison, CM obtenu à partir des co-cultures imprégnées de PBS n’induit pas la croissance des neuri...

Le protocole actuel présente des procédures expérimentales afin de stimuler les macrophages à être doté d’une capacité de libérer les facteurs moléculaires qui favorisent la croissance des neurites. Traitement du cAMP aux cultures neuron-macrophage co induit les macrophages pour produire un milieu conditionné qui possède une activité l’excroissance des neurites forte.

Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des macrophages capables de sécréter des facteurs moléculaires favorisant la croissance des neurites. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les neurones et les macrophages interagissent les uns avec les autres pour activer le phénotype macrophagique pro-régénérateur afin de favoriser une excellente régénération. Le principal avantage de cette technique est que nous utilisons l’AMP cyclique, une molécule sérique d’adénosine, qui est une enzyme beaucoup plus physiologique utilisée dans des études précédentes pour stimuler les macrophages avec le phénotype pro-régénératif.Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons découvert que l’activation des macrophages est essentielle à l’amélioration de la capacité de croissance des axions et que ceux-ci peuvent produire d’excellents neurones après précaution en cas de lésion permanente du lobe. Avant de mettre en place la culture, précodez une plaque à six puits avec de la lycine poly-D et de la laminine. Ensuite, incubez la plaque à six puits avec 0,01 poly-D Lycine à 37 degrés Celsius pendant deux heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Après cela, lavez la plaque deux fois avec de l’eau distillée. Ensuite, incubez la plaque avec une solution de laminine à une concentration de trois microgrammes par millilitre pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, lavez la plaque deux fois à l’eau distillée et séchez-la à température ambiante pendant au moins une heure.Maintenant, incisez la peau recouvrant la colonne vertébrale d’une souris euthanasiée avec une lame chirurgicale et disséquez la paire de muscles vertébraux bilatéralement pour exposer les os vertébraux. Retirez méticuleusement les os vertébraux à l’aide d’un rongeur chirurgical à bout étroit jusqu’à ce que les DRG soient complètement exposés. Sous un microscope à dissection, retirez le DRG bilatéralement de S1 jusqu’au niveau C1 à l’aide de ciseaux d’iridectomie et d’une pince à pointe fine.Transférez le DRG dans un tube eppendorf de 1,5 millilitre à l’aide d’une pointe de pipette bleue avec une extrémité coupée. Retirez ensuite le DMEM après un essorage rapide de plusieurs secondes à l’aide d’une minicentrifugeuse. Ajoutez un millilitre de DMEM contenant 125 unités par millilitre de collagène de type 11 et incubez le tube pendant 90 minutes avec une rotation douce à l’aide d’un agitateur twister à 37 degrés Celsius.Ensuite, jetez la collagénase contenant du DMEM et ajoutez un millilitre de DMEM frais. Transférez le DRG dans un tube conique de 15 millilitres à l’aide d’une pointe de pipette bleue avec une extrémité coupée. Ensuite, pipetez doucement de haut en bas au moins 15 fois pour obtenir une suspension cellulaire homogène.Centrifugez le tube à 239 G pendant trois minutes et jetez soigneusement le surnageant avec les débris flottants. Ajoutez un millilitre de milieu de neurobasilic complété par de la vitamine B27 et remettez en suspension la pastille cellulaire en pipetant doucement de haut en bas cinq à dix fois. Ensuite, passez la suspension de la cellule à travers une crépine de cellule de 70 micromètres superposée sur un tube conique de 50 millilitres.Ensuite, placez tous les neurones DRG collectés sur deux puits de la plaque à six puits. Pour préparer les macrophages péritonéaux primaires d’une souris adulte, incisez délicatement la peau abdominale pour exposer le péritoine et évitez de couper le péritoine pour éviter une fuite de liquide de lavage. Ensuite, percez le péritoine à l’aide d’une seringue avec une aiguille de calibre 22 et injectez 10 millilitres de PBS glacé dans la cavité péritonéale.Massez doucement le péritoine pendant une à deux minutes. Ensuite, retirez l’aiguille et pressez le PBS à travers le site de ponction de l’aiguille et recueillez le liquide de lavage dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez le liquide de lavage à 239 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les composants cellulaires.Ensuite, remettez la pastille en suspension avec trois millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez à nouveau la suspension cellulaire à 239 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Remettez en suspension les cellules granulées dans un millilitre de milieu de neurobasilic B27.Placez la moitié de tous les macrophages collectés sur un insert de culture cellulaire d’une surface efficace de 4,2 centimètres carrés, qui est placé au-dessus du puits de DRG dissocié. Quatre heures après que les macrophages neuronaux aient été co-cultivés, ajoutez deux microlitres de solution d’ampli cyclique DB de 100 micromolaires aux co-cultures de macrophages neuronaux. Après 24 heures, remplissez un puits vide avec un millilitre de milieu de culture de macrophages dans la même plaque à six puits.Transférez l’insert de culture cellulaire dans la co-culture de macrophages neuronaux dans le puits vide avec le milieu de culture de macrophages. Après 72 heures, centrifugez le milieu conditionné aux macrophages à 239 fois g pendant cinq minutes pour éliminer les composants cellulaires. Passez le surnageant à travers un filtre de 0,2 micromètre pour éliminer tous les débris cellulaires restants.Dans cette procédure, pré-enduire une lame à huit chambres de lycine poly-D et de laminine. Ensuite, obtenez les neurones DRG adultes dissociés et le milieu de neurobasilic, complété par B27 en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites précédemment. Plaquez cinq fois 10 aux quatre cellules par puits sur une lame de chambre pré-enduite de huit puits.Ensuite, placez la lame de chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures, ce qui permet aux cellules de se fixer au fond. Remplacez ensuite le milieu de culture par le milieu décongelé et conditionné qui est préchauffé à 37 degrés Celsius. 15 heures après le placage initial, retirez le milieu et lavez une fois les cellules avec du PBS, puis ajoutez 200 microlitres de solution de paraformaldéhyde glacée à 4 % dans les puits et incubez les cellules avec la solution de paraformaldéhyde pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Par la suite, incubez les cellules fixées avec une solution d’anticorps primaires diluée avec 10 % de sérum de chèvre normal pendant quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, prenez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence pour visualiser l’excroissance des neurites. Le milieu conditionné aux macrophages obtenu à partir des co-cultures traitées avec l’AMP cyclique DB a entraîné une excroissance robuste des neurites lorsqu’il est appliqué à une culture de neurones DRG distincte.En comparaison, le milieu conditionné obtenu à partir des co-cultures traitées au PBS n’a pas induit de croissance de neurites. Lorsque l’AMP cyclique DB est traitée à la culture avec des macrophages seuls, le milieu conditionné n’a pas été efficace pour soutenir la croissance des neurites. Cela suggère que l’interaction neurone-macrophage est indispensable pour stimuler les macrophages à être dotés d’une capacité pro-régénérative.Nous avons également testé le milieu conditionné obtenu à partir d’une culture de neurones uniquement traitée par DB Cyclic AMP et n’avons trouvé aucune excroissance de neurite. Il est important de se rappeler que les neurones et les microplaques doivent être préparés frais et sains. Nous avons constaté une diminution de l’activité de croissance des neurites du milieu constant lorsque la dissection durait trop longtemps ou que les macrophages du péritoine étaient contaminés par des composants sanguins.Dans ce protocole, les neurones DRG dissociés ont été séparés fiscalement des macrophages sur l’insert de culture cellulaire. Par conséquent, notre système de co-culture permettra d’identifier les facteurs cellulaires responsables de la signalisation intercellulaire qui médient l’activation de macrophages entièrement régénératifs.

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Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.

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Découvrez comment activer les macrophages par le cAMP pour qu'ils sécrètent des facteurs favorisant la croissance des neurites dans des co-cultures avec des neurones DRG. Cette méthode offre un outil précieux pour explorer les mécanismes de régénération neuronale.

Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites

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